▷ 《实用免疫细胞与核酸》

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前言免疫细胞化学 (Immunocytochemistry) 又称免疫组织化学 (Immunohistochemistry) 是组织化学的分支, 它是用标记的特异性抗体 (或抗原) 对组织内抗原 (或抗体) 的分布进行细胞和组织原位的检测技术。Coons 及其同事们于 1941 年首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌获得成功，开创了细胞化学中“免疫细胞化学”这一新篇章。免疫细胞化学的迅猛发展是在近 10 余年。继 Nakan 建立的酶标记抗体技术后，Sternberger 在此基础上改良并建立了辣根过氧化物酶 - 抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到日益广泛的应用。80 年代，Hsu 等建立了抗生物素 - 生物素（ABC）法之后，免疫金 - 银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世，使免疫细胞化学技术成为当今生物医学中形态、功能、代谢综合研究的一项有力工具，近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是单克隆抗体技术的引入，使免疫细胞化学在生物基础研究如病理学、神经科学、发育生物学、细胞生物学和微生物、寄生虫、病毒等病原体的诊断和研究中日益显示出巨大的实用价值，并使实验向临床，向定量和分子水平深入。鉴于免疫细胞化学的发展极为迅速，我们在原编写的“实用免疫细胞化学”一书的基础上汇入了免疫细胞化学国内外最新进展并增编核酸分子杂交技术。希望本书能有益于我国生命科学的研究，并能给读者新的信息和启示。

本书以理论与开发技术相结合，实用为主，尽力兼顾技术方法的先进性和科学性，全书正文廿三章 及附录 1～4，计约 84 万字，105 幅插图。第一章 为总论，简述免疫细胞化学的发展概况、有关基础理论和技术。第二章 叙述了抗原和抗体的制备。第三至八章 分别详述了免疫荧光细胞化学、免疫酶细胞化学、免疫金、银和铁标记细胞化学、亲和免疫细胞化学。电子显微镜免疫细胞化学和蛋白质及多肽激素的放射免疫测定步骤、原位投射自显影技术等第十一至十七章 分别介绍免疫细胞化学在神经科学、肿瘤病学、消化器官、皮肤病学、自身免疫性疾病和病原体的快速检查方法及应用。

近 10 多年来，相继发现了多种亲合物质，如植物凝集素（lectins）与糖结合物（glycol conju-gates）、葡萄球菌 A 蛋白（staphylococal protein A）与 IgG、生物素（biotin）与卵白素（亲合素）（A-vidin）、激素、脂质与受体等。这些物质是一些有多价结合能力的物质，不但亲和物质之间有高度亲合力，而且可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白等相结合。Bayer（1976）将这种利用两种物质之间的高度亲合力而相互结合的化学反应，进行细胞化学检测，称为亲合细胞化学（affinity cytochemistry）。它和免疫细胞化学的区别是亲合物质之间的结合不是抗原和抗体反应。然而抗原和抗体反应也是一种物质间的亲合反应，是一种特殊的亲合细胞化学。由于引入亲合细胞化学，提高和增加了免疫细胞化学的敏感性和检测范围，是免疫细胞化学的新发展，本书第六章 予详述。

原位分子杂交（In situ hybridization）技术引入免疫细胞化学，是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展的重要标志。近年来，分子杂交与免疫细胞化学的结合日益紧密，尤其是在杂交后信号的检测技术中，引入了免疫细胞化学的免疫放大和显色技术，已经形成了杂交免疫细胞化学或称原位杂交免疫细胞化学（In situ hybridizationimmunocytochemistry），成为免疫细胞化学中又一新的分支。分子杂交与免疫细胞化学的结合，形成了在细胞、亚细胞和分子水平同时检测基因及其表达产物的完整体系，把基因探针（基因工程）和单克隆抗体技术结合起来，成为当代生物科学和医学在分子水平研究和诊断的新兴技术。尤其是近年来与 PCR 技术结合的原位 PCR 技术和原位免疫 PCR 技术敏感性很高。本书第十八至二十三章 对有关分子生物学基础理论、核酸分子探针制备、原位分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、核酸分子杂交电镜技术、杂交与免疫细胞化学双标记技术、分子杂交的 FISH 技术和 PRINS 技术及其在染色体制片的应用和分子杂交基因诊断的应用等方面，由有关专家分别作出了专章 叙述。

定量免疫细胞化学技术是这个领域发展很快的一个方面，由于流式细胞仪，激光共聚焦显微仪和图像分析仪在免疫细胞化学中的应用，使免疫细胞化学的定量检测成为可能，从而提高了免疫细胞化学的定量水平。本书第九和十章 作了详细叙述。

本书附录列有一些常用的试剂配制方法，以便实际应用时参考。

由于本书编者都具有实际操作和应用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术的经验，对某些方法的操作技术多结合编者的经验和在国内条件下应用的体会加以叙述，实用性强，能指导操作和启发读者如何应用。本书既有基础理论又有本领域国内外最新进展，对生物科学，尤其对医学科学工作者具有重要的参考价值，又可作为研究生、进修生的教材。

本书编写过程中，得到第三、四军医大学领导及广大同行的鼓励和支持；第三军医大学学报编辑室及张吉强、孙榆等同志在协助本书的出版、校对和抄写等方面做了大量的工作，在此深表感谢。

本书中难免有不当多处，恳切希望读者批评指正。

第一章 总论免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体的组织、细胞内将其用免疫细胞化学手段检出和研究。

免疫细胞化学的突出优点是：

1. 高度特异性 抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的识别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学难以相比的。

2. 敏感性高 现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性，或采用各种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原成分，用显微镜或电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。

3．方法步骤统一 若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。

4．形态、机能和代谢密切结合 是一种综合定性、定位和定量密切结合；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的，它以在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。

免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发展。尤其是和分子生物学的理论和技术日益结合密切，基因探针、核酸分子杂交技术、原位 PCR 技术、核酸杂交和免疫细胞化学双标记技术、电镜杂交技术等成为免疫细胞化学技术的新发展成员，标志着免疫细胞化学又进入一个新的发展阶段。核酸分子探针 - 杂交 - 免疫细胞化学放大和显示杂交信号，可以称为杂交免疫细胞化学。所以，核酸分子探针的研制已成为免疫细胞化学实验室中必需的试剂生产技术，需要学习引进分子生物学的有关技术和设备，建立相应的基因工程实验条件，把基因重组技术、单克隆抗体技术和免疫细胞化学技术融合在一起，就形成了现代免疫细胞化学的新主体。更高倍电镜技术和图像分析，流式细胞仪技术和激光共聚焦显微技术和不断更新，把原位定性、定位和定量技术提高到了更新的水平，形成了免疫细胞化学发展的两翼，向着生命科学更广阔领域飞翔。

免疫细胞化学的全过程包括：①抗原提取和纯化；②免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）；③抗体效价检测和提取；④标记抗体；⑤细胞和组织切片标志的制备；⑥免疫细胞化学反应和显色；⑦观察和记录结果。

由此可见，免疫细化学的基本理论是抗原抗体反应，标记化学反应和呈色化学反应。由于免疫细胞化学和原位核酸分子杂交是在细胞和组织上进行抗原抗体反应，所以，必须熟练掌握显微标本制备的全过程，要求待检标本形态结构和抗原性保存良好，抗原不从原位扩散或丢失。所以从事免疫细胞化学的工作者必须了解以下有关理论及掌握有关细胞和组织学技术。

第一节 有关的免疫学理论（缺）第二节 免疫细胞化学的有关技术概述根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白技术，免疫金 - 银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术，免疫电子显微镜技术等。近些年来，核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗休的制备，组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。

一、抗体的制备和配制（一）抗体的制备

这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体，这将在本书第二章 中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，能够自制较好。

（二）抗体的配制

包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。

1．抗体贮存获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每 10μl 或 100μl/ 支分装入安瓿或 0.25ml 带盖塑料管中，密封。放入 -20。C~40。C 冰箱中保存备用，一般可保存 1~2 年。小量分装的抗体可 1 次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在 4。C 可存入 1~3 天，超过 7 天效价显著降低。

2．抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用的各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。

（1）抗体最佳稀释度的测定方法：用已知阳性抗原切片，进行免疫染色，将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示，可分为 ++++、+++、++、+、（-）。++++ 为最强阳性，+++ 为强阳性，++ 为较强阳性，+ 为弱阳性，（-）为阴性。

①直接测定法：用于测定第一抗体的最佳稀释度，其它条件稳定可靠。将一抗稀释为 1：50、1：100、1：2001：400、1：500 等 5 个稀释度滴加在阳性抗原切片上，同时设一替代和阴性对照，结果如表 1 -1：

表 1-1 选择最佳稀释抗血清方法

一抗稀释度特异性染色强度非特异性背景染色度1：50++++++1：100++++++1：200++++++1：400++++1：500++（-）阴性对照（-）（-）从表中结果可见，第一抗体稀释到 1：400 时阳性结果呈强阳性，背景染色减少，其最佳稀释度在 1：400~500 之间。再作 1：420、1：440、1：460、1：480、1：500 稀释后染色，找出最佳稀释度。

②棋盘（方阵）测定方法：当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时，必须采用此法（见表 1 -2）。

表 1 -2 两种以上抗体最佳配合稀释度选择表

第二抗体第 一 抗 体1：5001：10001:20001：40001：100++++（++）++++（+）+++（±）+（-）1：200++++（+）+++（-）++（-）++（-）1：400++（-）+（-）––括号内为背景染色结果

从表中可见第一抗体 1：1000，第二抗体 1：2000 接近最佳稀释度，再将一 抗体作 1：600、1：700、1：800、1：900 和 1：1000 稀释，即可找出最佳稀释度。

（2）抗体稀释液的配制：常用 0.01mol/l pH7.4PBS 或 TBS 缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织上的非特异性吸附：取 0.05mol/l pH7.4 TBS100ml，加温到 60。C，再加入优质明胶 100mg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入 1g 牛血清白蛋白，加入 NaN3200mg 溶解后，过滤，分装，4。C 保存。

抗体的最佳稀释度由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。

二、组织材料的处理组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏（下节 详述）。

三、免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：①标记抗体与标本中抗原反应结合；②用 PBS 洗去未结合的成分；③直接观察结果（免疫荧光直接法）；或显色后再用显微镜观察（免疫酶直接法）。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法，将在本书各有关章 节 内详述。

在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：

1．增强特异性染色的方法

（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶（pronase）等；也可用 3mol/ L 尿素处理切片，达到酶消化的目的。各种酶的配制和使用方法详见附录。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶的活性通过预试验确定，消化的时间还与组织固定的时间有关，一般是陈旧固定组织所需时间长，以 37。C 为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织，易使切片脱落，应使用切片粘附剂，消化时间尽量缩短。

（2）合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原，而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应（Prozone effect）。因此，必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键, 应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应, 减少或消除其中交叉抗体反应。

（3）温育时间：大部分抗体温育时间为 30-60min，必要时可 4。C 过夜（约 18h）。温育的温度常用 37。C，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37。C 可增强抗原抗体反应；适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。

（4）多层染色法：对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP 和 ABC 法（三层）、四或五层 PAP 法或 ABC 法，或 PAP 和 ABC 联合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。

（5）显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度 4 倍。

2．减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%-5% 牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用 0.01% 伊文氏兰 (PBS 溶液) 稀释荧光抗体, 对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入 0.85%~1%NaCl 成为高盐溶液, 充分洗涤切片, 能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。

3．显色反应的控制 免疫酶染色应注意控制：①成色质浓度和温育时间可调节，增加成色质的量和 / 或增加底物温育时间，可增加反应产物强度。着色太深可减少温育反应时间。②过氧化物酶显色时，H2O2 较大浓度将使显色反应过快而致背景加深；过量 H2O2 可能抑制酶的活性。

4．复染 根据所用的染色方法和呈显颜色等，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用 1%～2% 甲基绿复染。

四、对照其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：①阳性对照；②阴性对照；③阻断试验；④替代对照；⑤空白对照；⑥自身对照；⑦吸收试验。

（一）阳性对照

用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。

（二）阴性对照

用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。对照的具体方法步骤，在有关章 节 详述。

五、免疫细胞化学结果的判断对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用 PAP 法阳性，可再用 ABC 法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。

（一）阳性细胞的染色特征

免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

（1）阳性细胞染色分布有三种类型：①胞浆；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。

（2）阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。

（3）由于细胞内含抗原量的不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。

（4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。

（5）切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。

（二）染色失败的几种原因

（1）所染的全部切片均为阴性结果：包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：①染色未严格按操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；④底物中所加 H2O2 量少或失效；⑤复染或脱水剂使用不当。

（2）所有切片均呈弱阳性反应：①切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了；②缓冲液配制中未加氯化钠和 pH 值不准确，洗涤不彻底；③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长；④抗体温育的时间过长；⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快；⑥粘附剂太厚。

（3）所有切片背景过深；①未用酶消化处理切片；②切片或涂片过厚；③漂洗不够；④底物呈色反应过久；⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血；⑥使用全血清抗体稀释不够。

（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。

对于阳性结果的定量判断常规方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、++、+++ 等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，本书第九章 将详细叙述这种使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另外，第十章 将详细途述另一种先进的免疫细胞化学计量分类术-流式细胞光度计技术。

第三节 有关细胞和组织学技术一、细胞和组织免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。

（一）细胞标本的取材

目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA 应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。McAb 应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研究均起到了积极作用。

细胞标本的取材有以下 3 种方法:

1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上，立即浸入细胞固定液内 5 -10min，取出后自然干燥，低温保存备用。

优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。

2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸取病变区内液体成分，如穿刺液较少，可直接涂抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有 1 -2ml Hanks 液（RPMi 1640 液）的试管内，轻轻搅拌，以 500rpm 低速离心 5 -10min 后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约 2×106 细胞 /ml），吸取 1 滴于载玻片上，轻轻涂抹，待涂片略干即可固定。

该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补这一缺点，但操作复杂，细胞常常发生变形。

3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不宜加固定液。根据标本内细胞数量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自然沉淀，然后吸取 5ml 左右沉淀液，以 1500rpm 离心 10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。

如用细胞离心涂片器(Cytospin)，可将标本用上述离心沉淀法制成 2×106 细胞 /ml 的细胞悬液，吸取 50μl 加入涂片器内，离心后即制成分布均匀的细胞涂片，细胞分布在直径约 6mm 的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约 105 个(Danos,1976)。

培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细胞、粘液癌细胞等，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。

制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，在制备涂片前载玻片上应涂粘附剂。②为节 省试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径 0.6-1.0cm 的圆圈内，细胞总数以 105 个为宜。③粘液丰富的标本，如痰液，胃液等，未经特殊处理，一般不宜作免疫组化标记。

（二）组织标本的取材

组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡 2h 以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如 HBsAg、HBcAg 等在尸检标本中，抗原显示仍较好。

组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。

为充分保存组织的抗原性，标本离体后庆立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或 -70。C 冰箱内备用。

二、细胞和组织的固定（一）固定

为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。

不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大。如 T 淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。而 HBsAg 属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。

（二）固定剂

用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。

1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对 IgM、IgA、J 链、K 链和 λ 链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。

（1）10% 钙 - 福尔马林液（浓甲醛 10ml，饱和碳酸钙 90ml）。

（2）10% 中性缓冲福尔马林液（浓甲醋 10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。

（3）4% 多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4（多聚甲醛 40g,0.1mol/L PBS 液 pH7.4500ml，两者混

合加热至 60℃，搅拌并滴加 1nNaOH 至清晰为止，冷却后加 PBS 液至总量 1000ml）。

（4）戊二醛 - 甲醛液（戊二醛 1ml，浓甲醛 10ml，蒸馏水加至 100ml）。

戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock 认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。但 McDonald 等认为，该试剂用于 PAP 法免疫酶标记效果仍满意。

（5）甲醛升汞固定液（即 B5 固定液。浓甲醛 10ml，氯化汞 6g, 醋酸钠 1.25g, 蒸馏水 90ml）。

有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记 IgA、IgM、IgG 等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性，上皮细胞可产生非特异性荧光，故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。

（6）醋酸 - 甲醛液（浓甲醛 10ml，冰醋酸 3ml，生理盐水加至 100ml）。

Bullock 等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆 IgA、IgG、IgM、IgD 和 K、λ、J 链标记均呈阳性，且背景染色极淡。如标记 IgG 用 PAP 法第一抗体仅为甲醛升汞液的 1 /10。此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。

（7）Bouin’s 液。

该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko 认为用于标记 B 细胞的 J 链较好，但 Bullock 则认为它可导致 Igg γ 重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。

（8）Zamboni’s 液。

该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用 2.5% 多聚甲醛和 30% 饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。固定时间 6 -18h。

（9）PLP 液（过碘酸盐 - 赖氨酸 - 多聚甲醛固定液）。

该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合，从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液有选择性地使糖类固定，既稳定缺的，又不影响其在组织中的位置（固定剂 7 - 9 配制法见附录 1）。

2．非醛类固定剂 Pe 等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。

（1）碳化二亚胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g 溶于 100ml0.01mol/L,pH7.4PBS 中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记 IgA、IgG 效果不佳。

（2）碳二亚胺 - 戊二醛液（ECD- G 液）：配制法见附录一。

ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride], 即乙基 - 二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基 -CDI。

该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。

（3）Zenker’s 液（重铬酸钾 2.5g, 氯化汞 5g, 硫酸钠 1g, 蒸馏水 100ml, 混合溶解后，临用时加水醋酸 5ml）。

该固定液对免疫球蛋白染色最佳，固定时间约 2 -4h，染色前必须脱汞色素。

3．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

（1）Clarke 氏改良剂（100% 酒精 95ml，冰醋酸 5ml），用于冰冻切片的后固定。

（2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。

Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。

（3）AAF 液：95%-100% 酒精 85ml，冰醋酸 5ml，浓甲醛 10ml。

（4）Carnoy 氏液：100% 酒精 60ml，氯仿 30ml，冰醋酸 10ml，混合后 4。C 保存备用。

（5）Methacarn 氏液：甲醇 60ml，氯仿 30ml，冰醋酸 10ml，混合后 4。C 保存备用。

以上两种固定液适宜某些抗原，癌基因蛋白产物检测的 固定，P53 抗癌基因蛋白产物，PC-NA 等抗原的保存。

丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时 4。C 低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内 5 -10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。

以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多（见附录），不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。

固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于 2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在 0.3cm 以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织 20 倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。

（三）固定方法

1．浸入法（Immersionmethod）将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温（4。C）环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在 2 -12h 之间。

2．灌注法（Irrigationmethod）此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以 krebs 或生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或 50-100ml 注射器注入固定液。置灌注动物于 4。C 冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后 30min 内取材，取组织置同一固定剂中浸入 1 -3h，然后修整组织块。有主张用冷固定剂（4。C）进行灌注。我们的体会是一般光镜下观察的标本，室温固定即可获满意效果。应该强调，保持组织新鲜是很重要的，据报告，肽类抗原活性在断绝血液供应后 24h 几乎完全丧失。

灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。

三、组织切片技术应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求 5μm 左右，神经组织的研究要求切片厚度在 20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

1．冰冻切片 是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。

冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish 认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为 -33。C, 从 -30。C 降至 -43。C 之间，成核率急剧增加达 1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。

（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从 -33。C43。C 的时间，减少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰 - 丙酮（酒精）法：将 150-200ml 丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达 -70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约 50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达 -70℃时即可使用。将组织（大小为 1cm×0.8cm×0.5cm）投入异戊烷内速冻 30-60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置 -80℃低温冰箱内贮存。

②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约 2cm），如组织块小可适量加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约 10-20s 组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入 -80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

（2）将组织置于 20%-30% 蔗糖溶液 1～3 天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类：

①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于 -30℃C 低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至 2 -4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以 -15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的 CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚 8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。

冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。

2．石蜡切片 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在 4℃。C 下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于 2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在 60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。

组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表 1 -3：

表 1-3 组织块处理时间表

170% 乙醇4℃3～4h280% 乙醇4℃3～4h390% 乙醇4℃2～3h495% 乙醇Ⅰ4℃2～3h595% 乙醇Ⅱ4℃1～2h6100% 乙醇Ⅰ4℃1.5h7100% 乙醇Ⅱ4℃1.5h8二甲苯Ⅰ4℃0.5～1h9二甲苯Ⅱ4℃0.51～1h10石蜡Ⅰ60℃1h11石蜡Ⅱ60℃2h以上全过程为 18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于 0.5cm，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需 4h 左右。

石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度 2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入 37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于 4℃冰箱内备用。

石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机（Freezing dryer）在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。

3．振动切片 用振动切片机（Vibratotme），可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片 20～100μm，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其实用于免疫电镜观察。

4．塑料切片 塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类（Glycolmethacrylate, GMA）及环氧树脂类（Epon 812,618），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至 0.5～2um，故称半薄切片（Semithinsection）。GMA 保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如 Fpon 和 Araldite 能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。

5．超薄切片 电镜标本制作见第七章，应用超薄切片机（Ultrotome）进行切片。

6．碳蜡切片 碳蜡（Carbowax），学名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG）为水溶性蜡。根据其分子量不同，碳蜡有多种，如 400、800、1000、1500、4000、6000 等，用于组织包埋的有 1500、4000 两种，其熔点分别 38℃C 和 52。C 左右，常温下为固体石蜡状，加温熔化呈液体状。

本法的特点是组织固定水洗后，不需脱水透明可直接浸蜡包埋，且切片方法与常规石蜡切片相同。切下的组织片漂浮水面后自然展开，碳虹迅速深化，组织片即可展平，制片过程简单易行。

具体操作简述如下：组织块不宜过大，一般限定在 1.5cm×1cm×0.1cm 以内。①组织固定后充分水洗去除固定液，用滤纸吸干组织表面水。②将组织浸入碳蜡（1500）内，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蜡液（1500 和 4000 等量混合液），52℃30min。④浸入等量混合碳蜡液（或根据气温、湿度变化调整 4000 和 5000 混合比例，如气温高湿度大可以 4000：1500=3：2 混合，反之，则 2：3 混合）。⑤用等量混合碳蜡或调整混合碳蜡包埋成组织蜡块。⑥切片与石蜡切片相同。在操作过程中，碳蜡组织块应尽量避免与水或冰接触，贮存时应密封干燥冷藏。

本法优点是操作程序减少，时间缩短，组织不经有机溶剂损害、温度低、抗原性保存比石蜡切片好，组织结构清晰。缺点是夏季室温高时切片较困难，连续切片不如石蜡切片顺利；由于碳蜡有强吸湿性，不易长期保存。

7．玻片处理和涂胶 在免疫组化染色过程中由于各种原因常造成标本（细胞制片和组织切片）脱片现象，影响了工作质量和速度。一般采取两种方法即可防止脱片现象出现。

（1）载玻片和盖玻片处理：新载玻片上有油污，必须经过清洁液浸泡 12～24h，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗 5 遍以上，浸泡在 95% 酒精内 2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短，清洁液浸泡只需 2h，流水冲洗注意勿损伤玻片等。

（2）载玻片上涂粘附剂：粘附剂种类较多，常用的有以上几种：①树脂胶（Resin glue）又称白色乳胶，为木工用，有进口，国产之分，有人认为进口白色树脂胶较稳定，我们认为国产白乳胶（聚醋酸乙烯乳液 J - 北京产）质量尚稳定。使用浓度为 1%～2%，以蒸馏水稀释即可。②甘油明胶，混匀后涂在载玻片上，切片贴附后置有副醛的干燥器内，加热 80℃1h。③甲醛明胶，混合后即可涂片。④铬明矾明胶，混合后即可涂片，置 37℃温箱烤干。⑤多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸 0.1g，加蒸馏水 10ml，混合后即可涂片。此液不宜多配制。⑥3-Amino propy Eri-ethoxy Silame（APES）。

粘附剂 2～5 配制法见附录一。

参考文献1．Bullock CR, etal . Techniques in immunocytochemistry, Vol 1. London New York: Academic Press,1982

2.Coleman DV, et al.Immunoperoxidase staining tumor marker distribution studies in cytologicspecimens. Acta Cytologica, 1981:25:205～206

3.Jacobsen M, etal .The effectof fixation and trypsinization on the immunohistochemical demonstration ofintracellular immunoglobulin in paraffin embedded material .Acto Path.Microbiol . Scand . ,Sect. A, 1980;88:369～376

4. Kayhko?K. Optimal fixation ofthe immunoperoxidase identification of human J chain from tissue sections.Histochemistry, 1980;70:23-27

5.Leathem A, et al .Fixation andimmunohistochemistry of lymphoid tissue.J. Clin Path, 1980;33:1010-1012

6.Martin SE,et al Immunologicmethods in cytology:definitive diagnosis of non-Hodgkin’s lymphomas usingimmunologic markers for T-and B-cells .Am . Clin . Path.,1984;82:666～673

7.Mason DY,et al, Technicalaspects of lymphoma immunohistology.J. Histochem. Cytochem., 1980;28:731-745

8.Montero C.Immunocytochemistry.2nd ed. New York; John Wiley and Sons, 1979

9.Walts AE, et al.SPecial tumormarkers in diagnostic cytology:immunoperoxidase of carinoembryonicantigen,lysozyme and other tissue antigen in effusions, washes and aspirates.Acta Cytologica, 1983;27:408～416

10.Wordinger RJ, et al. Manual ofimmunoperoxidase techniques. Chicago; Americal Society of Pathologists Press,1983

11. 施达仁，等。B 淋巴细胞双 PAP 法免疫定位方法学的探讨及其在恶性淋巴瘤诊断上的应用。肿瘤，1982；2：11-14

12．Nuovo GJ.Comparison of Bouin solution and buffered formalin fixation on the detectionrate by in hybridization of human papillomavins DND in qenital tract lesions.

第二章 抗原和抗体的制备第一节 抗原的制备（缺）第二节 抗体的制备一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。

（一）用于免疫的动物

作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗 r - 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为 /// 雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以 2～3kg 为宜。

（二）免疫途径

免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射 0.1ml 左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。

（三）佐剂

由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。

佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进 T 细胞与 B 细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）, 其成分通常是羊毛脂 1 份、石腊油 5 份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为 1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入 1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。

配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置 4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗 3～4mg/ml 或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上 5～10min 内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。

（四）免疫方法

抗原剂量，首次剂量为 300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为 1 / 4 左右。每 2～3 周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗 0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。

在第 2 次加强免疫后 2 周，从耳缘静脉取 2～3ml 血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图 2 -3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。

图 2 -3 抗体反应

（五）抗血清的采集与保存

家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s 后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集 30～40ml。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

收集的血液置于室温下 1h 左右，凝固后，置 4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于 -40℃以下冰箱，或冻干后贮存于 4。C 冰箱保存。

（六）抗血清质量的评价

在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。

1．效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。

（1）放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育 24h 后，测定其结合率。通常以结合率为 50% 的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为 50% 时的稀释度为 1：15000，则该血清的效价就是 1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其 pH 等因素的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见第 8 章）

（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。

球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到 15g 的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到 65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为 0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约 3mm 厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图 2 -4）。中央孔内加适量抗原（容量为 50μl），周围各孔内分别加入 50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32 及不稀释的抗血清，37℃下孵育 24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图 2 -5）。

图 2 -4 双向扩散模型

图 2 -5 免疫扩散试验

2．特异性测定 抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/ T 或 B /B0），求出各自在 IC50 时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。

S=y/Z×100%

S：交叉反应率，y：IC50 时抗原浓度，Z：IC50 时近似抗原物质的浓度。

如某抗原的 IC50 浓度为 90Pg/ 管，而一些近似抗原物质 IC50 浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。

3．亲合力 在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数 K 表示。K 的单位是升 / 摩尔（L/mol）。在 RIA 中，K 是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K 的范围在 108～1012L/mol 之间，也有高达 1014L/mol 的。

计算亲合常数的方法 20 余种，计算出的 K 都不能真实反映实验情况，只能作为参考。

（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施

有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

二、单克隆抗体的制备1975 年 Kohler 和 Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见 2 -3。

表 2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较

项目常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲合力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水）0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水)0.5～10.0μg/ml（培养物上清液）用于常规免疫学实验可用单抗组合应用抗原抗体形成格子结构（沉淀反应）容易形成一般难形成抗原抗体反应抗体混杂，形成 2 分子反应困难，不可逆可形成 2 分子反应，可逆单克隆抗体的制备方法如下。

（一）动物的选择与免疫1．动物的选择 纯种 BALB/ C 小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/ C 小鼠。

2．免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的 McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫 抗原 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般 0.8～1ml,0.2ml/ 点）

↓3 周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip（腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过 0.5ml）

↓3 周后

第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7 天后采血测其效价）

↓2～3 周

加强免疫，剂量 50～500μg 为宜，ip 或 iv（静脉内注射）

↓3 天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为 1～2×107 个细胞。

初次免疫 1×107/0.5ml ip

↓2～3 周后

第二次免疫 1×107/0.5ml ip

↓3 周后

加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip 或 iv

↓

取脾融合

（二）细胞融合1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表 2 -4。

表 2 - 4 用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称来 源耐 受 药 物Ig 链H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/ C 骨髓瘤 MOPC-218- 氮鸟嘌呤r1 KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88- 氮鸟嘌呤- -P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88- 氮鸟嘌呤- K（不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63×BALB/ C 脾细胞）杂交瘤8- 氮鸟嘌呤- -SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63×BALB/ C 脾细胞）杂交瘤8- 氮鸟嘌呤- -F0BALB/ C 骨髓瘤8- 氮鸟嘌呤- -S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85- 溴脱氧尿嘧啶核苷- -MPC11-45.6TG1.7BALB/ C 骨髓瘤 MPC-116- 巯鸟嘌呤r2b K210.RCY3.Ag1.2.3LOU 大鼠骨髓瘤 R2108- 氮鸟嘌呤- KGM15006TG-A12人骨髓瘤 GM15006- 巯鸟嘌呤r1 KU-266AR人骨髓瘤 U -2668- 氮鸟嘌呤ελ骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如 RPMI1640，DMEM 培养基。小牛血清的浓度一般在 10%～20%，细胞浓度以 104～5×105/ml 为宜，最大浓度不得超过 106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按 1：3～1：10 的比例传代。每 3～5 天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用 8 - 氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对 HAT 呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备 McAb 的过程中，许多环节 需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系 3T3 经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为 2×104 或 105 细胞 / 孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用 BALB/ C 小鼠，6～10 周龄

↓

拉颈 处死，浸泡在 75% 酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入 5～6ml 预冷的培养液（严禁刺破肠管）

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入 10ml 离心管，1200rpm/ 分离 5～6min

↓

用 20% 小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至 1×105/ml

↓

加入 96 孔板，100μl/ 孔

↓

放入 37。c CO2 孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫 3 天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗 一次

↓

脾脏研碎，过不锈钢筛网

↓

离心，细胞用培养液洗 2 次

↓

计数

↓

取 108 脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

↓

用无血清培养液洗 2 次

↓

计数，取得×107 细胞备用

（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1：10 或 1：5 的比例混合在一起，在 50ml 离心管中用无血清不完全培养液洗 1 次，离心，1200rpm,8min; 弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s 内加入 37℃预温的 1ml 45%PEG（分子量 4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用 90s。

③加 37。C 预温的不完全培养液以终止 PEG 作用，每隔 2min 分别加入 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 6ml。

④离心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含 20% 小牛血清 HAT 选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的 96 孔板内，每孔加 100μl。一般一个免疫脾脏可接种 4 块 96 孔板。

⑦将培养板置 37℃、5%CO2 培养箱中培养。

（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测1．HAT 选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG 处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在 HAT 选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在 HAT 选择培养液可以生长繁殖。

在用 HAT 选择培养 1～2 天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4 天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT 选择培养液维持 7～10 天后应换用 HT 培养液，再维持 2 周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底 1 /10 面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每 2～3 天换一半培养液。

2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞 McAb 的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAb 的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的 McAb 的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

（四）杂交瘤的克隆化杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过 HAT 筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

1．有限稀释法克隆

（1）克隆前 1 天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为 3～10 个细胞 /ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞 100μl。孵育于 37℃、5%CO2 孵箱中。

（5）在第 7 天换液，以后每 2～3 天换液 1 次。

（6）8～9 天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至 24 孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

2．软琼脂培养法克隆

（1）软琼脂的配制：含有 20%NCS（小牛血清）的 2 倍浓缩的 RPMI1640。

①1% 琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5% 琼脂：由 1 份 1% 琼脂加 1 份含 20% 小牛血清的 2 倍浓缩的 RPMI1640 配制而成。置 42℃保温。

（2）用上述 0.5% 琼脂液（含有饲养细胞）15ml 倾注于直径为 9cm 的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

（3）按 100/ml，500/ml 或 5000/ml 等浓度配制需克隆的细胞悬液。

（4）1ml 0.5% 琼脂液（42℃预热）在室温中分别与 1ml 不同浓度的细胞悬液相混合。

（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中 10min，使其凝固，孵育于 37℃、5%CO2 孵箱中。

（6）4～5 天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10 天后，直接移种至含饲养细胞的 24 孔中进行培养。

（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏1．杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含 1×106 以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在 24 孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。

细胞冻存液：50% 小牛血清；40% 不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至 0℃后放入 -70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2．细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放 37℃水浴中，在 1min 内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置 37℃、5%CO2 孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

（六）单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为 10～60μg/ml, 如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按 1～3×107/ml 接种于小鼠背部皮下，每处注射 0.2ml, 共 2～4 点。待肿瘤达到一定大小后（一般 10～20 天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到 1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备：常规是先腹腔注射 0.5mlPristane (降植烷)或液体石蜡于 BALB/ C 鼠，1～2 周后腹腔注射 1×106 个杂交瘤细胞，接种细胞 7～10 天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获 5～10ml 腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到 5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。

（七）单克隆抗体的鉴定对制备的 McAb 进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：

1．抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用 ELISA、IFA 法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的 McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2．McAb 的 Ig 类与亚类的鉴定一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的 Ig 类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠 IgG 或 IgM，则检测出来的抗体一般是 IgG 类或 IgM 类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心 ELISA 来确定。在作双扩试验时，如加入适量的 PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

3．McAb 中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确定 McAb 的生物学活性。例如，如果确定抗病毒 McAb 的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4．McAb 识别抗原表位的鉴定用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定 McAb 所识别抗原位点，来确定 McAb 的识别的表位是否相同。

5．McAb 亲合力的鉴定 用 ELISA 或 RIA 竞争结合试验来确定 McAb 与相应抗原结合的亲合力。

第三节 抗体的提取与纯化（缺）第三章 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由 Coons 等（1950）建立，经过近 43 年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与亲合化学技术如葡萄球菌 A 蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA 等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光亮度计与与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多，将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。激光扫描等聚集显微镜的应用又开创了新的发展时代。

由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性，在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。

第一节 免疫荧光细胞化学的原理免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量（图 3 -1）。

图 3 -1 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。

一、直接法1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差（图 3 -2）。

图 3 -2 直接法

2．检查抗体法 将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。

二、间接法1．检查抗体法（夹心法）此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。

2．检查抗体法用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性 IgG 荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人 IgG 荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段（图 3 -3）

图 3 -3 间接法

3．检查抗原法双薄片此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原 - 抗体 - 荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合 3～5 个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合 3～5 分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强 3 至 4 倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。

三、补体法1．直接检查组织内免疫复合物法用抗补体 C3 等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物 — 抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。

图 3 -4 补体法

2．间接检查组织内抗原法常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经 37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。

四、双重免疫荧光标记法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗 A 和抗 B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗 A 抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗 B 抗体用 TMRITC 或 RB200 标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。

五、对照试验为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验：

1．直接法 需设下述对照试验

（1）标本自发荧光对照：标本只加 PBS 或不加 PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。

（2）抑制试验：可分为二步法和一步法。

①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。

（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光。

如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

2．间接法

（1）自发荧光对照：同上（一）。

（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

（3）抑制试验：同上。

（4）阳性对照：同上。

如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。

3．补体法

（1）自发荧光对照

（2）荧光抗体对照

（3）抑制试验

（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清 1：10 稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用 1：10 稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。

（6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。

第二节 荧光抗体的制备荧光抗体是免疫荧光细胞化学的重要技术之一，制备高特异性和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高特异性高效价的免疫血清。

一、荧光素荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止（一般持续 10-7～10-8s）。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常用的荧光色素有以下 3 种：

（一）异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate, GITC）呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存 2 年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为 490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为 398.4（图 3 -5）。

在碱性条件下，FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。反应式如下（图 3 -6）：

一个 Ig 分子上最多能 标记 15～20 个 FITC 分子。

图 3 -5 FITC 的吸收光谱和发射光谱

图 3 -6 抗体的 FITC 标记反应式

（二）四乙基罗达明（tetraethylrodamineB200, RB200）呈褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱为 570nm，最大发射光谱为 595～600nm, 呈明亮橙红色荧光。分子量为 580（图 3 -7）。

RB200 在五氯化磷（PCl5）作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸 ε - 氨基反应结合而标记在蛋白分子上。化学反应式如下（图 3 -8）。

图 3 -7 RB200 在可见光区的吸收

图 3 -8 RB200 标记抗体反应光谱和荧光光谱

（三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate, TMRITC）它是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为 550nm，最大发射光谱 620nm，呈橙红色荧光，与 FITC 的黄绿色荧光对比清晰（图 3 -9），与蛋白质结合方式同 TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下（图 3 -10）。

图 3 -9 TMRITC 在可见光区的吸收光谱和发射光谱

图 3 -10 TMRITC 结构式

二、荧光素标记抗体的方法（一）FITC 标记抗体的方法1．Marsshall 氏法

（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0 碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1% 硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或 1000ml 烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2 或 8.0 的 0.01mol/L PBS 等。

（2）方法及步骤：

①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为 20mg/ml，缓冲液容量为总量的 1 /10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加 0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约 5～10min 内加完），加毕后，继续搅拌 12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于 4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在 4℃冰箱或冰库中。

④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用 pH8.0 缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶 G -25 或 G -50 柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定（图 3 -11，图 -3-12）。

图 3 -11 Sephadex G-25 对 FITC

图 3 -12 FITC 与家兔 IgG 球蛋白在 25℃和 2℃时结合的动力学（Kawamura 1964）

洗脱液：0.01mol/ L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）; 过滤量:12ml 标记全球蛋白液(过滤前未透析); 收集量:20ml(稀释 1.7 倍)。

分别以 1mgFITC 溶于 2 份 1mol 0.5mol/ L 碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为 pH9.5 和 pH9.0），于 2℃下搅拌将其各加入 100mg 家兔 IgG 生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于 2℃下，另一半置 25℃下。间隔一定时间后各取出 0.5ml 通过 sephadex G-25 去游离 FITC，由上计算出 5mg 家兔 IgG 结合的 FITC 量。

2．Chadwick 氏法

（1）材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3% 重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0 磷酸盐缓冲盐水、1% 硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）、透析袋、棉线、玻棒等。

（2）方法及步骤：

①抗体准备：用 0～4℃pH8.0 磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为 30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。

②荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素 0.01mg 计算，称取所需之荧光素量，用 3% 重碳酸钠水溶液溶解。

③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在 0～4℃，冰箱中结合 18～24h。

④透析和柱层析：方法同 Marshall 氏法。

3．改良法（1963 年）根据 Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/l NaCl）及缓冲液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0）稀释使每毫升内含蛋白 10mg, 缓冲液为总量的 10%，降温至 4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素 =50～80mg:1mg），在 0～4℃下电磁搅拌 12～14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用 Nessler 氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠 0.01%, 分装在 1ml 安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可达 2 年以上。

【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g, 溶于 2000ml 蒸馏水中，校定 pH 至 7.2。

【附二】0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml 加入 0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml, 混合后，校定 pH 至 9.0。

【附三】3% 重碳酸钠水溶液配法：称 1.5g 无水重碳酸钠充分溶解于 50ml 灭菌蒸馏水中即成。

4．透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。

（1）用 0.025mol/ L 碳酸盐缓冲液 pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成 1% 浓度，装入透析袋中。

（2）用同一缓冲液将 FITC 配成 0.1mg/ml 的溶液，按 1% 球蛋白液体积的 10 倍，将 FITC 稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于 FITC 液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在 4℃电磁搅拌下，透析标记 24h。取出透析袋中标记液，即刻用 sephadex G-50 凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于 4℃中（图 3 -13）。

图 3 -13 标记抗体溶液通过 sephadex 产胶柱层析分布

（二）四乙基罗达明标记抗体方法取 1g RB200 及 PCL52g 放在乳钵中研磨 5min（在通风橱中）。然后加入 10ml 无水丙酮，放置 5min，不断搅拌。过滤，用滤液进行标记抗体。剩余部分吸附在滤纸上，4℃干燥保存。

取抗体（20mg/ml）每毫升加入生理盐水和 0.5mol/l pH9.0 的碳酸盐缓冲液各 1ml 稀释。逐滴加入 0.1ml RB200 溶液，边加入边搅拌，在 0～4℃中结合 12～18h，再用生理盐水透析 5～7h，经葡聚糖凝胶 G -50 柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于 4℃备用。

（三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法（1）Igg 10ml (6mg/ml)在 0.01mol/l pH9.5 碳酸盐缓冲液中透析过夜。

（2）将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克 IgG 加入 5～20μg）溶于二甲亚砜（1mg/ml）, 取此溶液 300μl，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅拌。

（3）在室温中搅拌 2h，避光。

（4）把结合物移入直径 3cm, 高 30cm 大小的 Bio –Gel P- 6 层析柱（用 0.01mol/l pH8.0 的 PBS 平衡过），流速为 1.5ml/min。

（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。

（四）藻红蛋白标记抗体的方法1．巯基化藻红蛋白（phycoerthrin PE）的制备，600μl 的 15.5mg/ml 盐酸巯醇亚胺（iminothiolane hydrochloride）加到 1.2ml 的 3.6mg/ml 的 PE 中，和 1.2ml PB、pH6.8 混合，装入透析袋置入 50mmol/l pH6.8 PB 中透析，4℃过夜，再换用 pH7.5PB 透析 6h。每个 PE 分子中可结合 8 个巯基。

2．PE-IgG 制备异双功能试剂 SPDP[n – Succ – inimdyl3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入 700μl 的 4.2mg/ml IgG PB 溶液（50mmol/l pH7.5），在室温中反应 2.5h。再加入巯基化 Pe 400μl（1.7mg/ml）加到 500μl 反应混合液中，室温反应 12h，加入 100μl 的 50mmol/ L 碘乙酸钠封闭残余巯基，用 PB 透析过夜，4℃。加入 0.01%Na3N3 分装，4℃保存半年。

（五）PE- 标记蛋白 A 方法（1）取 4.08mg PE 溶于 0.1mol/l pH7.4PB（含 0.1mol/l NaCl）1ml 中，溶解后，取出 0.5ml，再加入 10μlSPDP 无水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/ 蛋白摩尔比为 10，22℃反应 5min，过 Sephadex G-50(1×17cm), 用 100mmol/l pH7.4 PBS（含 0.1mol/l NaCl）平衡和洗脱。

（2）0.5ml 蛋白（2mg/ml）100mmol/l PB(含有 100mmol/l NaCl) pH7.4，加入 2.6μl 上述 SPDP 甲醇液，SPDP：蛋白 =9.5,22℃,40min , 加入 25μmol/ L 二硫苏糖醇（DTT）pH7.4 缓冲液，22℃，25min，同上过 Sephadex G-50，收集蛋白 A 峰。

（3）取 0.77mg/ml 的 PE 和 0.27mg/ml 蛋白 A 等量混合，22℃反应 6h，混合物 4℃保存备用。

以上两种 PE 标记制品，可最后溶于 0.01mol/l pH7.4PB(含有 0.1mol/l DETA、1mol/ L 碘乙酰胺、1%BSA 和 0.1%NaN3),0～5℃保存。

（六）蓝色荧光素标记抗体方法Kbaffan 等（1986）首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。

（1）取 7 - 氨基 -4- 甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC）260μg 溶于二甲亚砜 25μl 中。

（2）将上液加入 10ml IgG 的 巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5, 内含 50～100mg IgG）中，室温反应 2h，过 Sephadex G-50 除去游离荧光素。

AMC 呈黄色结晶固体，最大吸收波长 354nm, 最大荧光波长 430nm。

三、荧光抗体质量控制对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。

（一）染色特异性和敏感性的测定1．特异性染色效价的测定直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如 1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大释释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即 2～4 个单位），如染色效价为 1：64，实际应用时可取 1：32 或 1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。

2．非特异性染色测定根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。

3．吸收试验在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌 2h 后，移入 4℃中过夜，3000r/min, 离心 30min，收集上清液，再用以染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。

4．抑制试验如前述。

（二）F/ P 比值的测定F（荧光素）和 P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求 F / P 的克分子比值为 1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。

1．蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质 mg/ml 量。

2．结合荧光素定量 先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取 FITC1mg, 溶于 10ml 0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液中，再用 0.01mol/l pH7.2PBS 稀释到 100ml，此时荧光素含量为 10 μg/ml，以此为原液，再倍比稀释 9 个不同浓度的溶液，用分光亮度计在 490nm 波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。

荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约 5nm,FITC 和蛋白质结合后由 490nm 变为 493～495nm，RB200 和蛋白质结合后变为 595nm。

F/ P 比值的计算：可按以下公式计算。

式中 160000 为抗体蛋白质的分子量，390 为 FITC 的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以 103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以 106。

测定 RB200 荧光抗体的克分子比值公式如下：

按图 3 - 4 测定法更为简便，即先用 276nm 波长测得蛋白质的 OD 值，再用 493 波长测得 FITC 的 OD 值，将这两个 OD 值在图 3 -14 上连成一直线，直线与各纵线交叉处，即可查出标记抗体的以下数值：FITc μg/ml，F/P 的 μg/mg,F/ P 的克分子比值，蛋白 mg/ml 等。

图 3 -14 FITC 标记物中球蛋白、荧光色素和 E / P 比值计算图

四、荧光抗体的保存以 0～4℃或 -20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为 1：5000～10000 的硫柳汞或 1：1000～5000 的叠氮钠防腐，小量分装如 0.1～1ml，真空干燥后更易长期保存。

第三节 免疫荧光细胞化学染色方法一、标本制作可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法（一）直接法1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如 1：8 或 1：16 的荧光抗体（如兔抗人 γ - 球蛋白荧光抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等），在室温或 37℃染色 30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。

2．洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH7.4 或 pH7.2PBS 中洗两次，搅拌，每次 5min，再用蒸馏水洗 1min，除去盐结晶。

3．用 50% 缓冲（0.5mol/ L 碳酸盐缓冲液 pH9.0～9.5）甘油封固、镜检

4．对照染色

①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。

直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。

（二）间接法（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用 30min。然后用 0.01mol/l pH7.2PBS 洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人 γ - 球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色 30min，37℃，缓冲盐水洗两次 10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于 37℃，30min。

③缓冲盐水洗 2 次，每次 5min，吹干。

④滴加特异性荧光抗体再用切片于 37℃，30min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘油封固，镜检。

间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

（三）补体法1．材料

（1）免疫血清 60℃灭活 20min，用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1：2，1：4，1：8……。补体用 1：10 稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为 1：32 则免疫血清应作 1：8 稀释。

（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作 1：10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按 2 单位的比例，用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法：即在 pH7.4、0.1mol/ L 的磷酸缓冲盐水中，溶解 MgSO4 的含量为 0.01% 浓度。

（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为 1：4，补体为 2 单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价 1：4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。

2．方法步骤

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用 30min，置于保持一定湿度的染色盒内。

（3）用缓冲盐水洗 2 次，搅拌，每次 5min，吸干标本周围水液。

（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸馏水洗 1min，缓冲甘油封固。

3．对照染色

（1）抗原对照。

（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）灭活补体对照：将补体经 56℃30min 处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节 省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

（四）膜抗原荧光抗体染色法本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于 T 和 B 细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS 即采用此法原理。

（五）双重染色法在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗体用 FITC 标记，B 抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：

1．一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。

2．二步法双染色 先用 RB200 标记的 B 抗体染色，不必洗去，再用 FITC 标记的 A 抗体染色，按间接法进行。

结果：A 抗原阳性荧光呈现绿色，B 抗原阳性呈现桔红色荧光。

（六）荧光抗体再染色法若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的 HE 染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。

第四节 荧光显微镜检查法一、荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像（图 3 -15）。

图 3 -15 荧光显微镜的结构和主要部件

（一）光源现在多采用 200W 的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达 50～70 个标准大气压力，这一过程一般约需 5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。

超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。

新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为 15000V），启动后，维持工作电压一般为 50～60V，工作电流约 4A 左右。200W 超高压汞灯的平均寿命，在每次使用 2h 的情况下约为 200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作 20min，则寿命降低 50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等 15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。

超高压汞灯（100W 或 200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。

国产超高压汞灯 GCQ-200 型性能良好，可以代替 HBO-200 等型的进口灯泡，平均寿命在 200h 以上，价格也比较低。

我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。

（二）滤色系统滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B 是蓝色的第一个字母，G 是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于 BG12 的蓝色滤板名为 QB24，Q 是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B 是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如 K530，就是表示压制滤长 530nm 以下的光而透过 530nm 以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国 Corning 厂的 NO：5-58，即相当于 BG12。

用于荧光显微镜的主要滤板如表 3 -1。

表 3 -1 荧光显微镜常用滤板型号和透光特点

基本色调相应名称2mm 厚透光范围（峰值）nm上海电器元件厂德国（Schott）苏联日本黑紫ZWB-1UG-1yΦC-2DV-1300～400（365）黑紫ZWB-2UG-5yΦC-1280～240（360）靛蓝ZB-2BG-1ΦC-1BG-1300～500（380）靛蓝ZB-3BG-3CC-4BG-3260～520（400）靛蓝QB-24BG-12CC-8BG-12310～570（420）淡蓝QB-10BG-38C3C-5310～720（460）QB-12-8-11橙黄CB-3OG-1（K530）OC-11OG-1530 以上橙黄JB-8OG-4（K510）ЖC-18FY-5510 以上绿橙JB-7GG-11（K490）ЖC-17FY-3480 以上FY-4淡绿JB-4GG-3（K430）жC-11US-10420 以上引自：五九一节 五部队编：荧光显微术，见参考资料）

1．激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。

紫外光激发滤板：此滤板可使 400nm 以下的紫外光透过，阻挡 400nm 以上的可见光通过。常用型号为 UG- 1 或 UG-5，外加一块 BG-38，以除去红色尾波。

紫外蓝光激发滤板：此滤板可使 300～450nm 范围内的光通过。常用型号为 ZB- 2 或 ZB-3，外加 BG-38。

紫蓝光激发滤板：它可使 350～490nm 的光通过。常用型号为 QB24（BG12）。

最大吸收峰在 500nm 以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如 B -7）激发。

近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德 Leitz 厂的 FITC 专用 KP490 滤板和罗达明的 S546 绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。

激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。

2．压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下 3 种压制滤板：

紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与 UG- 1 或 UG- 5 组合。常用 GG-3K430 或 GG-6K460。

紫蓝光压制滤板：能通过 510nm 以上滤长的荧光（绿到红），能与 BG-12 组合。通常用 OG-4K510 或 OG-1K530。

紫外紫光压制滤板：能通过 460nm 以上波长的荧光（蓝到红），可与 BG- 3 组合，常用 OG-11K470AK 490，K510。

（三）反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达 90% 以上，而银的反射只有 70%；一般使用平面反光镜。

（四）聚光镜专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。

1．明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。

2．暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

3．相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

（五）物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。

（六）目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如 5×和 6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。

（七）落射光装置新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后，波长短的部分（紫外和紫蓝）由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对向光源呈 45。倾斜时，则垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本受到激发，这时物镜直接起聚光器的作用。同时，滤长长的部分（绿、黄、红等），对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射，滤镜起了激发滤板作用，由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观察，荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称之为落射荧光显微镜。

二、荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片

载玻片厚度应在 0.8～1.2mm 之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

（二）盖玻片

盖玻片厚度在 0.17mm 左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。

（三）标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。

（四）封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在 pH8.5～9.5 时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和 0.5mol/l pH9.0～9.5 的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

（五）镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

三、使用荧光显微镜的注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯 5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

（4）检查时间每次以 1～2h 为宜，超过 90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射 3～5min 后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过 2～3h。

（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。

四、荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光亮度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如 ASA200 以上或 24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如 FITC 的标记物，在紫外光下照射 30s，荧光亮度降低 50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

第五节 非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：

（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如 Forssman 氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。

二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：

（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉 50～100mg, 在离心管中充分混匀，在室温中振动 2h，4℃中过夜，再搅拌 10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2 次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。

用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据 Hiramotos 氏等的方法将组织的 20% 生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 2～3 次，12000r/min 10min 离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。

【肝粉的制法】

（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗 2～3 次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。

（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。

（3）将肝匀浆装入离心管内（1/ 3 左右），交换地用 2～3 倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用 2000r/min 离心沉淀 15min 后，再除去上清液。

（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。

（5）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。

（二）透析法荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。

（2）浸入 0.02mol/ph 7.1～7.4 的 PBS 中（悬于大于标记物体积约 50～100 倍的 PBS 内），在 4℃中透析，每日更换 3～4 次 PBS，约 5～7 天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。

（三）葡聚糖凝胶 G -50 柱层析法除游离荧光素可用 2×46cm 柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体 15～18ml（按床体积的 5%～10% 加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入 PBS 少许，关闭下口，停留 30～40min，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F / P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20% 磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。

若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+ 太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现 SO4++（用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀）。最后是 NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无 SO4++ 及 NH4+ 后可再用。

如仅用小量荧光抗体，可用 1×20cm 的柱层析柱，取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。

（四）DEAE 纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE- 纤维素柱层析法除去。方法如下：

DEAE- 纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。装柱所需 DEAE- 纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：

（1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘 3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分 1。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分 2。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分 3。

将此三部分收集液（每管 5ml）分别测定其 F / P 比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB 洗脱液 280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。

（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加 NaCl 的浓度至 2.0mol/ L 洗脱完。

经过 DEAE- 纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失 50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。

（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。

（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专着。

（七）纯化抗体法 — 免疫吸收法例如抗 IgA 血清的纯化方法 — 免疫吸收法。如分泌型 IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与 IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人 IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：

1．人 IgG 聚合物的制备在 5ml 含 40mg/ml 人 IgG 的 0.1mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液中，加入 2.5% 戊二醛溶液 1ml，边加边搅，5min 即出现混浊，逐现大块胶块，放置 30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用 1.0mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液反复洗涤 3 次，末次加蒸馏水至 20ml，即为人 IgG 聚合物悬液。

2．免疫吸收法将待吸收的抗 SIgG 血清加入待量 IgG 聚合物悬液，置室温搅拌 60min, 离心沉淀，上清液即稀释 1 倍的纯化抗 SIgA 血清。如用 IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。

（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法用 0.01% 伊文氏蓝的 0.01mol/l pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成 1% 溶液，保存于 4℃，用前再稀释至 0.01% 用以和然释荧光抗体。

此外，还可以用胰酶消化组织切片或用 10% 牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。

参考文献1．Coons AH, et al. Localization ofantigen in tissue cell.II. Improvements in a method for the detection ofantigen by means of fluorescent an-tibody. J Exp Med, 1950;91:1-3

2.RiggsJL, Seiwald RI, Burckhulter J, Powns CM and Metcalf TG. Iosthiocyanatecompounds as fluorescent labeling agents for immune serum. Am J Path,1958;34:1081～1097

3.MarshallID Jr, Eveland WC and Smith CW. Superiority of fluorescein isothiocyanate(Riggs)for fluorescent antibody technique with a modi-ification of its application. Procsec Exper Biol C Med(NP), 1958;98:898～900

4.GoldsteinG, Slizys IS and Chase MW. Stuides on fluoresent staining.1. Nonspecificfluorescence with fluorescein – coupled sheep anti-rab-bit globulins. J ExperMed, 1961;114:89～110

5.NairnRC. Fluorecent protein tracing. E & S Living stone LTD. Edinburgh and .London, Third Edition, 1969:P136～142,PP152～264

6. 王伯沄，免疫荧光组织化学和荧光组织化学技术，第四军医大学科技资料增刊，1974；2：5～30

7．Huang SN, et al. Application ofimmunofluorescent staining on paraffin section improved by trypsin digestion .Lab Invest,1976;35:383

8.GotakoYamad, et al .Hepatitis B core and surface antigens in liver tissue. LabInvest, 1977;36(6):649

9. 黄 策. 免疫荧光和荧光免疫.1983 年全军三防医学会议报告论文

10．张忠兵，等. 双标记免疫荧光法对胃粘膜抗体产生细胞的对比研究. 上海免疫学杂志，1983；3（5）：304

11.FairbanksTR. Current status of lymphocyte subpopulation testing in humans. Am J MedTechnol, 1980;46:471

12. 李元敏等译, 免疫细胞化学. 原子能出版社,1985:25～44

13.WickG, Traill KN, Schouestein K. Immunofluorescence Technology, SelectedTheoretical and Clinical Aspects. Elseries Biomedical Press. Amsterdom,1982:P27～36, P181, P219～262, P317～323

14.AKiyoshi Kawamura Jr. Fluorescent antibody . Technique and Their Applications.Second Edition University of Tokyo Press, Tokyo,1977:P10,P79,P141～281

15. RayMB, et al. Immunofluorescent detection of alphaantitrypsin in paraffin embeddedliver. J Clin Pathol, 1975;28:717

16. 王伯沄，胰酶消化法提高甲醛固定石蜡切片免疫组织化学法敏感性方法，第四军医大学学报，1982;2:127

17. AurelF. Labelled antibodies in biology and medicine.Printed in Romania,1978:PP52-190

18. 王伯沄，免疫荧光技术: 见汪美先 主编. 免疫学基础. 西安: 陕西省科学技术出版社,1981:279-295

19. 59175 部队. 荧光显微术. 上海科学技术情报所,1976:224～288

20. PolakJM and Noorden SV. Immunocytochemistry, PP233～248Wright, PSG. 1983

21 李成文. 现代免疫化学技术. 上海: 上海科技出版社,1992:97～100

第四章 免疫酶细胞化学免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原 / 抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。

40 多年前，Coons 及其同事利用荧光色素（FITC）标记抗体而开创的免疫荧光抗体技术，具有一定的灵敏性、特异性、操作简单等优点，但亦存在抗体用量大，标本不能长期保存、需较昂贵的荧光显微镜等问题。几乎在同一时期，电子显微镜在医学生物学领域中得到了广泛的应用。为克服荧光抗体法的不足、并能在超微结构水平定位抗原物质的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光色素标记抗体，进行组织细胞内抗原或半抗原的定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶细胞化学之路。

Sternberger（1970）等人在此基础上又作了改良，建立了非标记抗体酶法以及 PAP 法。酶标抗体法确立至今已经 27 个春秋，不断发展、成熟。各种新技术的引入，使新抗体相继问世，应运而生的抗体制造、经销商遍布世界各地，使 ICC 技术得到了更广泛的推广和应用，成为当今形态学研究领域中不可缺少的手段；同时也有为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供重要依据，是临床实验室常规检查法之一。近年，伴随分子生物学、分子遗传学的惊人进步，ICC 技术在基因表达产物的观察，细胞功能动态分析中，亦发挥着重要作用。在此，结合，笔者经验，介绍 ICC 染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及一些进展、特殊应用等供读者参考。

第一节 固定和切片一、固定若想得到理想的 ICC 染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是 ICC 染色中非常重要的一环。ICC 与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cumming（1980）报告，不固定的组织切片 ICC 染色时，环鸟苷酸含量丢失 80% 以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是 ICC 染色成功的关键一步。用于 ICC 的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章，下面介绍两种近年报道的新方法。

1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene）法是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在 -20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置 4℃丙酮 20～30min，再移入 -20℃丙酮过夜。实际上组织在 4℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。

2．微波固定（Microwave fixation）为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC 以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波（频率 1000～3000MHz）具有被水分吸收的性质（通常所用的微波是频率 2450MHz，波长 12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，继续固定 2～6h，室温。

近年研究的专门固定用的微波炉已商品化，例如：Bio-Rad H2500 型、日新 EM·MWE- 2 等，该类微波炉能够准确地调节 照射时间和测定被照材料的瞬时温度。利用家庭微波炉代替时，应选用能以秒为单位调控的微波炉。实验材料不同，所需固定液的量、照射时间等各异，所以应在预实验的基础上，找出合适的固定液量、照射时间和温度。多数实验室的条件为：固定液 5～10ml，照射 10～30s，照射后固定液的温度≤50。C。其方法为：将实验标本置于微波炉旋转台的中央，周边放一烧杯盛 300～500ml 纯水，吸收照射时炉内产生的热量，选择强挡照射 10～30s。接通电源（on）至微波产生利用超声波代替微波照射，或二者并用，照射后，组织标本和固定液的温度升高较少，亦能获得短时间内良好的固定效果（Yasuda 1992）。

二、切片光镜 ICC 染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为 ICC 研究所首选。

Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内 DNA 双链解开，DNA、RNA 解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次 1min，照射 5～10 次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过 90～95℃为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳（详见第一章）。

第二节 染色方法一、本科标抗体法酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。

（一）酶的种类及特点从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行 ICC 染色，但实际上在 ICC 中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表 4 -1，供选用时参考。

表 4 -1 免疫细胞化学常用的酶

名 称分 子 量内 源 性商 品Horseeradish peroxidase(E.C.1,11,1,7)40～45KD+有Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1)80～120Kd++有Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2)100Kd+++有Glucose oxidase160～190kD-有Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③较易获得的酶分子，最好有商品出售；④中性 pH 时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存 1～2 年活性不应改变，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）较佳，是最常用的一种酶。HRP 广泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占 16%～18（8 条糖链分布在 HRP 分子表面），分子量 40kD，最适 pH5～5.5，最适温度 40～45℃；pH4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和 58% 以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，最大吸收光谱为 403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为 275nm，HRP 的纯度是用二者的光密度比值（Od 403/275）衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般认为，标记酶的 RZ 值为 3.0 左右，不应小于 2.8，RZ 值越小，酶的纯度越差，例如 RZ 值为 0.6 的酶，含非活性的酶蛋白量高达 75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。

除 HRP 外，碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase, ALP）和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）也较常用。ALP 分子量约为 HRP 的 2～3 倍，最适 pH9.0～9.5 左右，比较稳定，内源性 ALP 也较易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole, 分子量 240.8kD）抑制，但肠粘膜表面的内源性 ALP 活性不受影响。目前所用的 ALP 大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。

ALP 最初是由 Bulman 等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast Blue, FB）为底物，生成蓝色沉淀。用快红（Fast Red, FR）代替 FB，形成红色不溶沉淀。与 HRP/4- 氯 -1- 萘酚（CN）或 DAB 形成的沉淀形成鲜明对比，但 FB、FR 等沉淀物溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。据报告，利用新品红（New fuch-sine）显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，轻度核复染后，可制成半永久性保存标本。

GOD 所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝（P-Nitroblue Tetrazolium）, 终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲 GOD 较 ALP、HRP 为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性 GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故 GOD 主要用于 ICC 双重染色和两种酶的放大技术。

（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥 - 偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备 3 个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体的活性；③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。

在 HRP 标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及 Maleimide 等，现简介如下。

1．戊二 醛标记法戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的 OD 比值表示，它们的最大吸收光波长分别为 235nm 和 280nm，二者的 OD 比值（235/280）小于 3 时，制备酶标抗体的效果较好，大于 3 时，需经蒸馏或 Sephadex G-10 柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法；基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。

（1）一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较 HRP 为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据 Nakane 等推算，加入的 HRP 仅 20% 与抗体连结，标记率较低（约 1%～5%）很难获得理想的酶标抗体。

（2）二步法：首先用过量的戊二醛与 HRP 反应（HRP：戊二醛为 1：105），以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性 HRP（HRP- 戊二醛复合物），再加入过量的抗体，使活化 HRP 上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的 HRP 与抗体（IgG）比例不同，酶标记率各异，平均为 5%～25%。标记步骤如下：

①10～15mgHRP(RZ=3.0), 溶解于 0.2ml 1.25% 戊二醛中（0.1mol/ L 磷酸缓冲液配制），18h 室温。

②透析或 SephadexG-25 柱层析（0.15mol/l NaCl 平衡），去除过量的戊二醛，收集活化 HRP。

③浓缩活化 HRP 至 10mg/ml 左右，加入抗体 5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸盐缓冲液（pH9.5）调整 pH 至 9.0～9.5, 使抗体与活化 HRP 结合，4℃24h。

⑤加入 0.1ml 赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。

⑥用半饱和硫酸铵沉淀 5 次，对 PBS 透析 24h，4℃，换 3 次 PBS，除去硫酸铵（10000rpm/min,30min）。

⑦或用凝胶色谱法（SephadexG-200/Sephacryl S-200）等分离标记抗体。

注意：该方法要求 HRP 的 RZ 值在 3.0 左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而 RZ 值小于 2.8 的 HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。

2．过碘酸盐氧化法严格地讲，过碘酸钠（Sudium periodate）不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶（如 HRP）的标记。我们知道，HRP 分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的 -CH 基，使之生成 -CHO 基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成 Shiff’s 碱。此 Shiff’碱在 pH 降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠（NaBH4）还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图 4 -1）。为防止生成的 -CHO 基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene）处理 HRP，阻断分子内的 ε -、α- 氨基。

图 4 -1 过碘酸盐氧化原理

过碘酸盐氧化法，酶的 RZ 值≥3 时较佳；RZ<3 时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的 HRP 和抗体均形成酶标抗体，其标记率为 70% 左右。具体步骤为：

（1）4mgHRP(RZ=3.0)溶于 1.0ml 双蒸水中。

（2）加 0.2ml 新鲜配制的 0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合 20min, 肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。

（3）对 0.1mol/ L 醋酸盐缓冲液（pH4.4）透析，20h，4℃。

（4）调整 HRP 液体的 pH 至 9.5(一般加入 20μl0.2mol/ L 碳酸盐缓冲液 pH9.5), 立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/ L 碳酸盐缓冲液溶解), 轻轻混匀后, 置室温 2h。PH≤8.5 时, 抗体的 NH2 基被氧化生成 NH3+, 后者不能与 CHO 基反应, 所以, 保持 pH9.0～9.5 非常重要。

（5）加入 0.1ml 新鲜配制的 0.4%NaBH4 溶液，置 1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。

（6）经透析等去除未反应的 NaBH4，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。

如此制得的酶标抗体，加入终浓度 1% 牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）分装后于 -80℃可保存数年；亦可加入 6% 等量甘油，混匀置 -20℃/4℃保存 1 年左右。上述两种标记法是 ICC 研究中最常用的酶标抗体制备方法。

3．Maleinmide 法上述酶标抗体（IgG）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1 个 HRP 分子标记 1 个 IgG 分子）的分子量为 190～200kD，非标记抗体为 146～150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,Sternberger 等进行了抗体片段 Fab 的标记。用植物性蛋白酶 — 木瓜酶（Papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的 Fc 段结晶和两个相同的抗原结合片段（Fab），此 Fab 段为单价，分子量 50kD,HRP 标记后，单体分子量为 90kD, 较容易将单体和非标记的 Fab 段分离。在此基础上，Imagawa(1982)又进行了改良，引入了 N - 羟基丁二酰酯（Maleinmide），标记抗体的特定部位 —Maleinmide 法。该方法的主要原理是：（1）借助双功能试剂 Maleinmide 活化 HRP，使其具有与—Hs 基反应的能力；（2）利用胃蛋白酶水解 IgG，IgG 重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（Hinge region）至少可以保留一个 S - S 键，从而得到一个具有双价抗体活性的 F（ab＇）2 段。该 S - S 键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇（2（β）-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH）使其断裂，被还原成—HS 基。如此双价抗体活性的 F（ab＇）2 片段即变为带有—Hs 基的单价 Fab’片段，后者再与活化的 HRP 结合，便制成了酶标抗体 Fab＇。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—HS 基，也只能有一个能与酶结合，另一个—HS 基不能与酶反应，即酶与抗体 Fab’段结合比例为 1：1，因此酶标抗体 Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化 HRP，还能避免非标记抗体 Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量与 Fab 段相似（50kD 左右），所以酶标后 Fab＇亦较容易与未标记的 Fab＇分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：

①6mg HRP 溶于 1.0ml PBS(pH7.0)中。

②4mg Maleinmide 溶于 0.5ml N, N 二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide）中。

③将上述两种液体充分混合，持续搅拌 1h,30℃。

④离心取上清，经 0.1mol/lPB(pH6.0)平衡的 Sephadex G-25 柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化 HRP。

⑤每 1.8mg 活化 HRP，加入已被还原的 Fab＇2mg,4℃20h 持续搅拌。

⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200 分离酶标抗体 Fab＇片段，保存同前。

（三）酶标抗体的纯化上述各种方法制备酶标抗体时，除产生酶标抗体外，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。

1．多聚体的分离实验中，不同的试剂形成的多聚体的数量各异，即使同样的实验药物和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。

2．非标记抗体的分离 非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征，能竞争与组织特异抗原结合，而且亲和力较标记抗体强，优先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结 1～2 个酶分子，并不影响抗体的两个（Fab）抗原结合点，但因存在空间遮蔽现象，一个 Fab 段与组织特异性抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象，两个 Fab 段均与抗原结合，因而亲合力较强。所以酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲合层析等方法去除非标记抗体。

3．亲合层析 利用蛋白 A（Protein A）/ 琼脂糖 - 刀豆素 A / 琼脂糖亲合层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白 A 与抗体（标记和未标记）间有较强的亲合力，不与 HRP 结合。而刀豆素 A 与 HRP（标记和游离）间的亲合力非常强，不与抗体结合。据此二者并用，能获得较纯的 HRP 酶标抗体。该方法省时，分离能力强（约为凝胶层析的 600 倍）。但有一定的局限性，因为蛋白 A 并非与所有种属的免疫球蛋白亲合力均较强，例：不能与羊的免疫球蛋白结合，所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素 A 与 HRP 的亲合力极强，甚至呈不可逆性结合，可使部分酶标抗体的活性丧失。

（四）染色原理及步骤1．基本原理 酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%～90% 的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔 / 小鼠的 IgG）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的 ICC 染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。

2．染色程序

（1）切片准备：见第一章。

①石蜡切片经二甲苯或 Hemo-De 脱蜡，下行酒精至水。②固定 / 无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥 2h 以上。

（2）未固定的新鲜组织切片，丙酮固定 20～30min(fretrieval)，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽（室温），风干 15～30min.; 已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。

（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节 省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片（滴少量 PBS，以防其干燥）直接进行步骤（6）。

（4）切片经 PBS 或其它缓冲液漂洗 3 次，每次 2min，溶解除去冰冻切片上的 OCT 包埋剂。但应用 ALP 标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使 ALP 失活。

（5）根据需要，用甲醇 +0.3%H2O2 处理切片 15～30min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用 ALP 标记抗体时，此步可省略。

（6）PBS 漂洗 2min（共两次），移至 0.05%Tween-20/PBS(或 0.22～1%Triton X-100)中 5min（室温）。Tween-20 为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。

（7）4%BlockAce 或 0.1%～1%BSA 湿盒内孵育 15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。

（8）根据需要，可用 1 /5～1/30 正常来活兔 / 羊血清孵育 15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入 1%～2% 的同一种属正常血清。

（9）轻轻弃去孵育液，滴加含 0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS 稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为 50～80μl），湿盒内孵育 1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。

（10）PBS 充分冲洗（3 次×2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。

（11）经 0.05%Tween-20/PBs2min 后, 滴加含 0.2%BSA/1% 正常血清 /PBS 稀释的 HRP 酶标记的第二抗体, 湿盒内孵育 45～60min(20～25℃)。

（12）PBS 漂洗（3 次×2min）, 此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。

（13）未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从 PBS 移至 TBS 中 3～5min，去除 PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的 CaCl2 形成磷酸钙而沉淀后，然后用 Baker 氏固定液固定 5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的 ICC 染色。

（14）呈色：HRP 标记抗体的呈色液为 0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片经 PBS 或 Tris-HCl 液漂洗后，置上述呈色液内 10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色 3～5min 即可，防止 DAB 终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免 DAB 本身氧化变质。新配制的 DAB 为无色透明液体。若 DAB 液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。

（15）将切片置流水中（仅光镜观察）或 PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。

（16）未固定的冰冻切片，可用 1% 戊二醛 -PBS 液加强固定 5～10min（室温），流水冲洗。

（17）细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与 HRP/ALP 等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与 HRP、ALP 的终产物对比度比较好。

（18）DAB 呈色的标本，可以系列酒精脱水、Hemo-De 透明、DPX 封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。

（19）镜检、观察记录同一般形态学研究。

（20）免疫电镜用标本，经 OSO4 后固定，按电镜标本要求处理（参见本书第七章）。亦可 OSO4 固定，喷碳（Carbon Coating）, 利用扫描电镜观察抗原的存在部位。

3．酶标抗体及发色剂的选择

HRP 特异底物为 H2O2, 在分解 H2O2 过程中, 与 H2O2 形成复合物, 无电子供体存在时, 反应不再进行, 当电子供体存在时, 迅速生成水, 酶被还原, 电子供体被氧化环化, 形成苯乙胼聚合体(图 4 -2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。

图 4 -2 DAB 反应产物形成过程

HRP 催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物 H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol）为蓝黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine）为深蓝色，AEC（3—amino—9– ethyl–carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以 AEC 居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。DAB 是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经 O2O4 处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是 DAB 被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将 DAB 制成 10 倍贮存液，分装于 -20℃保存，应用时稀释、过滤。与 DAB 比较，CN 敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。

（2）ALP，是以 As-Mx 为底物，FB/FR 为发色团，生成蓝色 / 红色不溶性沉淀。ALP 标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的 ICC 染色。显色液内加入终浓度为 2～4mmol/ l 的 levamisole, 大多数内源性 ALP 活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升 60～120mmol/ L 浓度的贮存液 -20℃冰箱保存。应用时稀释 30 倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB 试剂均应小量分装后 -20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液 30ml 计算，分装 As-Mx 5～7mg/ 支、Fr8mg./ 支、FB7mg/ 支，每次使用一支，用前稀释 30 倍，过滤显色。FR、FB 等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。

（3）GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为 β -D- 葡萄糖 67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育 1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但 GOD 的敏感度较 HRP 和 ALP 为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用 GOD 和 HRP 分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为 GOD 标记的兔抗鼠 IgG，第三抗体则为 HRP 标记的羊抗兔 IgG），ICC 染色，以葡萄糖 -DAB 作显色剂。基本原理如（图 4 -3）。在这里 HRP 是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的 H2O2 作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且 GOD 和 HRP 所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：

①切片经第一抗的孵育；②漂洗，GOD 标记的第二抗体孵育 40～60min（室温）；③漂洗，HRP 标记的第三抗体孵育 30～45min（室温）；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。

图 4 -3 两步酶催化反应原理

二、非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此 Sternberger 等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PeroxidaseAntiperoxidase Method, PAP 法）。现分述如下。

（一）酶桥法1．基本原理首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。

2．染色步骤 主要程序如图 4 -4

图 4 -4 酶桥法主要染色步骤

（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属 A）孵育 24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个 Fab 段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属 a IgG 抗体）孵育 1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个 Fab 段与第一抗体结合，另一个 Fab 段游离。

（3）切片与抗酶抗体（来自种属 A）孵育 1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属 a IgG，具有相同的抗原性，所以 桥抗体游离的 Fab 能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。

（4）切片与酶（HRp70～100μg/ml,PBS 溶解）孵育 0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。

（5）显色等与酶标抗体法相同。

酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70% 左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此 70 年代初，Sternberger(1970)又建立了 PAP 法，并加以改良，现为 ICC 研究中常用的方法之一。

（二）PAP 法1．PAP 的制备及特征 PAP 复合物是离体制备的 HRP 抗 HRP 复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。

（1）制备抗 HRP 血清：健康雄性家兔（2.0kg 以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共 10mg），2 周后重复 1 次，刺激机体免疫系统功能，1 周后于背部脊柱两旁皮内多点注射 1.0ml 乳剂[（福氏完全佐剂，含 HRP3.3mg(RZ=3.0)]; 间隔 2 周第 2 次注射，背部注入含 HRP3.3mg 的不完全福氏佐剂 1.0mg；再间隔 2 周，第 3 次注射，2mgHRP（溶于 2ml 生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1 周后采静脉血，检查效价。再隔 1 周第 4 次加强注射（条件同第 3 次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为 1：128 以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。

（2）制备 PAP 复合物：离体条件下，使兔抗 HRP 抗体与 HRP 形成可溶性复合物。在制备抗 HRP 血清时，HRP 的纯度要高（RZ≥3），而制备 PAP 复合物时，HRP 的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。

【步骤】

①取 10.50ml 抗 HRP 血清，加 7.60ml 含 7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。

②混匀，室温 1h 后，离心 16000g 4℃15min。

③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心 16000g 4℃15min，重复 4 次。

④加 15.3ml HRP 水溶液（含 HRP30.64mg），室温，持续搅拌。

⑤用 1N HCl 及 0.1N HCl 调 pH 至 2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用 1N 及 0.1n NaOH 调 pH 至 7.2。

⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置 0℃45min。

⑦离心 35000g 0℃15min，沉淀用 50% 硫酸铵漂洗两次。

⑧用 10.50ml 水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水 5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至 10.50ml，分装低温保存。

【质量鉴定】

制备的 PAP 复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定 PAP 复合物的质量。常用分光光度计检测 PAP 的复合物在 280nm（IgG 的最大吸收波长）和 400nm（HRP 的最大吸收波长）的光密度值（OD 值），按下式计算 IgG 和 HRP 的含量：

一般 HRP/ 抗 HRP 的克分子比达 1.9 时，可分装冷藏于 -85℃冰箱，据报告如此冷藏的 PAP 复合物可保留 14 年之久，活性无改变。但稀释后的 PAP 复合物不稳定，4℃可保存 2～3 周。最好临用前配制。

【PAP 复合物的特征】

PAP 复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗 HRP 抗体均参与形成可溶性 PAP 复合物，仅残留少许游离的 HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP 复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的 PAP 复合物其 HRP/ 抗 HRP 之比绝大部分为 3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP 复合物沉降系数为 11.5s, 分子量为 400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为 3：2，即每个 PAP 生命物由 3 个 HRP 分子和 2 个抗 HRP 抗体组成，呈五角形结构，3 个角为 HRP，另两个角为抗 HRP 抗体。采用 H2O2-DAB 染色，电镜下已经观察到 PAP 复合物五角形环状结构，直径平均 21nm。这种结构异常稳定。据报告 PAP 复合物的抗 HRP 抗体与 HRP 结合常数为 108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离 HRP，亦不影响其稳定性。

2．PAP 染色原理及步骤

（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是 PAP 法将酶桥法的步骤 3、4 合并为 1，用 PAP 复合物代替，即第三步用 PAP 复合物孵育切片，故称 PAP 法。PAP 复合物中的抗 HRP 抗体和第一抗体为相同种属动物的 IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将 PAP 复合物连结在第一抗体上。

（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图 4 -5。

①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。

②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。

图 4 -5 PAP 法主要染色步骤

③用离体制得的 PAP 复合物（1：30～300 稀释）孵育 1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用 ALP 抗 ALP 复合物代替。

④显色观察等同间接法。

3．PAP 法的评价 PAP 法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC 等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：

（1）抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。

（2）灵敏度高：灵敏度是指 ICC 方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP 法应该较间接法敏感 2 倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为 1：1 标记，而 PAP 复合物含有 3 个 HRP 分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体 /PAP 复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以 PAP 法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。据此，Sternberger(1979)认为 PAP 法较间接法敏感 20～25 倍，可进一步稀释第一抗体，以节 省其用量。但实际上 PAP 法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP 显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP 法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的 Fab 段少，PAP 复合物被连结的相应减少有关。另外，PAP 复合物分子量较大（400KD）, 冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量 90～180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。

（3）背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图 4 -6）。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属 IgG 的特异性抗体，故亦不能与抗 HRP 抗体结合，不能把 PAP 复合物连结在此非特异性抗体上（图 4 -7）。当然，PAP 复合物内也可能存在些非抗 HRP 的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗 HRP 的抗体，故不能与 HRP 结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使 ICC 的特异性得到了双重放大，S/ N 增大。但也有人认为，过量的桥抗体及 PAP 复合物等均易与 Fc 受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP 法和间接法二者的背景均相当低。

图 4 -6 间接酶标抗体法

背景染色增高原因

图 4 -7 PAP 法降低背景的原理

（4）假阴性及其处理：应用 PAP 法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand 发现：应用 PAP 法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体（1：200）染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前 24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至 1：1500 时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee（1977）认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的 Fc 段间的距离（d）恰好是连结抗体的两个 Fab 段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离 Fab 段，仅剩无活性的 Fc 段，所以不能将 PAP 复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性（图 4 -8）。因此，借助 PAP 法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以 PAP 法在石蜡切片的 ICC 观察中更为常用。

图 4 -8 示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离 d 恰好适于桥抗体的两个 Fab 段与之结合，无 PAP 复合物结合的位置

（5）桥抗体：也称连结抗体，它的两个 Fab 段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和 PAP 复合物中抗 HRP 抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个 Fab 段之一与第一抗体结合、另一个与抗 HRP 抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白 A（SPA）代替桥抗体，进行 ICC 染色。SPA 不受种属限制，应用范围广。

（6）PAP 复合物：在 PAP 法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗 HRP 抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起；但一些研究表明：第一抗体和抗 HRP 抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如 Erlandsen 发现豚鼠 IgG 作为第一抗体，可用羊抗兔 IgG、兔 PAP 复合物显示之一。Grzanna（1982）根据这一报告，利用豚鼠抗 DBH 血清作第一抗体，羊抗兔 IgG 为桥抗体，12 例兔血清制得的 PAP 复合物中，仅 3 例染色较佳。这种第一抗体和 PAP 复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行 ICC 染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。

第三节 结果分析ICC 染色结果判断与其它组织化学相似，应在熟悉所应用方法、抗体的优点和局限性的基础上，避免主观意识，进行客观判断。一般认为在严格操作、控制染色的条件，选择特异性抗体等条件下，所得结果是阳性时才有积极意义。而阴性时，不一定意味着该物质或抗原不存在，即不能排除实验过程所致的抗原丢失或抗体选择不当等引起人工假象。另外根据 ICC 染色强弱做半定量分析时，必须是同时固定、相同的组织块、相邻 / 同一切片，在严格控制抗体用量和显色时间等条件下，进行图象测定，否则无法相互比较。镜检时，首先从对照标本开始，判断固定是否合适、非特异性着色强弱等再从低倍至高倍顺序观察实验标本，预期阳性部位是否被染色，不该含此类物质的部位是否阴性等。一般认为，切片边缘的较强染色，属于非特异性着色，所以应避免作为阳性结果的依据。同时应结合对照实验、鉴别假阳性，以便做出正确判断。

一、对照实验1．常用的吸收实验分固相吸收和液相吸收两种（见本书第一章），对于不能形成沉淀，难以用离心沉降法分离的一些小分子多肽类抗原，以固相吸收为佳。一般市售抗体均经特异性检测，所以应用购买抗体时可省略此步。

2．交叉实验 我们知道，引起机体免疫应答反应的并非是免疫原整个分子，而是其中的一部份—抗原决定簇。每个抗原可能有不同的抗原决定簇，不同的抗原亦可能有类似的抗原决定簇，因此一种抗血清可能与几种抗原结合。所以同时最好亦用结构相近的抗原做吸收实验，以避免抗原间的交叉反应。

3．替代实验 用制备第一抗体相同种属的正常血清（1/10 或相同 IgG 浓度）替代第一抗体或用第二抗体相同种属的正常血清替代酶标抗体 / 桥抗体或省略其中任何一种免疫试剂或酶等，以 PBS 代替之，分别孵育切片，结果均应为阴性。

4．置换实验 应用无关的特异性抗体代替第一抗体，孵育切片，结果应阴性。如果同时进行几种特异性抗体的 ICC 染色时，彼此之间即为此类对照。例如，无关的数种抗体，均在相同部位出现类似阳性结果时，非特异性着色的可能性较大，应慎重判断。

5．阳性对照 不具有 ICC 染色经验者，从事此项工作时，最好同时染色已知阳性标本，以排除操作过程失误所致的染色阴性。阳性标本切片最好冰冻保存备用。

另外，在观察新的组织抗原时，最好同时比较不同的固定的组织标本、冰冻切处及石蜡切片的 ICC 染色，选择最佳条件，以期得到良好的实验结果。

二、假阳性及其处理组织成分与各种染色试剂及抗血清之间的非特异性结合称假阳性，其主要原因和处理方法如下：

1．组织细胞内色素 与 DAB 沉淀物颜色类似的色素，例如黑质内的神经黑色素，不易与反应产物区别开来。可用其它电子供体或免疫荧光技术鉴别之，亦可改用 ALP 代替 HRP，进行染色。

2．假过氧化物酶活性 RBC 内的血红素辅基有类过氧化物酶活性，当组织内存在红细胞时，即使不加过氧化酶，亦可出现阳性染色。用甲醇 -0.3%H2O2 孵育标本 15～20min（室温），能抑制这种假阳性。甲醇可以使血红素蛋白中的（亚铁）血红素游离，后者被 H2O2 破坏，从而抑制类过氧化物酶的活性。一般认为，RBC 的染色容易同其它组织细胞区别，且动物实验还可通过灌注冲洗组织内的 RBC，所以此步往往被省略。

3．内源性过氧化物酶活性粒细胞、巨噬细胞等存在内源性过氧化物酶，能够与 DAB-H2O2 反应，导致假阳性，所以含此类细胞较丰富的脾脏、肝脏、骨髓等组织，ICC 染色时，最好做内源性酶阻断。适当的固定、经酸酒精孵育 15～20min，或 1% 乙酸 - 甲醇硝基铁氰化物处理，冰冻切片可用苯肼孵育 15～20min，均能不同程度地抑制内源性酶的活性。近年 Li(1987)报告，应用 0.1%NaN3 0.3%– H2O2 孵 10～15min（室温）能较好地抑制内源性过氧化物酶的活性，冰冻切片效果尤佳。嗜酸性粒细胞内源性过氧化物酶活性较强，上述各种处理后，仍残留部分活性，此种情况，在 DAB-H2O2 显色液中加入终浓度为 0.05NaN3, 基本上可达到完全阻断的作用。但是，各种封闭内源性（假）过氧化物酶方法均不同程度地破坏组织的抗原性，所以在不影响反应结果判断或能够同内源性酶的反应所致的假阳性区别时，尽量避免此类处理或改用 ALP 代替 HRP 进行 ICC 染色，也可以在用第一抗体与抗原反应结合后，再进行消除内源酶的处理。

4．游离醛基醛类固定的组织切片上，可能存在些游离醛基，后者能与蛋白质（含 IgG）间非特异性结合，导致假阳性，用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育切片，可封闭之。

5．疏水键和离子键免疫球蛋白可通过疏水键或离子键与组织中的碱性蛋白或 Fc 受体（冰冻切片 Fc 受体保存尤佳）非特异性结合。用正常血清（制备第二抗体种属的血清为首选），于第一抗体前孵育切片，可消除之。“4”和“5”重叠应用，更有利于降低背景染色。

6．天然抗体及不纯抗体 天然抗体是指因动物自然感染等原因血清中存在的部分抗体：不纯抗体是指在制备血清时，所用的抗原不纯，获得的抗体含有杂质抗体。当天然抗体或不纯抗体与组织成分结合时，可引起非特异性染色。上述二者的含量均较低，增加第一抗体的稀释度，可以降低其非特异性染色。

7．载体蛋白抗体 制备小分子多肽（分子量小于 4kD）的抗体时，需借助载体蛋白，使小分子多肽获得免疫原性，刺激动物产生特异性抗体。因载体本身具有抗原性，故动物同时也产生抗载体蛋白抗体，与组织蛋白结合后，引起背景染色。用固相吸收技术，能将载体蛋白抗体除去。一般市售抗体，均经特异性检测，所以“6”和“7”可不必考虑。

三、抗体有关事项1．血清特异性检测 为了发现新的物质或其它方法未能显示的物质、而又无相应抗体可购买时，往往需要自己制备抗血清。制备时应检测抗血清的特异性。常用的方法有：

（1）放射免疫分析（RIA）、免疫扩散或电泳及 ICC 法：在制备抗血清的过程中，用 RIA 和免疫电泳等方法检测抗血清的效价是不可少的。一般认为，RIA 和免疫电泳的最佳稀释度较高。ICC 染色时，应从其 1% 的稀释度试用之较合适。在制备 ICC 用抗血清时，最好在应用 RIA 和免疫电泳法的同时结合 ICC 染色，以鉴定抗血清的质量（制备单克隆抗体时，仅用 ICC 染色筛选特异克隆即可）。因为免疫过程中，各个时期抗血清效价不同的，例如给动物免疫催产素，7 周时血清 ICC 染色较好，RIA 不佳；在 10～12 周期间，RIA 效价升高，但 ICC 染色较差。因此制备 ICC 用抗血清时，应在 ICC 染色效价最佳时，收集抗血清。

（2）系列稀释第一抗体法：在一定稀释度时，抗体的特异性结合最强；继续增加抗体的稀释度，特异性反应将随之减弱至消失。因此采用系列稀释第一抗体的方法，能够验证抗血清的特异性。

2．抗体的选择 原则上应选择在较高稀释度时染色较佳而背景较低、结果稳定、重复再现良好的抗体。目前供 ICC 研究用的抗种类繁多，制造商如林，不同的厂家的相同抗体，其价格、包装及抗体的最佳工作浓度，差异较大。所以选购时，应多听取有经验者的建议，参考文献报告，并且自己应多查找不同厂家的抗体商品目录，恰当地选购自己所需的抗体。

3．抗体最佳稀释度的检测 抗原抗体反应要求一定比例，过量或不足，均不能达到预期的结果，所以 ICC 染色时，应进行抗体最佳稀释度的检测。市售抗体所附说明书均标有工作液浓度，但实际上，厂商常常给较低的稀释倍数，因此应用时，可将所给工作液浓度稀释数倍至数百倍再进行系列染色，选择其中特异性染色最强、背景着色最低的释释度作日常 ICC 染色浓度。在抗体来源不明、又无任何可供参考依据时，则可从原液至数倍稀释试用。另外，酶标抗体 / 连结抗体和 PAP 复合物等也需要确定最佳工作液浓度。一般认为酶标抗体可用稍离浓度，例如 HRP 标记抗体为 1：80～160、ALP 标记抗体为 1：50～100 染色较理想。PAP 法染色时，连结抗体稀释 1：50、PAP 复合物用 1：50～200 染色较合适。

4．抗体的保存 为确保 ICC 染色结果稳定、再现性良好，应避免抗体反复冻融所致的效价降低。第一抗体分装、冷冻保存为佳，其最小包装可为每次用量或 2 周内用量。例如某抗体的工作液浓度 1：1000～2000，每次染色需抗体量为 1～4ml 时，则所需原液为 1～2μl。将原液分装成几微升难度较大，所以先将原液稀释为 1：10～100，每支离心管内 10～100μl 保存，应用前稀释至工作液浓度。后者不宜冰冻，4℃可保存 2～3 周，原液和 1：10～100 的抗体在 -80℃可保存数年而染色结果不变。单克隆抗体为培养液上清或腹水时，应 4℃保存，应早应用。酶标抗体和 PAP 复合物原液 4℃保存 1 年左右，免疫活性和酶活性不发生改变，大量制备的酶标抗体 /PAP 复合物最好分装后于 -80℃或 -20℃保存。所分装的抗体，应注明名称，稀释度、量及日期等，同时应在笔记本详细记录。ICC 研究所用的任何抗体及酶，均应严格记录，妥善管理，才能保证实验成功。

四、单克隆抗体在单克隆抗体问世前，ICC 染色中通常所用的抗血清均为多克隆抗体，即抗血清含有多少 B 淋巴细胞株所分泌的抗体，这些抗体的性质不完全相同，不同的抗血清之间可能有交叉反应，使 ICC 染色受到一定限制。近年，单克隆抗体的引入，特别是市售单克隆抗体和种类和数量的迅猛发展，及各实验者比较容易制备自己所需的单克隆抗体，为 ICC 染色在特殊抗原定位、生物活性检测、肿瘤标记识别中，开辟了更广阔的前景。

1．单克隆抗体的制备（Oi,TV, 1980）(详见第一章)。

2．单克隆抗体的特点

（1）酶标抗体：自己制备或市售商的单克隆抗体，绝大部分为小鼠 IgG、Kappa 型，所以酶标抗体选择抗小鼠 IgG 的多价抗体，进行 ICC 染色比较稳妥。

（2）特异性：专一性强：单克隆抗体是由同一细胞株分泌的，性质均一，且有相同的亲合力，识别同一抗原决定簇。这在研究某些类似物质的局部定位、分型、生物活性检测及肿瘤诊断等方面有重要意义。但同时也应注意，不同抗原的相同抗原决定簇有被识别的可能，所以应结合其它方法，判断其结果。

（3）不需纯化抗原：多克隆抗血清在制备时，要求抗原相当纯。而制备单克隆抗体时，不需纯化抗原。一些不能纯化的组织（游离）细胞可直接免疫，经克隆化，筛选所需细胞株，避免了纯化抗原的麻烦，这在研究人类各种疾病等有重要价值。

（4）工作液浓度：不同的单克隆抗体效价各异，所以 ICC 染色时需检测最佳稀释倍数，大量培养纯化的抗体可用更高的稀释倍数。

（5）切片选择：单克隆抗体仅识别抗原物质的某一抗原决定簇，所以以新鲜组织的冰冻切片为首选。因为在固定过程中，可能使抗原物质发生某些改变，致使其与单克隆抗体反应的抗原决定簇丢失，故拟用石蜡切片固定组织冰冻切片。ICC 染色时，在制备单克隆抗体过程中，应该用同样标本和方法筛选所需细胞株，才能确保染色成功。

（6）特异性检测：单克隆 抗体的特异性强，性质均一，没有必要进行 RIA 分析和吸收实验等。自己制备的单克隆抗体，其特异性检测最佳方法为相同组织提取物质进行免疫电泳，确定抗原的分子量等。

（7）发现新物质：在制备肿瘤或其它组织细胞单克隆抗体时，往往有各种各样的抗原特异性杂交瘤细胞株产生，在筛选过程中，能够发现一些新的杂交瘤株，经培养制备相应的抗体，用于一些新领域的研究。

五、增加染色强度方法通常染色、着色较弱时，应想办法改进标本的处理的抗原的保存，提高抗体的穿透力，再重新染色。但有时组织本身抗原含量较少或标本难得（如手术材料），可尝试下述方法以提高染色强度，确保染色成功。

1．重复显色 一般认为，对 ALP 标记抗体，延长显色时间其反应可增强。但在同一染色液中延长显色时间，往往容易产生沉淀，出现终产物弥散现象。所以重新配制显色液继续呈色，第二孵育时间可缩短至 4～5min，能提高部分染色强度。

HRP 标记时，重复呈色无明显增强效应。通常在显色液中加入 0.01mol/l Imidazole 或改用酸性缓冲液（pH5.5～6.0），可提高染色强度；亦可在 DAB 反应后，1%OSO4 浸泡固定 5～15min，继之 0.4% 亚铁氰化钾 /0.1N HCl 液处理 5min，DAB 终产物呈黑色，与背景的对比度较佳。另外，在间接法显色较弱时，亦可试用 PAP 法、ABC 法等，探索较合适的染色方法。

2．重复第一抗体 在漂洗过程中，结合力弱的抗体易离解丢失，重复应用第一抗体有利于抗体与组织抗原结合，增加抗体数量，提高染色强度（Noorden 1983）。切片经第一抗体孵育后，漂洗，再孵育第一抗体（此时第一抗体可稀释较原工作浓度 1 至数倍）2～4h，然后经酶标抗体孵育，呈色观察同前。所用抗体为多克隆血清时，提高第一抗体的稀释度，重复孵育 2～3 次，可得到一定效果。单克隆抗体，经第一抗体—酶标抗体—第一抗体—酶标抗体，也能增加染色强度。

3．双桥 PAP 法（Vacca 1982）基本操作与单桥法相似，所不同的是切片经单桥 PAP 复合物孵育后，漂洗，再孵育桥抗体和 PAP 复合物（均可稀释 1 倍），即切片经两次桥抗体、两次 PAP 孵育—双桥法（Double bridged technique）。据报告，第一抗体用较高稀释度（例单桥法两倍），也能获得与双桥法相近的染色效果。

理论上讲，双桥法是 ICC 染色中较为敏感的方法，它较单桥法灵敏 20～50 倍，能够增加抗原的显示数量（25%）和反应终产物的大小。这在研究胚胎发育过程中一些抗原含量较低的组织时，具有一定的应用价值。双桥法可能是通过下列途径提高其敏感性的：①重复的桥抗体与 PAP 复合物中的抗 HRP 抗体的未饱和抗原位置结合，再连结另外的 PAP 复合物，在抗原部位抗体间彼此结合形成较大的抗原抗体复合物，具有多个酶分子（图 4 -9A），使反应增强。这可能是双桥法敏感性增高的主要机制；②重复的桥抗体与第一抗体未饱和的抗原位置结合，使第一抗体上结合较多的桥抗体及 PAP 复合物（图 4 -9B）。但 PAP 复合物较大，应设法提高其穿透性，达到增加染色强度的目的。

图 4 -9 双桥 PAP 法的两种放大原理

4．半抗原夹层法（Hapten Sandwich Method）首先用半抗原（FITC 等）标记的第一抗体与组织抗原结合，继之用 HRP（或 ALP）标记的抗 FITC 抗体与组织抗原结合的 FITC 的反应，呈色后观察抗原存在部位。FITC 为一种荧光色素，荧光显微镜下呈亮绿色荧光，所以也可以同时观察免疫荧光染色结果。FITC 特异荧光褪色后，其抗原性仍不丢失，从这种角度讲，荧光抗体法的切片亦能半永久保存。该法较一般间接法敏感性高，最大优点是不管第一抗体来自何种属，只要与 FITC 连结，均可被同一酶标记的抗 FITC 抗体识别。避免了准备不同种属的酶标抗体的麻烦，而且 FITC 标记抗体技术成熟、稳定，商品种类多，容易购买，实验者不妨一试。

第四节 ICC 的几种特殊应用近年 ICC 技术在下述方面的应用，令人注目，有着广阔的前景。现介绍如下：

一、ICC 在铺片中应用铺片（Whole Mount Stretch Preparation）是研究神经分布应用较早、较广的方法。19 世纪末，Dogiel 和 Cajal 等利用铺片技术，结合镀银及甲基蓝染色，观察肠道神经丛模式、神经元种类及其相关联的间质细胞。近年来，人们进一步认识到全层铺片技术的优点：例如①不必采用连续切片和三维重建技术，可以直接观察神经元间质细胞的三维结构；②能观察较大区域，在研究显微外科手术后神经分布模式和数量改变中有较好的应用价值；③操作简单，能在较短时间内制作大量标本等。所以，铺片技术在 ICC 染色中得到广泛的采用（Zhou 等 1992）

铺片 ICC 染色方法与切片基本相同，所不同的是铺片较厚，背景着色较强，有时甚至妨碍特异性染色的观察。实验证明，这种非特异性染色主要是酶标抗体 / 桥抗体与组织 γ - 球蛋白结合引起的，用封闭性阻断剂及正常血清等分别孵育切片，并在稀释抗体时，加入适量的 BSA，可以降低此类非特异性结合。BSA、封闭性阻断剂与 IgG（正常血清）的等电点不同，重叠应用，阻断效果尤佳。另外，铺片的细胞膜完整，不利于抗体的穿透，特别是 PAP 复合物等大分子物质，为此设法提高抗体的穿透性是非常重要的。采用反复冻融和表面活性剂前处理，有助于细胞内抗原的暴露。我们在实验中参考 Costa(1980)的制片方法，将组织铺片经系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次 10～15min）脱水，Hemo—d 2 次（10～15in/ 次），再水化（100%、90%、70%、50% 降酒精）等处理，辅助 Triton X-100 应用，明显增加抗体的穿透性，获得较为满意的染色效果。但是，并非所有的组织都能制成铺片，虹膜、肠系膜和小血管等适于制做全层铺片；食道、胃肠道、胆道、胆囊、大血管、输尿管等脏器则均需进行组织分层，再铺片，行 ICC 染色。

染色方法：以小肠分层铺片为例：

（1）4% 多聚甲醛或 Zamboni 液固定 2～6h，4℃，或丙酮固定。

（2）PBS 充分冲洗，置 PBS 中过夜。

（3）系列酒精脱水，Hemo—D 透明，降酒精至 PBS。

（4）分层铺片，直接漂浮染色或贴于载玻片风干，再染色。

（5）0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室温，PBS 冲洗。

（6）封闭性阻断剂 30in，室温，正常兔（羊）血清 30min，室温。

（7）第一抗体，孵育，4℃冰箱过夜；PBS2 次 /2min；重复第一抗体孵育（可稀释 1

倍），2～3h，室温，充分使抗体穿透至深层，使组织深层的抗原得以与抗体充分结合。

（8）PBS 充分冲洗，2～3h，4℃。

（9）酶标抗体孵育，4℃冰箱过夜。

（10）PBS 冲洗，呈色，观察与切片相同。

二、ICC 的双重染色法在某些物质活性检测、神经递质共存的研究、临床肿瘤的分型、定性，以及预后的估测等中，ICC 显示了巨大的优势，它不仅能与 Carbon、荧光色素、同位素追踪标记及其它组织化学方法（例如 PAS 染色法）结合，显示两种物质的共存，提示组织细胞的功能，而且本身亦可进行双重染色，研究一些抗原物质的共存，这里仅简单介绍 ICC 双重染色的几种方法。

（一）切片1．连续切片（Serial sectioning technique）连续切片是两种物质共存研究中应用最早的方法之一，是用相邻切片分别孵育两种不同特异性抗体进行 ICC 染色，主要适用于观察同一细胞内不同抗原的分布。该方法要求切片足够薄，保证每个细胞能同时出现在 3～4 张相邻切片上，第 1 和 3 张切片用相同抗体染色均阳性时，作为阳性结果，可信度较高，可避免结果判断困难。所以，常采用石蜡切片，厚约 2μm 左右，若用树脂包埋的半薄切片（0.5～1μm），比较容易识别同一细胞内两种抗原的共存。

2．镜影切片法（Mirror sectioning technique）所谓镜影切片，简单地讲就是两张相邻的石蜡切片（厚 2μm）或冰冻切片（厚 3～4μm），第二张反转之，贴于载玻片上，同一细胞在两张相邻的切片上呈镜与影的关系（相当于冰冻蚀刻电镜的 P 面和 E 面）。分别孵育两种不同抗体，ICC 染色，观察其在同一细胞内的分布。

（二）染色1．ICC 与荧光抗体法结合 首先染色显示 A 抗原，DAB/H2O2 呈色，继之用间接（直接）荧光抗体法显示 B 抗原，于光镜和荧光显微镜下观察，比较两种抗原的分布。因 DAB 终产物能够沿其表面向周围迁移，尤其是 DAB 浓度略高、反应时间稍长时，形成的终产物较大，可以遮盖该抗原抗体的反应部位，故两种染色间很少出现交叉反应。该双重染色的方法主要适于显示两种抗原分布不同细胞内，尤其 A 抗原浓度高、反应较强、DAB 终产物较牢固的情况。

2．同一切片的再度染色法（Restanining Method）用 ICC 法显示神经递质、神经肽等在神经细胞 / 神经纤维内共存时，连续切片、镜影切片及重叠染色往往很难判断同一神经纤维的共染，为此建立了同一切片再度染色法。该方法利用 4—氯—1—萘酚（CN）产物在酒精内的可溶性及酸处理能使抗原抗体解离的特点，首先第一种抗原用 CN 发色，染色阳性部位摄影；继之，用低 pH 的甘氨酸 / 盐酸缓冲液（0.2mol/ L 甘氨酸—盐酸缓冲液，pH2.2～2.3, 含 0.5mol/l NaCl）或盐酸孵育切片，去除第一次染色的抗体，再经 50%、70%、90%、100% 酒精脱 CN 色，PBS 洗净后染色第二种抗原，DAB 呈色后，摄影比较同一部位是否两种抗原共存在于同一神经纤维。为验证盐酸等处理效果，可省略第二次染色的特异性抗体，仅重复酶标抗体的染色，观察第一抗原阳性部位是否出现重叠着色。

3．同一切片、不同呈色的双重染色 ICC 法显示 A 抗原时，用 DAB/H2O2 呈色，终产物为棕褐色；继之，B 抗原染色，CN/H2O2 呈色，反应产物深蓝色，光镜下可同时观察两种抗原的局部所在。为避免第二次染色的抗体与第一次染色抗体之间的交叉反应，在 B 抗原染色前，可用酸性缓冲液处理切片，去除第一次反应的抗体，方法同 2。该方法 DAB 和 CN 的色彩对比不鲜明，而且 HRP 酶活性较强，酸性缓冲液中，亦能残存部位活性，所以可能有混合颜色出现，判定同一细胞内两种抗原共存常常有一定难度。

4．两种酶标抗体的双重染色 分别用 HRP 和 ALP 标记间接抗体，ICC 染色，显示两种不同的抗原。首先显示 A 抗原，HRP 酶标记间接抗体，CN/H2O2 呈色；继之显示 B 抗原，ALP 标记间接抗体，FR/As—Mx 呈色，轻度甲基绿 / 苏木精复染细胞核，一般可获得理想的结果，组织结构清晰，色彩对比鲜明。笔者应用此方法，显示小鼠脾脏巨噬细胞标记物 ED1、ED2 和 ED3 分布时，得到了较佳的染色效果。尽管该双重染色法应用了不同的酶标抗体，但常用其二者来自同一种属的抗体，所以在第一次染色部位，往往有重叠染色的现象。我们的经验为先染色反应较弱、含量较少的抗原，第一抗体用较高稀释度，酶标抗体则用高浓度（低稀释度），尽量使所有的第一抗体均被饱和，防止其与第二种酶标抗体结合；第二种抗体染色前，应用 PBS 充分洗净；第二种酶标抗体可用较高的稀释度。这样可避免“非特异”性重叠着色，色彩对比亦较理想。

5．不同种属来源的抗体的双重染色上述几种双重染色法，均系来自同一种属的特异抗体和相同 / 不同的酶标抗体，所以两次染色间常常有交叉反应。较理想的方法是用不同种属动物制备特异性抗体和两种酶标抗体的双重染色，例如显示 A 抗原为小鼠单克隆抗体，HRP 标记兔抗鼠 IgG；显示 B 抗原为豚鼠单克隆抗体，ALP 标记羊（驴）抗豚鼠 IgG，将两种抗体稀释最佳工作液浓度 1 /2，充分混合、孵育同一张切片，亦可分别染色。CN/H2O2 呈色后，FR—As—Mx 呈色，光镜下观察两种抗原的分布。该方法两种抗体间无交叉反应，特异性较高，即使细胞内抗原量较少也能发现。但当两种抗原存在同一部位，其中之一浓度较高、占绝对优势时，亦将妨碍另一种抗原的染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。该方法要分别制备 4 种不同的特异性抗体和酶标抗体，费时费力，实际应用受一定限制。

上述两种双重染色，两种酶标抗体的非特异性着色可能迭加，致使背景着色较单独使用时增强，S/ N 下降，所以各研究室应根据实验目的和条件，合理选择染色方法为宜。简述染色步骤如下：

（1）切片准备同一般间接法。

（2）切片孵育 A 抗原，特异抗体 1～2h 室温。

（3）PBS 冲洗，孵育 HRP 标记抗体 45min，室温。

（4）PBS 冲洗，孵育 B 抗原的特异抗体 1～2h，室温。充分漂洗，孵育 ALP 标记抗体，45～60min。

（5）PBS 冲洗，Baker’液固定 5min，室温，PBS 洗净。

（6）呈色 CN/H2O2/TBS 15min，室温。

（7）Tris—HCl(pH9.0)冲洗后，Fr AS—Mx 呈色 8min,37℃。

（8）轻度 PBS 冲洗，1% 戊二 醛固定 5min。

（9）水洗，轻度复染细胞核，水溶性封固剂封片。

（10）光镜下观察。双重标记细胞呈暗红至深紫色，与单独阳性细胞有明显区别。

三、ICC 在细胞功能研究中的应用形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用 ICC 显示给与细胞增殖标记物，是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有 4 种，Brdu (5—bromo—2–deoxyuridine), DNApolymerase α,PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相对应的 4 种单克隆抗体均有商品出售。因组织细胞内无内源性 Brdu 存在，所以 Brdu 应用较广。Brdu 为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在 DNA 合成期（S 期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗 Brdu 单克隆抗体，ICC 染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射 Brdu（Sigma）4mg/150～200g 体重，分别在给药后 1h 和 1、2、3、5、7 天取小肠，应用抗 Brdu 抗体，ICC 染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射 Brdu 后，计数瞬间进入 S 期细胞数或连续多次注射 Brdu，计数注射 Brdu 期间进入 S 期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与 Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。

掺入双链 DNA 内的 Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗 Brdu 抗体反应，需经解链使 Brdu 暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使 DNA 双链部分单链化，抗 Brdu 小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的 Brdu 结合，再经酶标抗小鼠 IgG 抗体孵育、呈色，显示进入 S 期细胞的情况。

盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链 DNA 的 Brdu 反应，因为培养液上清中含有 DNA 酶，可分解双链 DNA，显露 Brdu，达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。简述染色步骤如下（Matsuna,1989）：

（1）冰冻切片 / 石蜡切片准备同前。

（2）TBS 冲洗，Baker’s 液固定 10min，室温。

（3）TBS 冲洗，1% 戊二醛固定 5～10min，室温。

（4）双蒸水冲洗，0.006%(冰冻切片)或 0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶 /0.01mol/l HCl,37℃，10min。

（5）双蒸水冲洗，4N HCl 30min，室温。

（6）PBS 充分冲洗，使切片 pH 回至中性。

（7）封闭性阻断剂 20min，室温。

（8）抗 Brdu 抗体孵育 1～2h 室温或 4℃过夜。

（9）PBS 冲洗，HRP 标记抗小鼠 IgG 抗体 45min，室温。

（10）PBS 冲洗，DAB/H2O2 呈色。

（11）轻度苏木精复染，脱水透明，封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。

采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示 Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经 1% 戊二醛固定 5～10min，重复上述程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用 ALP 标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。

四、ICC 在原位杂交技术中的应用传统的 ICC 法主要用于检测组织细胞中含有何种物质，根据该物质的作用，推测其组织细胞生理、病理意义。但该物质来自何处，是否是阳性细胞合成往往较难判断，结合免疫电镜及双重染色等方法，在某种程度上，有助于推断该物质的来源。然而通常 ICC 法显示的是组织细胞已经合成的物质（过去时），本身不能说明阳性组织细胞目前的功能状态，亦无法预测细胞将合成何种物质，发挥什么功能，因此，单纯的 ICC 法存在着被动性。

近年来，ICC 法与原位杂交技术结合，使细胞内活性 DNA 可视化，直接显示某染色体上，何种基因活性化或非活性化，描述组织细胞现在的状态，同时亦可预知未来组织细胞将合成何种物质，发挥哪些功能等，直接观察组织细胞的时空改变，这在病理生理研究中有着重要意义，为形态学研究开辟了令人瞩目的前景。

众所周知，机体内不同的蛋白质发挥其特定的功能，与其氨基酸序列密切相关，而它的氨基酸序列又是 DNA 通过 mRNA 转录控制的。因此检测该 DAN/mRNA 的分布，可判断组织细胞的功能状态。为在组织细胞水平检测 DNA/mRNA 等一定碱基序列的核酸存在与否，Gall（1969）等建立了原位杂交方法（详见第二十章）。

在检测某种特定的蛋白质在哪一类细胞内合成时，常常应用连续切片或镜影切片，原位杂交法显示合成该蛋白质的 mRNA，ICC 法染色其蛋白质抗原，二者存在于同一细胞时，具有较强的说服力。同一切片进行上述双重染色时，原位杂交步骤中，大多数抗原物质的抗原性往往易被破坏，所以最好在 ICC 染色后再进行原位杂交染色。ICC 染色中，抗体内含有 RNase 等可能破坏细胞内的 mRNA，为此应选用精制 IgG 抗体，并加入 500u/ml 肝素抑制 RNase。肝素系酸性多糖，其化学性质与核酸类似，能够与以核酸为底物的酶（RNase）结合，从而保护 mRNA 免受破坏。另外，ICC 染色以 DAB 呈色时，核酸探针易吸附于 DAB 产物上，需注意。

近年随着细胞工程的进步，ICC、原位杂交技术将在细胞生物学、组织学、遗传学、病毒学、临床疾病诊断等各个领域，得到更广泛地应用。

参考文献1.BigbeeJW,et al . Effects of primary antiserum dilution on staining of antlgen richtissue with the peroxidase antiperoxidase technique. j Histochem Cytochem. 1977；25：433～447

2.BorrsmaDM. Preparation of HRP Iabelled antibodies。In Cuello AC(ed) lmmunohistochemistry, JohnWiley&,Sons, New York：Bris-bane Toronto Singapore, 1983：87～100

3.ConchoroffNJ, et al . A monoclonal antibody reactive with 5—Boromo—2 deoxyuridine thatdoes not requireDNA denaturation。Cytometry,1985；6t506～512

4.CostaM, et al. Immunohistochemical localization of polypeptides in peripheralautononic nerves using whole mount preparation, Histo-chemistry, 1980；65：157～165

5.CummingR. Cyclic nucleotide losses during tissue processing for immunohistochemistry。j HistochemCotychem, 1980j28：54～55

6.GallJG, Paudue M. Formation and detection of RNA—DNa hybrid molecules incytological preparations. Proc Natu Acad Sci USA, 1969：63,378～383

7.GrzannaR, Light microscopic immunocytochemistry with fixed unembedded tissue, InBullock GR&Petrusz P·(eds.)Techniques in immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：183～204

8.KohlerG, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined speciflcity, Nature,1975；256：495～497

9.ImagawaM, et al. Characteristic and evaluation of antibody horseradish peroxidaseconjugates prepared by using maleimide compound,glutaraldehyde and periodate. JBiochem, 1982 j 4：41～57

10.Li CY,et al. Use of azide and hydroRen peroxide as an inhibitor for endogenousperoxidase in the immunoperoxidase method , J Histochem Cytochem, 1987；35：1457～1640

11.Matsuno K, et al. Splenic outer periarterial lymphoid sheath (PALS)：An immunoproliferative microen-vironment constituted by antigen laden marginal metallophils and ED3 positivemacrophages in the rat. Cell Tissue Res, 1989；257：459～470

12.NakanePK, Pierce GB. Enzyme labelled antibodies：Preparation and application for thelocalization of antigens。j Histochem Cytochem, 1966；14：929～931

13.NorrdenSV, Polak JM. Immunocytochemistry today techniques and practice, In PolakJM&Norrden SV(eds.) Immunocytdchemistry. London：Wright PSG Bristol, 1983：11～42

14. OiVT, Herzenberg LA. Imrnunoglobulin producing hybrid cell lines. In Mishell BBand Shiigi SM, (eds.) Selected methods in cellular immunology, San Francisco：Freeman WH and Company, 1980：351～375

15. SatoY, et al . The AMeX method. A simplified technique of tissue processing andparaffin embedding with improved preservation of antigens for immunostaining.Am J Pathol, 1986；125：431～435

16.Shi SR,et al . Antigen retrieval in forrnalin fixed,paraffin embedded tissue：An enhancement method forimmunohisotchemical staining based on microwave oven heating of tissue sections。j Histochem Cytochem, 1991；39：741～748

17.SternbergerLA, et al . The unlabelled antibody enzyme method of immunohistochemistry.Preparation and properties of soluble antigen –antigody complex (horseradishperoxidse antihorseradish peroxidase) and its use in the identificationspirochetes, J Hsitochem Cytochem, 1970；18：315～333

18.Sternberger LA, Immunocytochemistry。New York：John Wiley&Sons, 1979

19.SternbergerLA, Conjugated antibody method. In：Sternberger LA(ed) Immunocytochemistry。3rd edi—tion, New Yor：John Wiley&Sons, 1986

20. VaccaLL. Double bridge technique of immunocytochemistry.In：Bullock GR&Petrusz P. (eds,)Tech. niques in Immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：155～182

21.Yasuda K, et al. Application of ultrasound for fixation：Combined use with microwave toenhance the effect of chemical fixation. Acta Histochem Cytochem, 1992；25：237～244

22. ZhouDS, Komuro T. Interstitial cells associated with the deep muscular plexus ofthe guinea—pig small intestine, with special reference to the interstitialcells of Cajal. Cell Tissue Res, 1992；268：205～216

第五章 免疫金银及铁标记技术第一节 免疫金技术发展史早在一个世纪以前，化学家就对胶体金进行了研究，当时只是研究它的结构和金属性质。在 1939 年 Kausche 和 Ruska 把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察见金离子呈高电子密度。然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在 1971 年，Faulk 和 Taylor 首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。此后，他们还把胶体金与抗胶原血清，植物血凝素，卵白蛋白，人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1974 年 Romano 和他的同事们将胶体金属标记在马坑人的 IgG 上，实现了间接免疫金染色法。1974 年 Bauer 等报道凝集素—金复合物的应用。1978 年 Geoghe-gan 等应用免疫金技术检测 B 淋巴细胞表面抗原。1981 年 Danscher 建立了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法（Immunogold—sliver staining, IGSS）。到了 1986 年 Fritz 等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目。胶体金技术逐渐得到完善和成熟，近10年来此项技术得到了迅速发展和广泛应用。应用胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞和组织结构，可以定性，定位以至定量研究。目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域。

第二节 溶胶的基本概念一、胶体金即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性。分散体系的分类：体系就是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系。被分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类。

（一）离子分散体系

指分数散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来。

（二）胶体分散体系

是指分散相颗粒在 1～100nm 之间的分散体系叫做胶体分散系。胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。

（三）粗分散体系

分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明。

二、胶体金的一般性状（一）胶体金的颜色

溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在 5～20nm 之间，吸收波长 520nm，呈葡萄酒红色，20～40·nm 之间吸收波长 530nm，液体为深红色，60nm 的金溶液主要吸收波长 600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。

（二）胶体金的稳定性

溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的颗粒作布朗运动，不易受重力影响下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。

（三）溶胶的聚沉现象

胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶颗粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶颗粒带电量减到很小甚至中和；其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：

1．少量电介质对溶胶的聚沉作用 少量电介质即可使溶胶聚沉，但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的离子价规则：①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价的增加而显著增加。电介质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电介质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电荷量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小的溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构见图 5 -1。

图 5 - 1 胶粒的双电层结构示意图

2．温度对溶胶稳定性的影响 一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。

3．浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。

第三节 胶体金的制备方法胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

一、制备胶体金的准备（一）玻璃器皿的清洁

制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾 1000g, 加入浓硫酸 2500ml，加蒸馏水至 10000ml）浸泡 24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗 3～4 次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗 3～4 次，再用双蒸水把每个器皿洗 3～4 次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。

（二）试剂的配制要求

（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将 lg 的氯化金一次溶解于双蒸水中配成 1% 的水溶液。放在 4”c 冰箱内保存长达几个月至 1 年左右，仍保持稳定。

（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。

二、制备胶体金的方法和步骤（一）白磷还原法1．白磷还原法（zSigmondy 1905 年）

（1）取 1% 的 HAuCl4水溶液 1ml，加双蒸水 99ml 配成 0.01% 的 HAuCl4水溶液。

（2）用 0.2mol/lK2CO3调 pH 至 7.2。

（3）加热煮沸腾，迅速加入 0.5ml20% 白磷的饱和乙醚溶液，振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为 3nm 左右，大小较均匀。

2．白磷还原法（zSigmondy 1905 及 z Sigmondy Thiessen 1925）

（1）取 0.6% 的 HAuCl4水溶液 2.5ml, 加双蒸水 120ml。

（2）用 0.2mol/lK2CO3, 调 pH 至中性。

（3）加入 1 / 5 饱和度的白磷乙醚溶液 1ml（1 份白磷 4 份乙醚），在室温振荡约 15min，溶液呈红褐色，再加热至典型的葡萄酒红色，加热可使乙醚蒸发，胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化，此方法获得胶体金颗粒的直径在 5～12nm 之间。

3．白磷还原法的改良法（Henegouwen1986）

（1）取 20% 饱和度白磷乙醚溶液 0.5ml, 加双蒸水 60ml。

（2）用 1% 的 HAuCl4水溶液 0.75ml, 加 0.1mol/l K2CO30.6ml, 振荡变成棕红色。

（3）加热煮沸，至溶液变成透明红色。

使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大，二者之间的关系见表 5 -1。

表 5 -1 胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系

还原次数颗粒直径（nm）正负误差15.60.926.70.937.90.949.81.35121.0此方法主要优点是简化了制备不同大小的颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制, 经济、操作简单。另外，在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用。由于这一特点，制备的金颗粒相对均匀一致。

（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）（1）将在 4 ℃预冷的 1%HAuCl4水溶液 1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、双蒸水 25ml 混匀。

（2）在搅拌下加入 1ml0.7% 抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。

（3）加双蒸水至 100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为 8～13nm。

（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）此方法是由 Frens 在 1973 年创立的，制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将 0.01% 的 HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量 1% 柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸 7～10min 出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表 5 -2。

表 5 -2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

0.01% 的 HAuCl4（ml）1% 柠檬酸三钠(ml)直径（ml）1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160按照 Frens 法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。

（四）鞣酸—柠檬酸三钠还原法（Slot 与 Gueeze1985 年）该法是以 1982 年 Muhlpfordt 法为基础，1985 年 Slot 与 Geuze 对该法进行了改良，特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，而且颗粒的直径均匀一致，很适合于双标及多标研究。制备 3nm、5nm、10nm、15nm 的胶体金颗粒见表 5 -3。

表 5 -3 鞣酸—柠檬酸三钠还原法

A 液B 液直径（nm）1% 柠檬酸钠（ml）0.1mol/L K2CO3ml1% 鞣酸（ml）H2O（ml）1%HAuCl4（ml）H2O（ml）3.340.2411.8179540.20.715.11791040.0250.115.8751791540.00250.0115.987179操作步骤：

（1）根据所需要的胶体金颗粒分别配制 A 液和 B 液。

（2）将配制好的 A、B 两液在水浴内加热到 60℃，并通过控温装置使温度保持稳定。

（3）在电磁搅拌器上搅拌 A 液迅速加入 B 液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，时间大约 7～10min。在 A、B 两液混合后可见溶液立即变成蓝色，大约 1～3min 就变成红色。

用鞣酸—柠檬酸三钠还原法，柠檬酸三钠主要为还原剂，而鞣酸则有双重作用，一是还原作用，二是保护作用，控制“晶核”的形成过程，也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成，因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小，达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。

（五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）（1）1%HAuCl4水溶浓 0.2ml 加入 100ml 双蒸水。

（2）用 0.2molK2CO3调 pH 至中性，再加入 1ml 乙醇。

（3）用 20KC、125w 超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为 6～10nm。

（六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）（1）将预冷在 4 ℃的 40ml 双蒸水中加入 0.6ml 1% 的 HAuCl4。

（2）再加入 0.2molK2CO3，0.2ml。

（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/ml）0.4ml, 一般重复加入 3～5 次，直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌 5min，获得的金颗粒直径在 2～5nm 之间。

（七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）（1）取 0.01%HAuCl4上水溶液 100ml，加热至沸腾。

（2）加入 40μl195Au。

（3）迅速加入 4ml1% 柠檬酸三钠水溶液，5～7min 出现透明的橙红色。

（4）其含量为 I×106脉冲数 /min。

（八）微波制备液体金方法。

第四节 胶体金的质量鉴定胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能应用。

一、胶体金颗粒直径测定用预先处理好的覆有 Formvar 膜的镍网浸入胶体金溶液内，取现放在空气中干燥或 37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小，符合不符合所需要的颗粒直径，金颗粒是否均匀一致，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。

二、胶体金金颗粒均匀度测定一般需测量 100 个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。

三、影响胶体金颗粒大小的因素如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备了合格的胶体金以后，放在室温或 4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置 3 个月左右。冰箱内半年左右。根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在 20 天以内进行标记。

第五节 胶体金标记物的制备胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于 pH 值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果=低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果 pH 高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作稳定剂。用 Sephacryb S—400（丙烯葡聚糖 S—400）层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以 BSA 作稳定剂者。

一、待标记蛋白质的准备（1）透析除盐：蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的 Zeta 电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/l NaCl , pH7.0）透析。

（2）去除蛋白质中的沉淀：长期低温保存的蛋白质或 4 ℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于 2mg/ml 的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以 100000r/min 4℃离心 60min 取上清液，调整蛋白质浓度至 1mg./ml 即可用于标记。

二、胶体金 pH 值的调整胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于 pH 值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的 pH 值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的 pH 值时可用 0.1molK2CO3，需要降低胶体金的 pH 值时可用 0.1n HCl。测定金溶液的 pH 可能损害 pH 测定计的探头，因此，一般用精密的 pH 试纸测定其 pH 即可。

几种常用的蛋白质标记时胶体金所用的 pH 值见表 5 -4。

表 5 -4 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的 pH 值如下

蛋白质pH抗体（γ 球蛋白）9.0亲合层析的 IgG7.6单克隆抗体8.2F（ab＇）27.2SPA(葡萄球菌蛋白)6.0蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0花生凝集素6.3Helix pomatia lectin7.4大豆凝集素6.1Lens Culinaris lectin6.9Lotus Tetragonolobus lectin6.3荆豆凝集素6.3Bandeirae simplicifolia lectin6.2过氧化物酶8.0类卵粘蛋白4.8血浆铜兰蛋白7.0α- 胎球蛋白6.5小牛血清白蛋白6.5牛血清白蛋白5.5牛血球白蛋白结合肽4.5牛血清白蛋白结合胰岛素5.3霍乱毒素6.9破伤风毒素6.9DNAase6.0RNAase9.0低密度脂蛋白5.5α2- 巨球蛋白6.0抗生物素蛋白（亲合素）10.0链霉抗生物素蛋白6.6麦胚凝集素9.9三、待标记蛋白质最适稳定量的测定（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入 5ml 胶体金中，迅速混匀，然后，各加入 1ml 10% NaCl 溶液，摇匀，静置 5min 后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD 在 520～580nm 之间测定，以 OD 值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图 5.2 中 10nm 的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为 45μg/ml。

图 5 -2 蛋白最适稳定量示意图

（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg 另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有 1ml 胶体金的试管中，5min 后，在上述各管内分别加入 0.1ml 10% 氯化钠，依表 5 - 5 顺序进行。

表 5 -5 具体的做法是按表内进行

管数12345678910胶体金（ml）1111111111蛋白质（μg）5101520253035404510%NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1①当分别加入 0.1ml 10% 氯化钠后、混匀静置 2h 以上观察结果。

②没有加入蛋白质的管为对照管。

③小于 5nm 颗粒的胶体金溶液，每个管内应加入 5μl33% 的双氧水，否则有不变蓝色及聚沉现象。未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定 1ml 胶体金的必须蛋白量。在此基础上再加上 20% 即为稳定所需蛋白质的实际用量。

四、蛋白质的胶体金标记当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳 pH 值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：

（1）根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。

（2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH 已调至 PI 超过 0.5pH），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg 的蛋白质大约 5min 加完。

（3）在磁性搅拌下加入 5% 的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为 1%，或加入 3% 聚乙二醇（PEg MW20000）使其终浓度为 0.05%, 我们对比了 BSA 和 PEG 稳定胶体金的效果，BSA 稳定的标记胶体金，放在 4 ℃达 2 年半仍然保持良好性能，而用 PEG 稳定的标记胶体金放在 4℃1 年左右就有分层现象，而且染色效果显著下降。因此，我们认为最好还是用 BSA 作稳定剂。

（4）将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的 1 /10 量，浓缩完毕后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。

五、胶体金标记蛋白质的纯化标记好的免疫金探针必须经过纯化处理以后才能用于免疫细胞化学染色。纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。

（一）调整与超速离心法（1）将标记的大于 10nm 的胶体金溶液选用 15000r/min 4℃离心 15min，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物。

（2）一般在 10nm 以上所标记的胶体金均可在调整离心机上离心，小于 10nm 颗粒的胶体金用超速离心机离心，在 4 ℃离心 1h 左右，弃上清，将沉淀以原体积的 0.02mol./l TBSpH8.2（内含 1%BSA，0.05% 叠氮钠）溶解，重复离心 2～3 次，沉淀溶于原体积的 1 /10TBS 中。4℃保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用 10%～30% 蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。

几种免疫金探针离心所用转速（见表 5 -6），离心纯化时所用转速见表 5 -7，胶体金的 OD 值见表 5 -8。

表 5 -6 几种免疫金探针离心时所用转速参考表

胶体金颗粒直径（nm）蛋白质时间（min）转速（r）3.0GAR IgG60300005.0GAR IgG502500010.0RAM IgG501900015.0SPA401700015.0ALcc IgG401700020.0SPA401300025.0SPA3512000说明：GAR IgG= 羊抗兔 IgG；RAm IgG= 兔抗鼠 IgG；ALcc IgG= 抗肝细胞癌 IgG; SPA= 葡萄球菌 A 蛋白

表 5 -7 几种免疫金探针离心纯化时所用转速

胶体金颗粒（nm）pH蛋白质转速（xg）时间（min）59.0羊抗人 IgG4500045108.2抗胃癌单克隆抗体4500030156.5链霉亲和素1200045206.0SPA1200030将纯化好的胶体金用 0.02mol/l TBS 缓冲液作 1：20 稀释，用 520nm 测 OD 值。

表 5 -8 不同大小胶体金的 OD 值

胶体金颗粒大小（nm）OD（520）nm52.5102.5153.5205.0（二）凝胶过滤法为纯化免疫金探针的最好方法，其特点是简便，过滤的胶体金颗粒比较均匀，不容易凝集，而离心方法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀容易凝集，用凝胶过滤克服了这一弱点。选用本方法时胶体金溶液必须用牛血清白蛋白作稳定剂。具体操作过程如下：

（1）将浓缩好的胶体金以 1500r/min 离心去掉大的聚合物。吸出上清待过柱。

（2）柱高 34cm, 直径 1cm, 加样体积为柱床体积的 1 /10。

（3）丙烯葡聚糖 S -400（Sephacryls—400, Pharmacia, Sweden）装柱后用 0.02mol/lpH8.2TBS 平衡层析柱（pH7.4 者用于标记的 SPA），平衡好后，吸取上清胶体金液体加入层析柱内，加样时请注意不要破坏 S—400 的界面。

（4）用 0.02mol/lpH8.2 TBS 洗脱，先行滤出的液体有少量微黄不透亮的液体，紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金，注意颜色的变化，如红色变淡，变黄立刻停止收集。如 Sephacryls—400 没有，也可以用 Sepharose –4B 或 6B 代替（Pharmacia,Sweden）也能收到较好的效果。

六、免疫金探针的鉴定（1）用有 Formvar 膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀复染，在 TEM 下观察，可见金颗粒周围有一明显的空晕，表示颗粒表面吸附有蛋白质分子。

（2）纯化后免疫金探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标，因此，在使用之前必须对它的特异性，敏感性进行鉴定。鉴定举例，用阳性抗原片，脱蜡至水，胰蛋白酶消化，加第一抗体（多克隆或单克隆），一般过夜再加标记抗同一抗特异性抗体结合的胶体金溶液（多克隆或单克隆抗体标记的胶体金）详细方法步骤见后 IgGS 法，一般做 1：2，1：4，1：8，1：16，稀释 SPA- 金，做 1：10，1：20，1：40，1：80 稀释，37℃45min，冲洗，显色，观察结果，染色效价以阳性结果明确，背景浅的稀释度为标准。免疫细胞化学染色试验可以较全面地反应免疫金探针的质量。

第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择免疫胶体金银染色和其它免疫细胞化学方法一样，要想得到好的染色效果，关键取决于标本处理是否合适，只有使抗原性及组织结构保存的好，才能使以后的染色成功成为可能，其次要用高特异性和高效价的一抗，选择合适的稀释度。由于免疫组化方法广泛应用于不同的生物学科，所要检出的抗原种类繁多，性质也各不相同。因此，不可能有一种适用于所有抗原的固定剂，而是根据不同的抗原性质区别对待。根据我们使用的固定剂介绍如下，供参考。

一、固定剂的选择及固定时间（详见表 5 -9）（1）Karovsky＇s 液 pH7.3。

（2）PAP 液（Periodate—lysine – paraformaldehyde fixative）

配制见附录一。

表 5 -9 各种抗原固定剂的选择及固定时间

待检抗原固定剂的种类固定时间蛋白质酶冰冻切片不固定，或用 95% 乙醇，B5固定液10 min激素冰冻切片，涂片，印片，不固定或丙酮，甲10 min醇，乙醇，PEG 固定，B5固定液固定4℃30 min免疫球蛋白中性福尔马林，四氯化碳（1% 甲醛）30 min白蛋白95% 乙醇含 1～5% 冰醋酸30 min纤维蛋白元同上30 min病毒丙酮，100% 乙醇，甲醇，乙醚30 min糖蛋白PLP，丙酮30 min脂质 Forssman中性福尔马林20 min抗原2.5% 硫代硫酸钠，冰冻切片不固定20 min免疫电镜PLP，戊二醛，戊二醛—多聚甲醛（Kacnovsky’s 液 pH7.3）PEG、ECD- G 等30min二、切片的处理与粘附。免疫组化染色过程较长，洗的次数很多，而且均在振荡洗涤，抗原片附贴不紧，往往在最后的时刻，还没有等显色就会脱落导致前功尽弃，这个环节 虽小却会影响大局，因此，为了保证切片染色成功必须把切片处理好，解除掉片的后顾之忧（方法见第一章）。

第七节 光镜免疫金银细胞化学方法一、免疫金染色（一）免疫金法（IGS）1987 年，Geoghegan 等首次应用免疫金探针检测 B 淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS）。IGS 的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于 20nm，并且用的浓度较高。用 IGS 定位细胞抗原时一般都采用间接法，下面以人肝组织 HBsAg 的定位为例说明 IGS 的步骤：

（1）石蜡切片→脱蜡至水。

（2）0.1% 胰蛋白酶消化 10min 或 3mon/ L 尿素消化 30min。

（3）用双蒸水振洗 5＇×2。

（4）用 0.02mol/l TBS pH8.2 振洗 10＇×2。

（5）1% 卵蛋白（EA）封闭 10min。

（6）稀释鼠抗 HBsAg 单克隆抗体（用 0.02mol/l TBS pH8.2 作 1：100 稀释），4℃过夜。

（7）0.02mol/l TBS pH8.2 振洗 10＇×2。

（8）1%EA 封闭 10min。

（9）0.02mol/l TBS pH8.2 稀释兔抗鼠金标抗体（1：8）37℃45min。

（10）0.02mol/l TBS pH8.2 振洗 10＇×2。

（11）双蒸水振洗 5＇×2。

（12）1% 戊二醛，10min。

（13）双蒸水 5min。

（14）用苏木素衬染核 1min，甘油封片。

结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有 HBsAg 定位在细胞浆内。

（二）蛋白 A - 金（PAG）放大法为了得到更明确的染色结果，在用 IGS 方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使 IGS 得到放大，这里介绍一种用抗 A 蛋白抗体作桥的 PAG 放大法。下面以 5 - 羟色胺定位为例说明这一新方法。

（1）石蜡切片→脱蜡至水。

（2）1% 胰蛋白酶消化 10min 或 3mon/ L 尿素消化 30min。

（3）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 5＇×2。

（4）1%EA 封闭组织 10min。

（5）用 0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗 5 - 羟色胺抗体（1：1000）4℃过夜，或者 37℃1h。

（6）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 5＇×2。

（7）1%EA 封闭 10min。

（8）用 0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释 PAG（1：40），37℃1h。

（9）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 10＇×2。

（10）1%EA 封闭 10min。

（11）抗 A 蛋白抗体（1：100）37℃。45min。

（12）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 10＇×2。

（13）加 0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释 PAG（1：40），37℃45min。

（14）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 10＇×2。

（15）双蒸水振洗 5min。

（16）1% 戊二醛 10min。

（17）双蒸水振洗 5min。

（18）0.01% 伊文思蓝 2min，甘油封片。

光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用 PAG 染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗 A 蛋白抗体既能通过 Fab 段又能够通过 Fc 段与 PAG 上的 A 蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图 5 -3。

图 5 -3 PAG 放大法原理

PAG 放大法的优点：①使用试剂单一；②可大大提高 IGS 的敏感性，从而使应用 IGS 方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。

二、免疫金银法1983 年，Holgate 等人将 IGS 与银显影方法相结合创立了免疫金银法（Immunogold—sliver staining, IGSS）IGSS 的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ago）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终抗原位置得到清楚放大。请参见图 5 -4。

图 5 -4 用银增敏示意图

（一）石蜡切片的 IGSS 染色以人肝细胞内 HBsAg 定位举例说明。

（1）切片常规脱蜡至水。

（2）Lugol＇s 液，5min.

（3）5% 硫代硫酸钠水溶液脱碘 5min。

（4）用双蒸馏水冲洗干净。

（5）0.05mol/l pH7.4 TBS 洗 5min 两次。

（6）用 0.1% 胰蛋白酶消化 10min 或用 3mol/ L 尿素消化 20min。

（7）0.05mol/l pH7.4 TBS 洗 5min 一次。

（8）1% 卵白蛋白封闭 15min。

（9）马抗 HBsAg 抗体 1：1000 稀释，37℃1～2h 或 4℃过夜。

（10）0.05mol/l pH7.4 TBS 洗 5min 两次。

（11）1% 卵白蛋白封闭 10min。

（12）1：40，PAG，37℃45min。

（13）0.05mol/l pH7.4 TBS 洗 5min 两次。

（14）双蒸水洗 5min，两次。

（15）物理显影见后所述。

（16）双蒸水洗 5min，两次。

（17）苏木素衬染。

（18）酒精常规脱水，透明，封固。

结果，光镜下见肝细胞胞浆内有膜或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。

（二）冰冻切片的 IGSS 染色作冰冻切片的组织，若在动物试验可以先经过固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰冻切片。人的组织也可通过浸泡固定或不固定，这主要根据保存抗原性的需要而定。固定过的组织可用 20% 蔗糖 PBS（0.01mol/l pH7.2）浸泡 2～4h 或在切片时用 OCT 包埋，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。如果切片还准备用于电镜包埋，则可经过 5%，10%，20% 浓度逐级递增的蔗糖溶液。在冰冻切片前，可先入氟里昂–22（Freon–22）骤冷，这样可使组织的结构保存更好，适用于电镜观察。

（1）冰冻切片。

（2）Lugol＇s 液，5min.

以下步骤同人肝 HBsAg 的染色方法。

（三）半薄切片的 IGSS 染色IGSS 染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镱取阳性部位及观察打下良好的基础。环氧树脂会妨碍免疫组化染色。经过饿酸处理后固定的组织同样也会影响抗原抗体反应，因此，半薄切片作 IGSS 染色剂，应作以下处理。

（1）脱环氧树脂，切片以 NaOH 的无水乙醇饱和溶液浸泡 30～60min，然后以无水乙醇洗 5min，两次，再以 95%，80%，70% 酒精各洗 5min，然后入水。

（2）经饿酸固定过的切片入 1% 过碘酸 10min（0.5μm 厚，时间可随切片厚薄增减）除去饿酸，然后蒸馏水洗 5min，4 次。

（3）切片用 0.05mol/l TBS,pH7.4 洗 10min。

（4）按石蜡切片第二步往下进行。

三、彩色免疫金银法（CIGSS）彩色免疫金银法（coloured IGSS 简称 CIGSS）是在 IGSS 基础上发展起来的一种新方法。其基本原理与彩色显影相似。IGSS 方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。

以彩色显影人肝组织内 HBsAg 的操作过程为例：

（1）脱蜡至水。

（2）0.1% 胰蛋白酶 37℃10min。

（3）Lugol＇s, 碘液 5min。

（4）5% 硫代硫酸钠 1min。

（5）用 0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 5min，两次。

（6）1% 卵白蛋白封闭 10min。

（7）马抗 HBsAg 抗体 1：1000 稀释，37℃1～2h 或 4 ℃过夜。

（8）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 5min，两次。

（9）1% 卵白蛋白封闭 10min。

（10）PAg 1：40，37℃45min。

（11）0.05mol/l pH7.4 TBS 振洗 5min，两次。

（12）双蒸水洗 5min，两次。

（13）物理显影（见 P116 页物理显影配方）。

（14）自来水冲洗。

（15）双蒸水洗 5min，两次。

（16）2% 铁氰化钾和 1% 溴化钾，1min。

（17）双蒸水冲洗。

（18）彩色显影（α- 萘酚或菲尼酮）2min。

（19）双蒸水冲洗。

（20）2% 铁氰化钾和 1% 溴化钾，1min。

（21）2% 铁硫代酸钠和 1% 亚硫酸钠，5min。

（22）流水冲洗。

（23）如需要可用苏木素或核红复染。

（24）缓冲甘油封固，观察。

结果：CIGSS 的优点：①阳性结果比黑色更鲜明;②可以使弱信号得到放大;③消除 IGSS 背景染色;④信号 / 背景比值高;⑤是开展免疫金银双标技术的新途径. 光镜下见 HBsAg 阳性物质呈鲜艳的蓝色 (α- 萘酚为成色剂) 或呈绿色(菲尼酮为成色剂)。背景干净，阳性结果清楚。

四、免疫金及免疫金银技术的优点免疫金银技术（Immunogold—sliver Technique）是在免疫金基础上发展的新兴的先进的免疫细胞化学检测技术，它比免疫荧光，免疫酶标技术有许多独特的优点。

1．制备方法简单，易行。

2．标记简单 抗体、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联，抗体的生物活性可保持不变，标记方法简单容易。

3．适用范围广 胶体金银技术既能用于光镜也能用于透射及扫描电镜，同时还可用于 X 线能谱分析。在荧光显微镜上添置一块特制的滤板（IGs filter block）还可直接对胶体金颗粒进行观察，金颗粒在荧光显微镜下呈现明亮的点状物，定位准确，敏感性高，标本可长期保存。

4．特异性强 免疫金探针的非特异性吸附作用小，较少受生物组织背景因素的影响，在抗原或抗体的检测中显示出高度的特异性。

5．敏感性高 由于金颗粒的电子密度很大特别适合透射电镜及扫描电镜，因此，免疫金银法用于电镜，其检测抗原或抗体率远远超过酶反应物，从而大大改进了免疫细胞化学技术在电镜水平上的分辨率。光镜下金颗粒经过银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时其敏感性比 PAP 法高 200 倍。我们检测肝炎表面抗原时比 ABC 法高 6 倍，是至今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适合于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。

应用彩色 IGSS 和 IGSS 双标及多标记，可在同一张切片上检测两种以上的抗原成份。胶体金可以制备成不同大小的颗粒，将不同直径的胶体金分别标记不同的抗体或抗原，可以在同一张标本上同时区分出两种或两种以上的抗原或抗体，非常适用于电镜水平的双标和多标记，为研究细胞内抗原及多种抗原的表达及各种抗原分子相互之间的关系等提供了最佳手段。

免疫金银技术是新兴的科学技术，目前许多实验室越来越广泛地采用这一新技术，从而使它的发展有了扎实的基础。用免疫荧光、免疫酶技术、放射免疫技术可做的工作，均可使用免疫金银技术。另外，这一新的方法在其它技术的配合下不断地得到更新与进步，使它能经常增添新的内容，特别是免疫金和胶体金示踪作为一门独特的新技术将在生物医学及其它领域的研究中发挥着越来越大的作用。

五、在 IGSS 染色中常见技术问题和对策（一）背景染色产生的原因和防止方法

（1）第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数（见第一章），即可避免非特异性染色，又可节 省抗体。

（2）使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。

（3）显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必需用三蒸馏水配制。

（4）乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。

（5）显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。

（6）控制反应时间，显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶 1%～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温 25℃左右显色时间 10～15min，室温在 20℃以下，显色时间 20～30min 左右。

（7）洗涤：使用 TBS 时最好加入 0.05%～0.1% 的 Triton X-100 或 Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白，防止出现背景的非特异染色。

（二）背景染色已发生应如何消除

（1）2% 硫代硫酸钠，1% 铁氰化钾等量混合，加在切片上至背景无色为止。

（2）2% 铁氰化钾和 1% 溴化钾等量混合作用 1min 水冲洗，然后加上 2% 硫代硫酸钠和 1% 亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。

（3）0.1% 重铬酸钾加 0.25% 浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用 5% 硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。

（4）用 0.3%～1% 的 H 2O2处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间，防止把阳性结果脱色。

（三）彩色显影背景过染的处理方法

彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。

（1）纯酒精滴到切片上 3～5s, 立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。

（2）75% 的酒精滴到切片上 1min，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。

六、物理显影液及缓冲液的配制（一）缓冲液的配制

（1）0.05mol/l pH7.4 TBS 配制

Tris（三羟甲基胺基甲烷）12.1g

NaCl 17.5g

加双蒸水 1900ml

然后用浓 HCL 调至 pH 为 7.4 再加双蒸水至 2000ml

Tris 4.84g

NaCl 17.5g

BSA 2.0g

NaN31.0g

双蒸水 1900ml, 充分搅拌至溶质完全溶解, 用浓 HCl 调 pH 至 8.2, 再加双蒸水至 2000ml。

（二）银显影液的配制

1．乳酸银显影液的配制：混合以下溶液

①10% 阿拉伯胶水溶液 60ml

②枸橼酸缓冲液 pH 3.5 10ml

③对苯二酚 1g, 加双蒸水 20ml 溶解。

④乳酸银水溶液 100 mg 加水 10ml。

注意在暗处显影。

2．硝酸银显影液的配制

①10% 阿拉伯胶水溶液 60ml。枸橼酸缓冲液 ph 3.5 10ml

②对苯二酸 1.7g 水溶液 30ml。

③硝酸银 40mg 水溶液 2ml。

①②两溶液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。

4．彩色显影液的配制

①0.2N 氢氧化钠的异丙醇溶液 5ml 溶入 100mgα- 萘酚（或菲尼酮）。

②500mg 碳酸钠，25mg 溴化钾，50mg 亚硫酸钠，加双蒸水 25ml。

①②两液 1：10 混合，室温下彩色显影。

5．醋酸银显影液

①15% 阿拉伯胶 60ml，柠檬酸缓冲液 10ml，pH3.5。

②对苯二酚 1.7g 溶于 20ml 蒸馏水中。

③醋酸银 100mg 溶于蒸馏水 10ml 中。

用前①②③依次混合，不需要避光，在室温下显影。

（三）柠檬酸缓冲液的配制

柠檬酸（C6H8O7.H2O）25.5g

柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O）23.5g

加重蒸水 100ml 溶解即成，pH3.5

(四)氢氧化钠（NaOH）无水乙醇饱和溶液的配制

8g 氢氧化钠，加入 100ml 无水乙醇振摇溶解即成。

第八节 免疫胶体铁细胞化学胶体铁（Ferric Colloid）是一种阳离子胶体，可通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小及电子密度，最初被用于光镜及电镜下定位组织中的阴离子部位（Hale,1946Seno,etal, 1983,Murakami，et al 1986）。1989 年日本学者 Seno 等在抗体分子上标记了胶体铁，将胶体铁引入免疫细胞化学技术（Seno,et al. 1989）。杨守京等在胶体的制备方法及其标记物的纯化等方面做了改进，成功地用于流行性出血热病毒抗原的检测（杨守京，等，1992）。该方法具有较高的特异性与敏感性，背景染色干净。

一、胶体铁的制备方法早期制备的胶体铁作为阳离子胶体是用于检查组织中阴离子的定位，其制备主要是通过三氯化铁（FeCl3）的煮沸完成的，如有：（1）FeCI3 直接煮沸（Hale ,1946）:(2)FeCl3 溶于甘氨酸和氨水的混和液中（Rinehart,1951）:(3)FeCl3 倒入煮沸的二甲坤酸钠溶液中（Seno.et al,1983）。或 FeCl3 与二甲砷酸溶液一起煮沸（Seno ,et al.1985）其后，制备方法不断改进，1986 年 Murakam 等用水合联胺二甲砷酸 -FeCl3 煮沸法制备出微细颗粒胶体铁（Fine-granular cationic iron colloid）, 胶体颗粒小（0.5～1nm）, 从而使其稳定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸钠也可以获得同样胶体，具体步骤如下：在 60ml 0.1mol/LFeCl33ml，将混合物加热煮沸至变成深棕红色为胶体砷酸铁。室温冷却后，再以二倍于原体积的 0.1mol/LpH7.4 的二甲砷酸钠缓冲液（Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB）稀释，即可进行抗体标记。该方法制备的铁胶体呈深红色，颗粒大小 1nm 左右，在 pH4～8 范围内稳定，4℃可存放一个月以上，室温存放半个月，阴离子定位分布同 Murakami 等的胶体铁，与 IR-COO- 有较强的亲和力，但不与 IR-NH+ 结合。

二、抗体的标记和纯化胶体铁的等电点为 7.8 至 7.9, 在 pH7.4 时通过离子键能与抗体 IgG(pH5.8～7.3)结合而不影响抗体活性, 在此条件下,Seno＇对 Hale＇胶体铁进行了抗体标记, 并成功用于免疫细胞化学染色 (Seno,et al.1989), 抗体标记时, 用 0.1mol/ L 碳酸钾将胶体的 pH 调至 7.4 按每毫升脱体铁 0.2～1mg 的蛋白量, 将 IgG 在电磁搅拌下逐滴加入到胶体铁, 搅拌 5min 后, 通过 CB 平衡的 Amber liaht CC-50 层析柱,CB 洗脱纯化. 作者在胶体铁的制备方法进行了改进, 吸收了 Murakami 等胶体的优点, 所制备的胶体铁, 颗粒小, 稳定性高, 其 pH 值近中性, 标记效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia) 可取代 Amberlight CG-50 用于纯化标记抗体(杨守京, 等,1992)。

三、胶体铁标记抗体的鉴定用免疫斑点法或免疫细胞化学染色等方法可鉴定抗体的标记效果

1．免疫斑点法 在处理好的硝酸纤维素膜上分别滴加 100～10- 7 系列稀释的抗原，斑点直径 0.25cm, 空气中干燥，80℃多聚甲醛蒸气固定 1h，然后分别以胶体铁标记的抗体一步法或用桥抗联接胶体铁标记物的间接法染色，普鲁士蓝呈色观察。一步法所难检测到的抗原量为 10-2～10-3μg, 间接法 敏感性至少增加 10 倍（10-3～10-4μg）。

2．免疫细胞化学染色法 步骤同下，方法敏感性同免疫金银法（IGSS），优点是背景干净。

四、免疫胶体铁细胞化学染色（1）组织切片脱蜡入水，0.01mol/l pH7.4 PBS 洗；

（2）用 4% 正常羊血清封闭组织 37℃，30min。

（3）分别以第一抗体孵育组织，4℃24h，PBS 振洗 10min×3；

（4）用胶体铁标记的第二抗体 37℃孵育 30min 或用桥抗联接胶体铁标记物；

（5）蒸馏水洗；

（6）以 1% 的亚铁氰化钾与 1% 盐酸混合液显色 20in；

（7）自来水洗；

（8）核固红染核，脱水，透明、封片。

以该方法染色，阳性为蓝色，胞核为红色。

五、方法的应用胶体铁的呈色产物亚铁氰化铁是一络合物（解离常数 1×10-35），一经形成，难以再与其它化学物质发生反应。蓝色的亚铁氰化铁与棕色的 DAB 产物及黑色的银颗粒颜色对比明显，因此强结合免疫酶及 IGSS 进行光镜下抗原的双标及多标记。胶体铁（颗粒 1nm）标记抗体直径比常用胶体金（5～40nm）及铁蛋白标记抗体（12nm）小，因而对固定组织具有更好的穿透力，可用于抗原的超威结构定位，尤其是免疫电镜的包埋前染色。结合免疫酶及不同大小胶体金标记抗体，还可用于抗的双标记及多标记。

非特异性背景染色是免疫组化染色过程中经常遇到的问题。组织中的内源性过氧化酶活性及色素常会干扰免疫过氧化酶染色；而胶体金非特异性吸附组织是构成 IGSS 背景染色的主要原因。胶体铁与抗体结合呈电中性后，很少再与组织发生吸附，并且其染色不受内源酶活性的干扰。普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不能显示组织中内源性二价铁（除外含铁血黄素，但可通过连续切片 H·E 染色对照排除），因而背景干净。另外免疫斑点试验和组织染色结果表明，免疫胶体铁间接法敏感性与 IGSS 基本相同但高于 ABC 染色，从上述两方面看，该方法要优于免疫酶及免疫金银染色。

参考文献1．Fualk WP, Taylor, GM.Immunochemistry, 1971;8:1081～1083

2.Roth J.The Colloidal gold markem system for light and electron Microscopiccytochemistry Techniques in Immunocytochemistry, 1983;2:217～218

3. 蔡文琴，王泊沄主编. 实用免疫细胞化学. 成都: 四川科技出版社,1983

4.HolgateCS, et al .Immunogold –sliver staining new method of immunostaning withenhanced sensitivity. J Histochem cytochem, 1983;31(7):938

5.RothJ,et al. Application of the protein A-gold technique for electron microscopicdemonstration of polypetide hormones. Endocrinology,1981;108:247

6.Bao –LeWang . Simplifide purification and testing of colloidal gold probes.Histochemistry, 1985;83:109

7.HackerGW, et al . Immunogold –silver staning –working protocol. J Histotechnol,1988;11(4):312

8.FritzP, et al. Colour development of immunogold-labelled antibodies for lightmicroscopy. Histochemistry, 1986;85:209～214

9.De,waele M, et al. An immunogold-silver staining method for detection of cellsurface antigens in ligh microscopy. J Histochem cytochem,1986;34:935

10. 王福安. 免疫金技术讲义. 南京军区总院 电镜室,1987

11. 王保乐. 胶 体金探针及免疫金、免疫金银染色方法讲义. 陕西省中医药研究院,1986

12. 王泊沄, 李玉松, 对 IGSS 法常见问题和对策的探讨. 临床与实验病理学杂志,1993;9(1):49

13.JiangGu, et al. Quantiative evalution of indirect immunogold-silver electronmicroscopy. J Histotechnology, 1993;16:19

14. HaleCW. Histochemical demonstration of acid polysaccharides in animal tissies.Nature(Lond),1946;157:802

15.MurakamiT, Taguchi T, Ohtsuka A , Sano K, Kaneshige T,Owen RL and Jones AL. A modifiedmethod of fine –granular cationic iron colloid preparation:It’s use in lightand electon microscopic detection of anionic sites in the rat kidney glomerulusand certain other tissues . Arch Histol Jap, 1986;49(1):12～23

16．Rinehart JF and Abutl- Hai SK. Animproved method for histologic demonstration of acid mucopolysocon cell surfaceand the histochemical stains of acid mucopolysaccharides. Histochem, 1983;79:27～31

17.SenoS, Tsujii T, Ono T and Ukitha S. Cationic Cacodylate iron colloid for thedetection of anionic sites on cell surface and the histochemical stains of acidmucopolysaccharides. Histochem, 1983;79:27～31

18.SenoS, Akita M, Ono T and Tsujii T.Fine-granular cationic iron colloid. Itspreparation, physicochemical characteristics and histochemical use for thedetection of ionized anionic groups. Histochemistry, 1985;82:307～312

19. SenoS ,Akita M and Hsueh CL. A new method of the immunocytochemical detection ofcellular antigens for light and electron micriscopy. Histochem, 1989;91:449～454

20. 杨守京，刘彦仿。改进的免疫胶 体铁细胞化学染色。中国组织化学与细胞化学杂志，1992；1（1）：65～69

21．王泊沄. 更敏感的免疫细胞化学方法 — 免疫金银染色。临床与实验病理学杂志，1985；1：41～43

第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展70 年代以来，由于免疫组织化学方法的广泛应用，在技术方法上不断得以改进，涌现了一批新的技术方法，其特点为一些具有双价或多价结合力的物质如如植物凝集素（Lectin）、生物素（Biotin）和葡萄球菌 A 蛋白（Staphylococcal Protein A, SPA）等被应用于免疫细胞化学技术，从而建立了 SPA—HRP 法、ABC 法、BRAB 法和 LAB 法等。这些方法的共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。它们一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，另一方面本质上又非抗原抗体反应。因此，Bayer（1976）首次称之为亲合组织化学（Affini-ty histochemistry）。事实上，抗原抗体反应从本质上也属于亲合组织化学这一范畴，只是近代免疫组织化学方法的更新更突出了“亲合”这一组织化学技术特点。目前，亲合组织化学包括抗原与抗体、植物凝集素和糖类、生物素与抗生物素、葡萄球菌 A 蛋白与 IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。

第一节 抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法一、基本原理很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，会引起明显的“维生素 H 缺乏症”，也称为“蛋白质伤害”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为 68000，属于糖蛋白，当时命名为卵白素（Avidin），卵白素具有 4 个同维生素 H（Riotin, 又名生物素）亲合力极高的结合点。给动物饲以大量鸡蛋白所致的维生素 H 缺乏，就是由于卵白素和大量的维生素 H 结合所致。维生素 H（以下统称生物素）是一种小分子的维生素，分子量为 244，系转氨甲酰基化过程中的辅酶，它与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出 100 万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时，生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。免疫细胞化学工作者利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系统。由于维生素 H 习惯上称为生物素，为便于理解，现在译名上统称卵白素为抗生物素或亲合素。所以卵白素—生物素免疫染色系统又称为抗生物素—生物素免疫染色法。

二、几中抗生物素—生物素染色法1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin–Peroxidase Complex technique, 简称 ABC 技术）（1）基本原理：ABC 法是 Hsu 等于 1981 年在 HRAB 法和 LAB 法的基础上改良的，其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。与 LAB 法和 BRAB 法不同的是第一抗体不为标记物所标记，生物素标记的第二抗体与 ABC 复合物相连接。复合物是将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素—过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的（图 6 -1），最后进行显色反应定位。

图 6 -1 ABC 法

（2）操作步骤

①冰冻切片或石蜡切片均可。

②冰冻切片可用丙酮固定 10min 左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗 5min，更换 3 次。石蜡切片需经脱蜡，系列酒精至水。

③第一抗体，室温孵育 15min。

④PBS 洗 5min，更换 3 次。

⑤加生物素标记的第二抗体（1：200 左右），孵育 15min。

⑥PBS 洗 5min，更换 3 次。

⑦加 ABC 复合物室温作用 15min。

⑧PBS 洗 5min，更换 3 次。

⑨用 DAB—H2O2 液（配法见附录）显色。

⑩复染。

⑾封片、观察。

ABC 复合物的配制：经试验，生物素与抗生物素之比为 1：4 时，能获得最佳满意效果。即抗生物素 10μg/ml 加 2.5μg/ml 生物素，应用 0.05mol/l Tris—HCl 液，pH7.6，在应用前 30min 配制。

（3）ABC 法的评价及实验注意事项

ABC 法具有：①敏感性强：Hsu 等应用 ABC 法与 PAP 法相比发现敏感性较 PAP 法高 20～40 倍能显示 PAP 法所不能显示的抗原。这是因为生物素与抗生物素间有较强的结合力，一个抗生物素分子具有可与生物素结合的 4 个活性部位，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶相结合，另一部分可与生物素标记的免疫球蛋白结合。生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白分子可以结合多个生物素分子，从而增加了免疫球蛋白或过氧化物酶结合抗生物素的能力。在 ABC 反应中，抗生物素作为桥连接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个含有 3 个以上过氧化物酶分子（大于 PAP 复合物）的网格状复合物，敏感性极大提高。②特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能的高度，减少了非特异性染色。③方法简便，节 约时间：由于 ABC 法敏感，操作的抗原抗体反应的时间可由 PAP 法所需的数天缩短为 2h 左右，各层抗体作用仅需 15min。④国内上海生物制品所等单位制备的生物素—抗生物素染色药盒经质量鉴定符合标准，已提供国内市场。⑤由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。

实验注意事项：

①内源性生物素活性及其消除：生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节 中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用 ABC 染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，在应用 ABC 方法前应预先以 0.01% 的抗生物素和 0.01% 的生物素溶液分别作用 20min 左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用 PBS 洗 5min，更换 3 次。Nar-itoku 和 Taylor（1982）报告神经组织中的乳糖可与抗生物素结合产生假阳性反应，以 2—甲基 -O- 甘露糖预孵育切片可封闭神经组织内乳糖分子上的结合点，从而阻止与抗生物素蛋白的结合。必要时，也可用 0.3%H2O2—100% 甲醇孵育以消除内源性过氧化 物酶活性。

②生物素制剂之间相互亲合性差异大，因此在应用 ABC 试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先测试，以保证实验结果的稳定性。

③ABC 试剂保存温度以 4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在—20℃生物活性在短期内即被破坏。

2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称 BRAB 技术）该技术方法是用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来（图 6 -2）。

图 6 -2B RAB 技术

检查抗原时，先用生物素标记的抗体与细胞（或组织内）的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入抗生物素孵育后，洗去未结合的抗生物素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以细胞化学方法呈色反应。

3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB 技术）以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体（图 6 -3）。操作步骤如下：

图 6 -3 LAB 技术

（1）切片在含有 25～50μg/ml 生物素标记抗体（PBS 液稀释）中孵育 1h，室温。

（2）PBS 洗 2 次，每次 5min。

（3）用 20～50μg/ml 过氧化物酶标记的抗生物素液孵育 90min，水洗。

（4）酶呈色反应。

BRAB 法和 LAB 示是 Guesdon 及其同事们（1979）建立的，由于这二种方法都需以生物素标记第一抗体，应用不如 ABC 法普遍。但用于免疫细胞中免疫球蛋白的显示具有特异性。二者比较，LAB 法手续较简便，但灵敏度较低。

生物素—抗生物素染色法采用免疫细胞化学染色中各种常用固定剂（见附录），均可获得较满意的结果。但有实验报告推荐“PLP”固定液（即过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液），其配制法亦见附录。PLP 固定后，依次经系列蔗糖磷酸缓冲液（10%，15%，20% 各 5min），进行冰冻切片，贴于载片上，置室温风干 30min 或 37℃3～4h 或过夜。染色前用 PBS 湿润水化切片，可获得满意染色效果。

第二节 葡萄球菌蛋白 A（SPA）葡萄球菌蛋白 A（Staphylococal Protein A, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在 1940 年，Vevwey 发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也发现类似现象，并将其命名为 A 抗原。直到 1963 年 Lofkvist 等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与 A 与糖相区别，Grov（1960）将其命名为葡萄球菌蛋白 A，简称 SPA 或蛋白 A（Protein A）。由于 SPA 的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。

一、SPA 的性质（1）SPA 存在于大多数（90%）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现 SPA 和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的 SPA 含量有明显差异，以 I 株金黄色葡萄球菌含 SPA 量最高，SPA 和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（Methicillin—resistant strain）能产生分泌性 SPA，它较之细胞壁所含的 SPA 在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。

（2）SPA 为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为 12000～15000。用沉淀平衡分析和在 6mol/ L 鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为 42000。SPA 为多肽单链，内含 3 个高度相似的 Fc 段结合区，每区由 50 个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA 粘度高于球蛋白，等电点为 pH5.1，其天然结构十分稳定，在应用 6mol/ L 鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。

（3）SPA 之所以引起免疫学家的重视，是因为它具有的免疫学特性。SPA 具有和人与许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等 IgG 结合的能力。SPA 结合部位是 Fc 段而不是 Fab 段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA 具有的结合力是双价的，每个 SPA 分子可以同时结合两个 IgG 分子，也可一方面同 IgG 相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，和 SPA 结合后的 IgG 可用 4mol/ L 鸟嘌呤盐酸盐等使之解离。SPA 对 IgG 免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如 SPA 与人 IgG 亚型：IgG1、IgG2、和 IgG4 有结合力，唯独不结合 IgG3。只结合 IgA2，而不结合 IgA1。SPA 和禽类血清 IgG 不结合。

（4）SPA 具有多种生物学作用，如引起豚鼠解离体回肠和收缩，在吞噬反应中抑制 IgG 调理素吞噬和杀菌作用，SPA—Igg 复合物能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体，对人类 B 细胞具有促有丝分裂因子的作用等。

二、SPA 的应用自 70 年代开始，国外应用 SPA 建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。其可能应用的范围可归纳为以下四个方面：

1．应用于免疫球蛋白的制备和分析 SPA 是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于 SPA 与 IgG 及其某些亚型的 Fc 段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的 PSA—IgG 可再用解离剂如 4mol/ L 尿素、4mol/L，硫氰酸盐或 6mol/ L 的鸟嘌呤盐酸盐使之解离，多用 SPA—Sepharose 层析柱分离 IgG 或其亚型及断片如 Fc、Fab 等。

2．应用于免疫细胞化学 由于 SPA 具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于 SPA 能与多种动物的 IgG 的 Fc 段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA 的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA 法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联 SPA 代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较 PAP 法省时一半。SPA 分子量小（13000～42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为 200000，PAP 复合物为 430000，均较 SPA 分子量大。

3．应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用 SPA 菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型（详见第二章 第三节）。

4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜 Ig 的固相吸附剂 Hallgsen 用同位素标记 SPA 测定血 IgG 的凝集物，发现 85% 全身性红斑狼疮和 42% 类风湿病人血清中凝集物增高。SPA 用于细胞膜抗原、表面 IgG 和 Fc 受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie（1976）用 SPA 致敏绵羊红血球，与经 IgG 处理的细胞形成玫瑰花环，来鉴定带 Fc 受体的细胞，反之，如用 SPA 抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的 IgG。应用 SPA 与胶体金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白 A—胶体金技术（Protein A—Gold technique, PGA 技术）自 Pomano 和 Romano（1977）首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已得到愈来愈广泛的应用（详见第七章），是一种较为理想的免疫电镜技术。

三、SPA 在免疫细胞化学染色中的应用SPA 可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记 SPA 和金标记 SPA 技术，后者将在第七章 中叙述。标记 SPA 常用的酶为 HRP。可应用于间接法。SPA 在 PAP 法中可代替桥抗体。

1．SPA—HRP 用于间接法的操作步骤

（1）切片经脱蜡后用 0.5%H2O2—纯甲醇液处理 5min 以抑制内源性过氧化物酶活性。

（2）用 Tris 盐酸缓冲液（0.05mol/l pH7.6）洗 2 次，每次 3min。

（3）以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育 30min，或 4℃24～48h。

（4）用 Tris-HCl 缓冲液洗 3 次，每次 5min。

（5）加 SPA—HRP（1：100～1：400）处理 30min。

（6）Tris-HCl 缓冲液洗 3 次，每次 5min。

（7）DAB—H2O2 显色。

（8）复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。

2．SPA 用于 PAP 法的操作步骤

（1）切片脱蜡至水洗。

（2）80% 甲醇（含 0.6%H2O2）封闭内源酶活性 5min。

（3）10% 卵白蛋白 Tris 缓冲液，20min。

（4）第一抗体作用 37℃，30min 或 4℃，16～48h。

（5）0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl 缓冲盐液洗片 5min。

（6）SPA（1μg/ml）5min。

（7）Tris-HCl 盐液洗 5min。

（8）PAP 复合物（无种属限制），5min。

（9）Tris-HCl 盐液洗切片 5min。

（10）DAB（0.6mg/ml），加 0.01%H2O2 反应 5min，然后水洗。

（11）复染：常用 Mayer’s 苏木精液数秒至 1min（视需要而定），水洗。

（12）脱水、透明、封固、镜检。

3．SPA—HRP 的制备 应用 Nakane 和 Kawaoi1974 年建立的过碘酸法，酶：SPA=2：1，即 HRP10mg,SPA5mg。

（1）10mg 溶于新鲜配制的 pH8.1、0.3mol/ L 碳酸氢钠溶液 1ml，加入 0.1ml 1% 二硝基氟苯无水乙醇溶液以封闭酶分子中的氨基，使不发生酶的自身聚合，室温轻轻搅拌 1h。

（2）加入 1ml0.04～0.08mol/L（依不同批号的酶而定）的 NaIO4，室温搅拌 30min。

（3）加入 1ml0.16mol/ L 乙二醇，室温轻搅 1h。

（4）对 1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸盐缓冲液充分透析（4℃，过夜），换缓冲液 3 次。

（5）加入 5mg SPA 的 0.1mol/l pH7.4 碳酸钠缓冲液 1ml，室温轻搅 2～3h。

（6）加 5mg 硼氢化钠（NaBH4）终止氧化，置 4℃冰箱 3h 或过夜。

（7）对 PBS 透析 24h，4℃离心去沉淀，半饱和硫酸铵洗沉淀结合物 3 次，溶于 1ml 0.02mol/L pH7.4 的 PBS 中。

（8）对 PBS 充分透析，经测定后分装，贮于 -20℃冰箱中保存备用。

用过碘酸钠法可以得到很高标记率的 HRP-SPA 标记物，而且保存了抗体的全部活性，敏感度高，稳定性强，大大优于戊二醛标记抗体法，国内现在也有 HRP-SPA 的标记物供应，但要注意由于各家所用的 SPA 可能来源于不同菌株，在性质上可能存在一些差异。

【注意事项】

①在使用二硝基氟苯后，会产生氟化氢，应充分透析除净，否则抑制酶活性。

②标记时过碘酸浓度不宜过高，氧化时间不宜过长，否则会产生过度标记，即多个酶分子结合到一个蛋白 A 分子上。这些过度标记蛋白 A 的免疫反应性很差，容易产生非特异性染色。

③标记时加入酶与 SPA 的比例应适合，比值过大易产生过度标记，比值小则标记蛋白 A 产率低。

④过碘酸氧化结果能使酶具有多个醛基，从而能与多个蛋白分子的氨基相结合，成为一些大分子的聚合物。因此，有作者强调指出，对要求具有较强的细胞穿透力的免疫细胞化学实验时应予以考虑是否适用。但国内有实验室应用上海生物制品所产生的应用过碘酸氧化法制备的 HRP—SPA 于免疫电镜研究仍获得了较为满意的结果。

第三节 凝集素凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其常见种类见表 6 -1。常用的为植物

表 6—1 常见的凝集素一览表

凝 集 素缩 定特异性结合花生（Peanut agglutinin）PNAD—半乳糖、Gal(1→3)—GalNAC刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin）ConAD- 葡萄糖、D- 甘露糖蓖麻（Ricinus communis agglutinin）RCAD—半乳糖、D-GalNAC> 半乳糖扁豆（Lens cuinaris agglutinin0LCAD- 甘露糖、D—葡萄糖豌豆（Pisum satiwum agglutinin）PSAD- 甘露糖菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin）PHAD-GalNAC大豆（soybean agglutinin）SBAD-GalNAC>>D- 半乳糖荆豆（Ulex europeaus agglutinin）UEAL- 岩藻糖麦胚(Wheat germ agglutinin)WGAD-GalNAC、NANA(Bandeiraea simplicifolia agglutinin)BSAD- 半乳糖双花扁豆（Dolichos bifows agglutinin）DBAD-GalNAC槐（Sophora japonica agglutinin）SJAD- 半乳糖、D-GalNAC凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素 A（Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanutagglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。因此，Ponder（1983）提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

一、凝集素的特性凝集素具有多方面的特性，在此我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的某些特性。我们知道，生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与 α—D—吡喃糖基甘露糖（α—D—Mannopyranosy）结合；麦芽素与 N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与 N—乙酰乳糖胺结合（见本章 表 6—1）。因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜与 / 或电镜水平显示其结合部位。

二、凝集素的应用一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和肿瘤细胞性变中的变化。仅在某些特殊的例子，其细胞结合凝集素的性能可以预先估计，如双花扁豆素之于血型 A 物质的特异性，荆豆凝集素之于血型 O 物质 2—L—岩藻糖的特异性，然而在绝大多数情况下，关于由凝集素所识别的碳水化合物决定簇的种类，关于携带决定簇的分子的性质和机能，完全凭实验经验去发现。

1．作为细胞分化和成熟的标记 应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于血细胞，特别是淋巴细胞的分群。如 Rose（1980）等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的 T 淋巴细胞呈 PNA 阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有 20% 左右的 PNA 阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的 T 淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman 等（1979）以荧光素标记凝集素 PNA，发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed 等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和 Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。

2．作为细胞特殊类型的标记Kivela 和 Farkkanen（1987）发现在人视网膜，PNA 标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈 PNA 阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈 PNA 阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明，刀豆素 A 和蓖麻素存在于肾脏的各部，PNA 和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。应用 DBA 对 RIII 和 DDK 品种的小鼠研究表明，DBA 主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上，电镜观察显示 DBA 结合在内皮细胞的表面，在趣的是在 RIII 品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的 DBA 阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit 和 Kreutzberg（1987）发现 GriffoniaSimplicifolia 凝集素特异性标记面神经节 内的小胶质细胞，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经后，增殖的小胶质细胞对 Griffonia Simplicifolia 凝集素的反应加强，免疫电镜观察表明，凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面，特异性结合糖基是 α—D—半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用 12 种凝集素（表 6 -1）对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究，结果表明，凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为 PNA 受体，而壁细胞为 BSL 受体，双花扁豆受体（DBA）主要出现在大肠部份。

3．在肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等（1987）报道 115 例胃癌标记 PHA 阳性率高达 90.43%，而正常胃粘膜基本是阴性，故认为 PHA 是胃癌的诊断性标志。BSA 对乳腺恶性肿瘤阳性率达 79%，而对良性病变均呈阴性反应，提示 BSA 可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型，如神经系统星形细胞瘤 ConA 阳性，小胶质细胞瘤阴性，肾腺癌 UEA1 阴性，透明细胞癌阳性。

三、凝集素在免疫细胞化学中的应用凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：

1．直接法 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。

（1）切片脱蜡至水。

（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。

（3）TBS 洗 3 次，每次 2min。

（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。

直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。

2．间接法 将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。

（1）脱蜡至水。

（2）用含 3% 的 H2O2 的甲醇阻断内源性过氧化物酶 10min。

（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育 30min。

（4）TBS 洗 3 次，每次 2min。

（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育 30min。

（6）TBS 洗 3 次，每次 2min。

（7）呈色、脱水、透明、封片。

（8）观察。

间接法染色还可进一步改良为：①三步法：即在凝集素孵育后，接着用抗凝集素抗体孵育，再用标记了的抗 - 抗凝集素抗体孵育，层层放大，进一步提高其敏感性，PAP 复合物也可作为标记物标记在抗 - 抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法：用结合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS 洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高 5～10 倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。

3．糖—凝集素—糖法 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。

（1）脱蜡至水。

（2）用含 3% 的 H2O2 的甲醇阻断内源性过氧化物酶 10min。

（3）用 100μg/ml 的凝集素孵育 30min。

（4）TBS 洗 3 次，每次 3min。

（5）用 100μg/mlHRP 标记的糖液孵育 30min。

（6）TBS 洗 3 次，每次 3min。

（7）DAB 呈色、脱水、透明、封固。

本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP 本身含有甘露糖，能与刀豆凝集素 A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素，本法目前普及还有一定困难，因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上，就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶，称为糖基化（glycosylation），方法虽不复杂（Lee 等 1976），但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。

【注意事项】

①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位，如果金属离子耗尽了，就会影响凝集素的结合能力。因此，有作者主张用 TBS 作为缓冲液，内加微量的金属，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g,H2O 加至 1000ml，其中含 CaCl2、MgCl2 各 1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前，先用该液孵育，以增强凝集素结合力。

②和其它抗体血清应用一样，应用每批新的凝集素实验时，都先要用缓冲液稀释成不同等级；如 8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，经染色选择最佳稀释度。

③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的 H2O2 对碳水化合物有影响，可能改变凝集素的结合形式，因此，应尽量少用或不用，我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。

④有作者认为凡经固定的组织切片，不论是石蜡包埋切片或冰冻切片，都有可能使组织中抗原隐蔽，为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团，主张在凝集素孵育前用酶处理切片，常用胰蛋白酶液（配制见附表）进行适当的孵育。

⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的 1%～10% 的碳水化合物，它们以低聚糖（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基，通常有两种或更多的单糖，在单糖单位末端常常是一个带负电荷的 N - 乙酰神经氨酸的残基，一个唾液酸（siallic acid）。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶 (neuramidinase) 分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸，以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F–8172）用醋酸缓冲液（含 2% 牛血清白蛋白）BSA 配成 0.5μg/ml。

切片脱蜡后进行酶消化的过程中，将该组织切片置于上述配制液中，在湿盒内，37℃孵育 30min。用缓冲液洗后，进行凝集素染色。

⑥对照试验，和其它组化染色一样，凝集素染色也需要设对照试验（最好在相邻切片进行）。由于凝集素具有单糖特异性，如果外加相应的糖，把凝集素的结合部位占有了，凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖（0.2mol/L）在室温孵育 30min，使之占有凝集素结合部位，再将此液代替凝集素进行孵育，结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时，只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖（oligosachrides）代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基（Watanalte 等，1981）。

四、HRP 标记凝集素及凝集素抗体的制备1．HRP 标记凝集素法 适用于小量的凝集素标记（Ponder 1983）。

（1）HRP 的活化

①将 10mg HRP(SigmaType VI)溶解在 1ml 0.3mol/L 的重碳酸钠溶液中（1.25g/50ml）。

②加 50μl 含 1% 氟二硝基苯的无水乙醇溶液，室温轻度搅拌 1h。

③加 1ml 含 0.06mol/ L 的过碘酸钠的蒸馏水（0.62g/50ml），室温下轻度搅拌 30min。

④在室温下加两滴 0.16mol/ L 乙二醇，轻搅 1h。

⑤用 Sephadex G—25 装成小柱，用 0.3mol/ L 的重碳酸钠溶液，使含 HRP 的混合液过柱。

（2）结合

①正常条件下，可用凝集素及过氧化物酶各半量，但其比例可根据需要调整，以 10mg 凝集素溶解在 25ml 的重碳酸盐缓冲液里，加到“活化”的 HRP 中去，这样得出的凝集素浓度大约是 0.3mg/ml，可加进 0.1mol/ L 相应的特异的糖，以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步透析或层析时去掉。

②在室温下轻搅拌，结合 3h。

③加入 1mg 硼氢化钠，室温下作用 1h 以稳定结合物活性。

④用 1N HCl 调整 pH 至 6.4，留置室温下过夜。

（3）纯化

①用适当的凝胶层析柱如 SephadexG—200、Saphacryl—300 层析法将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去，包括抑制性的糖也在此时分离出去。

②提纯后的结合物在 280nm 和 403nm 波长处测量其吸光率。用 1%BSA 先通过 0.22μm 的微孔过滤器，以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中，然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个无菌瓶中。

③加入叠氮钠，浓度 1：1000，保存于 4℃C 备用。

2．抗凝集素抗体的制备 抗凝集素抗体的制备法与一般免疫血清制备大致相同（见第二章）。所不同的是：①凝集素具有较强的毒性，易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性，从而减低其毒性，但同时要保证其抗原性不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位，以减少对这些部位的抗体的产生，解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和 Atkin（1982）设计了一个办法，他们首先应用琼脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共价糖的附着，这些糖可阻断凝集素结合部位，这种糖珠有商品供应（Sigma LtD），每 1ml 糖珠能结合大约 12mg 凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性，毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下：

①1ml 琼脂糖—半乳糖珠与 1mg 花生凝集素相结合，室温 1h。

②加入 10ml 10% 福尔马林，在水浴中加热到 60℃，1h。

③用盐水离心洗珠，将珠分成以 10μl 为单位的若干小份，保存在 -20℃。

④皮下多处注射两只家兔背部，每次注射 100μl，每隔三周注射一次。取血 40～50ml，保存在 -20℃备用。

第四节 免疫细胞化学技术的某些新进展免疫细胞化学技术在继续改进和完善中，新的技术方法不断出现。除目前国内已开始应用的免疫金技术和免疫金银技术外，80 年代，新的免疫细胞化学技术还有半抗原交联抗体法和令人瞩目的分子杂交免疫细胞化学技术。免疫金银技术和分子杂交免疫细胞化学技术将分别以专章 叙述，本节 仅就半抗原交联抗体法作一简要介绍。

【半抗原交联抗体法（Hapten –Coupled techniques）】

近年来，为提高敏感性和减低非特异性染色，有些学者（Cammisuli 1976; Jassani 1981;Falini 1983）在常规免疫细胞化学技术的基础上，发展了半抗原交联抗体法，可作免疫荧光或免疫酶染色。本法的基本原理是应用半抗原标记第一抗体。常用的半抗原有阿散酸，即对氨基苯砷酸（Arsanilic acid, ARS）, 对氨基苯酰甘氨酸（P—aminobenzoyl glycine），亚对氨苯酰甘氨酸（N—P—aminobonozyl glutamic acid）和二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂（dinitrophenyl aminopropionitrileimido ester, DNP）。通过酰胺化反应把半抗原结合到抗体分子上。在间接法（二步法）中，先以半抗原标记的特异性抗体（第一抗体）孵育切片，然后加入半抗原的标记抗体，（标记物可为荧光素或酶）（图 6 -4）。在 PAP 染色（三步法）中，先用半抗原标记的第一抗体孵育切片，再加未标记的抗半抗原特异性抗体作为桥抗体，第三步加半抗原交联的 PAP 与之反应，并作酶的呈色反应（图 6 -5）。第一和第三抗体分别为半抗原标记的特异性抗体和以半抗原标记的抗酶抗体制备的含半抗原的 PAP 复合物。本法具有许多优点，主要是：①敏感性高。由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体保留较高的活性，能结合较大量的半抗原，平均每个球蛋白分子可同时结合 20 个半抗原分子，每个半抗原又可用抗半抗原抗体相结合，特异免疫反应明显放大，其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织。②可用于双重免疫染色。利用两种交叉反应的半抗原如阿散酸和对氨基苯酰甘氨酸分别标记来自同一种动物的两种特异性（第一抗体）血清，应用两步法或三步法，即可在同一张切片内同时显示两种不同的抗原。③由于特异性强、敏感性高，因此背景染色低。

图 6 -4 半抗原标记抗体酶技术—两步法

图 6 -5 半抗原标记抗体酶技术—PAP 法

参考文献1．Bayer EA, et al ．Affinity Cytochemistry：The localization of lectin andantibody receptors on erythrocytes iva avidin—biotin complex．FEBS Letters, 1975；68：240

2．Brabec RK, et al ．Differential lectin binding tocellular membranes in the epithelium of the new born rat．Proc Natl Acad Sci USA, 1987；77：477

3．Falini B． New development inimmunoperoxidase techniques and their application．Arch Pathl Lab Med, 1983；107：105

4．Jasani B． Et al． Use of monoclonal antihaptenantibodies of immno—Iocalization of tissue antigens．J Clin Pathol, 1981；34：100

5．Kivela T and Tarkanen A．A lectin cytochemical study ofglycoconjugates in the human retina．Cell Tissue Res, 1987；249：277

6．Newman RA, et al ．Binding of peanut lectin to breastepithelium, human carcinoma and cultured rat mammary stem cells：Use of the lectin as a marker ofmammary differentiation．J Natl Cancer Inst, 1979；63：1339

7．Ponder BAJ, et al ．Lectin histochemistry． (Immunocyto—chemistry Eds．JM Polak and SV Noorden)WrightPSG Bristol London Boston 1983；129

8．Rose ML, et al ．Peanut lectin binding propertiesof germinal centres of mouse lymphoid tissue．Nature, 1980；284：364

9．Streit WJ and Kreutzberg GW．Lectin binding by resting andreactive microglia． Neurocytology, 1987；16：249

10．Virtanen AL, et al ．Fluorochrome – coupled lectinsreveal distinct ceullar domains in human epidermis．J Histochem Cytochem, 1986；34(3)：307

11．Watanalte M, et al．Discrete distribution of bindingsites for Dolichos biflrous agglutinin and for peanut agglutinin (PNA)in mouseorgan tissues．J Histochem Cytochem, 1981；29：779

12． 王益寿．葡萄球菌蛋白 A 的性质和应用．国外医学(生物制品分册),1980；4：145

13． 张华忠, 等． 凝集素在人体正常组织的定位．中华医学杂志,1985；65：144～147

14． 沈铭昌, 等．应用 DBA 标记胃粘膜上皮化生与胃癌的关系．肿瘤,1987；7：55～57

15．Ueda T, et al．Lectin histochemistry of maligantfibrohistocyte tumors．Am J Surg Pathol, 1987；11(4)：257

16．Ree HJ．Lectin disfinction of benign frommalignant histocyts．Cancer, 1985；56(8)：2046

第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学分辨率的限制，不可能从细胞超威结构水平观察和研究免疫反应。因此，Singer 于 1959 年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白（ferritin）标记抗体的方法，为在细胞超威结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白 A - 铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫细胞化学技术（以下简称免疫电镜技术技术）区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：

一、组织固定与取材在这方面的要求是即要保存良好的细胞超威结构，又要注意保持组织的抗原性。因此，选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸 - 赖氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde 简称 PLP 液）。也有采用 Bouin 氏液、Zamboni 氏液或 4% 多聚甲醛液（其配制法见附录）。国外不少文献推荐应用 PLP 液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择性地使糖类固定，就可使抗原性稳定。PLP 液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

二、免疫染色分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层 thermanox 塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构往往保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片，寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验，半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察（指 PAP 染色法），免疫反应部位呈黑点状。在 HE 或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片，可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，可取相连续的起薄切片，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

包埋前染色法的优点是：①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。

2．包埋后染色 组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又名之载网染色（on grid staining）。必须指出的是：①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见，作者经验一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为，从理论上讲，四氧化锇具有保存抗原的作用，但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性，还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此，免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液，无水酒精中 NaOH 饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂，取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前，以 H2O2 液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。

3．超薄冰冻切片 按照 Tokuyasu 建立的方法，将组织置于 2.3mol/ L 蔗糖液中，以液氮速冻，在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。

三、包埋（一）树脂包埋

国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。

（二）低温包埋

常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于 60 年代，80 年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA）,Lowicryls, LR White 和 Lr Gold 等，目前国外生产厂家有 Polysciences INC , Reichert—Jung 和 LKB 等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下：

1．Lowicryls 是丙烯酸盐（acrylate）和甲基丙烯酸盐（methacrylate）化学物质，包括 K4M、HM20、K11M、KM23 等系列产品（Polysciences INC），其特点是能在低温下保持低粘度（K4M：–35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波长 360nm）下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无度。其中 K4M 和 K11M 具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20 和 HM23 具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M 的应用和报道较多，现侧重介绍如下：

（1）包埋剂的配制：商品提供的 Lowicrys 包埋剂由三个部分组成：单体（Monomer），交联剂（Crosslinker）和引发剂（Initator）。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：

K4M：单体 17.30g

交联剂 2.70g

引发剂 0.10g

K11M：单体 19.00g

交联剂 1.00g

引发剂 0.10g

作者的经验，可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒轻搅 3～5min 或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。

（2）生物样品处理程序（Lemanski 等 1985）

①动物麻醉取材，以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在 9℃固定 2h。

②磷酸缓冲液含 7% 蔗糖，pH7.2, 冲洗过夜，0℃

③0.1mol/L 磷酸缓冲液，pH7.2, 冲洗，0℃

④脱水：65% 乙醇，1h ,0℃

80% 乙醇，2h,-35℃

LowicrylK4M：80% 乙醇 =1：11h -35℃

LowicrylK4M：80% 乙醇 =2：11h -35℃

100%Lowicryl K4M 1h -35℃

100%Lowicryl K4M 过夜 -35℃

⑤包埋：新鲜 K4M 置于胶囊内，将组织移入，在 -30℃～-40℃以紫外线灯波长 360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距 30～40cm 照射 24h 使之聚合。如为 100W 灯泡，照射距离应大于 85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射 2～3 天，可增加其硬度，便于切片。

（3）免疫染色

①切片（厚 50～70nm）贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm）滤过。

②正常羊血清 30min。

③第一抗血清（PBS 稀释），37℃2h。

④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法），以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡 30min，然后在第二烧杯中洗荡 1h。

⑤正常羊血清 30min。

⑥第二抗血清（胶金标记抗体）以正常羊血清稀释为 1：1，以镍网置于血清滴上孵育 1h。

⑦冲洗如④。

⑧覆于 2%OSO4 水溶液上，30min。

⑨冲洗如④。

⑩干燥后在电镜下观察。

（4）Lowicryl K4M 快速包埋染色法（Altman 等 1984）

①包埋剂的配制：单 体 13g

交联剂 2g

引发剂 75mg

②生物样品处理：除了聚合这一步骤外，下列所有步骤都在 20℃进行。

1）组织用 3% 戊二醛—3% 多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.4, 在 20℃固定 1～2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。

2）脱水：在 50%、75% 和 90% 的双甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF）内系列脱水，每步 10min。

3）浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min

LowicrylK4M:DMF=1:1 15min

100%Lowicryl K4M 20min

100%Lowicryl K4M 25min

4)包埋与聚合：组织移入装满 K4M 的胶囊中，以紫外线灯照射聚合（紫外线灯条件同上），灯和组织距离 10cm,4℃照射 45min，组织块在室温进行超薄切片（切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面）。

5）以覆有碳膜的镍网捞取切片。

6）免疫染色。

整个包埋时间仅需 4～5h。

Lowicryls 应保存在暗处，-4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部，氧化重金属如 KmnO4 能与包埋剂作用而影响染色效果，以不用为佳。

2．LR White 和 Lr gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂，具有极低的粘度（8cps）和较强的嗜水性，因此有较强的穿透性，有利于抗体（或抗原）和免疫化学物质穿过 LR 树脂，达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜（半薄切片）和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至 70% 乙醇即可，能较好地保持抗原性。Lr white 和 Lr gold 在国外提供厂家有 Poly-sciences INC 等，Lr gold 是一种光引发低发低温聚合的包埋剂，对于免疫细胞化学特别适用，能最大限度地保持组织的抗原与抗体活性，其最佳光聚合温度在 -25℃，在聚合后呈现金黄色，因而得名。Lr white 可在热和冷两种情况下聚合，热聚合在 60℃，24h，冷聚合在 -25℃，需加加速剂（accelerator）调整配制比例。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。

3．GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即 2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA）的缩写。远在 60 年代，电镜工作者就试图将其作为生物包埋剂应用于光镜和电镜。GMA 作为电镜包埋剂的优点是电子密度大，影像反差好。但存在三个主要缺点：一是包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。二是聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。三是缺乏稳定性，不能承受电子束的轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而 GMA 包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者如 Leduc 和 Bernhard（1986）尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入适量的增塑剂如聚乙二醇 400（PEG400）以改变其硬度，加入适量的闻联剂乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate）以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构，选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide），温度范围 -10℃～-30℃。经过不断的配制改进，现 GMA 已广泛应用于半薄切片（1～3μm）的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将 GMA 包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下：

（1）GMA 单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每 25ml 单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡 5min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。

（2）包埋剂的配制：

a. 100%GMA66.5ml

N—甲基丙烯酸丁酯 28.5ml

5% 乙烯二甲丙烯酸酯 5.0ml

1.5 % 过氧体苯甲酰 1.0g

1.0%PEG4001.0ml

b.A 液：

GMA 单体液 90ml

PEG 400 5～9.4ml

过氧化苯甲酰 0.2～0.69g

搅拌溶解后置棕色瓶内；4℃保存。

B 液：

PEG 400 20ml

二甲基苯胺 1ml

应用时 A：B 按 10：1 比例充分混合（张承志等 1986）。

（3）生物样品处理：组织固定可用 PLP 液或 1% 戊二醛溶液（磷酸缓冲液配制，pH7.4）。经系列酒精脱水至新鲜的 GMA 单体溶液中浸 24h。以上步骤可在室温或 4℃进行。

（4）包埋聚合：组织移入盛潢包埋液的胶囊内，先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在 4℃，以紫外线灯（波长 360nm）在距胶囊底部 10～20cm 处进行照射 12～16h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢入热水中以去除胶囊外壳。

（5）切片贴在镍网上，按 PAg 技术进行包埋染色，其区别于 EPON 包埋剂者，在于 GMA 包埋切片染色所需时间较短，在第一抗血清中，GMA 室温只需孵育 1h，而 EPON 包埋切片需 16～20h；在第二抗血清，即 Pag 复合物中室温 30min，而 EPON 包埋切片需 1h。铀、铅双染后，电镜观察。

低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。

四、对照试验为确定方法的特异性，免疫电镜技术也需进行对照试验（同第一章）。

总之，不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响，而 H2O2 能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中，应同时注意到这两个方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底，否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应产物的显示和观察。根据作者经验，以塑料水壶加锥形喷水头喷洗，与镍网面成平行方向，即顺网面喷洗，较之目前通用的杯水洗涤法易于达到清洁目的。冲洗的残留水滴以滤纸吸干时，应注意不要触及载网本身。可将滤纸剪成三角形，以尖端接触水滴，即可达到吸干水份的目的，整个过程中，必须应用双蒸水，容器应专用。

第二节 免疫铁蛋白技术一、基本原理铁蛋白是一种含铁约占 23% 的蛋白质，分子量 460kD, 直径 10～12μm。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径核心为 55～60nm 含 2000～3000 个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。铁蛋白来自许多动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高。因而，商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。

二、铁蛋白的提取和纯化取健康的马脾（新鲜或冰冻均可），去除脾外的淋巴结和脂肪组织，按湿重 1：1.5 或 1：2 加入蒸馏水，用组织匀浆器将组织匀浆，置水浴中加热至 75～85℃，使铁蛋白以外的蛋白质变性，冷却后用 2～4 层纱布过滤，滤液离心取上清液，每 100ml 上清液中加入 35g 硫酸铵，充分搅拌使铁蛋白沉淀析出，4℃过夜，3000～10000r/min 离心 20min，弃去上清液，刮取沉淀物置透析袋内，剩余沉淀物以蒸馏水洗后，一并加入透析袋内对水透析，除去硫酸铵。100ml 中加入 4～5g 硫酸镉使炎结晶，在室温或 4℃冰箱内使之出现铁蛋白结晶。此铁蛋白结晶以 2% 硫酸铵（pH5.58）溶解后，如上述再用硫酸镉使之结晶。反复溶解，结晶六次，达到纯化。纯化后铁蛋白在半饱和的硫酸溶液内可保存 1～2 年。用时以蒸馏水透析除盐后即可应用，应用前可以用负染色法在电镜下观察，了解铁蛋白的完整性和纯度。

商品制备的铁蛋白是用 2% 硫酸铵溶液稀释的 1%～2% 溶液（pH5.85）。为了在应用中得到满意的结果，应用前必须将商品制备的铁蛋白进一步纯化。纯化的方法是用 0.1n NaOH 或 0.1n HCl 调整 pH 值至 5.85，然后加入 20% 硫酸镉溶液使其在铁蛋白液中最终浓度为 5% 硫酸镉，此溶液置于 4℃冰箱内 2h（或过夜）至结晶完成，离心 1h（2000r/min）充上清液。铁蛋白结晶再溶解，离心除去不溶性颗粒，倾出上清液，加入 5% 硫酸镉再结晶，至在显微镜下呈棕红色铁蛋白结晶为止。将结晶溶于 2% 硫酸铵溶液中，用 50%5 硫酸铵溶液沉淀三次，第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸馏水中，先对自来水透析，再对 0.05mol/L,pH7.5 磷酸缓冲透析 12～24h。纯化的铁蛋白溶液用 100000r/min 超速离心 2h，除去 3 / 4 无色上清液，沉淀物（内含铁蛋白）在 4℃过夜，待完全融解后，用微孔滤过器（Millipore filter, 孔径 0.25～0.45μm）过滤，保存 1～2 年内仍可使用。

三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合一般用低分子量的双功能试剂把两者联结起来，常用的双功能试剂有间苯二甲基二异氰酸盐（简写 XC）。甲苯 2，4 二异氰酸盐（简写 TC）。邻茴香胺（简写 BDD）；对，二氟一间，间，二硝基二苯矾（简写 FNPS）和戊二醛。近年来，普遍认为戊二醛作为联结剂效果较好，对抗体活性影响小，标记抗体产量高。分为一步法和二步法，现简介如下：

1．一步法 以 15mg 铁蛋白和 3mg 球蛋白溶于 0.9ml 0.1mol/ L 磷酸缓冲液中，pH7.0, 加入 0.1ml 新鲜配制的戊二醛溶液，使其最终浓度为 0.005%～0.05%, 加入 0.02% 叠氮钠（NaN3）防腐，此混合液置 37℃24h，无需搅拌，结合完毕后加 0.01mol/ L 赖氨酸中止反应。

2．二步法

（1）在含 50～80mg 铁蛋白的 0.1mol/ L 磷酸缓冲液（pH7.0）中，加入稀释的戊二醛，使其最终浓度为 0.05%～0.15%，总体积为 1ml。

（2）置 37℃作用 2h 后，经葡聚糖 G—25 滤柱，除去未结合的戊二醛。为避免不必要的稀释，只收集脱峰的中间部分。然后加入球蛋白（铁蛋白与球蛋白之比为 5：1）即铁蛋白最终浓度为 15mg/ml，球蛋白 3mg/ml。

（3）混合液置 37℃，作用 12h（无需搅拌），加入 0.01mol/L 的赖氨酸以中止进一步交联。两步反应都需在 0.02% NaN2 防腐条件下进行。

四、电镜标本的制备方法1．固定 同常规电镜一样，应用醛类和四氧化锇双固定，以维持细胞和组织的超威结构。有文献报告以 4% 的甲醛溶液在 pH7.2 的磷酸缓冲内，在 0℃进行固定，并用四氧化锇作后固定，不会影响抗原的反应能力。高锰酸钾能使大部分抗原失去活性，一般不宜采用。另外，铁蛋白标记抗体的特点之一是分子量大。因此，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液，否则需采取适当的措施，打破细胞膜，增强细胞对标记抗体的通透性，常采取以下方法：

（1）冻融法：将小块组织或细胞经固定后，冻融一次，使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。

（2）冰冻切片法：固定后组织快速冷冻，切成 10～15μm 左右薄片，溶化的切片直接浸泡于铁蛋白标记抗体液中。

（3）有报道经戊干杯固定后，浸入 4×10-3mol/ L 洋地黄皂甙液中 1～2min，能有助于增强细胞膜的穿透性，使标记抗体液进入细胞内。

2．免疫反应处理 常用包埋前染色，分直接法和间接法两种。在染色前，将组织切成约 10～20μm 厚的薄片。

（1）直接法：将薄片直接浸泡于标记抗体液中，室温或 37℃作用 1～2h 或更长；缓冲液（有人提倡用冷缓冲液）浸漂，除去未结合的标记抗体溶液，然后转入常规双固定和电镜包埋。

（2）间接法：

①将组织切片浸于第一抗体液中，室温 30～60min。

②以大量冷缓冲液充分搅拌洗涤，至少 3 次，每次 30min。

③浸入铁蛋白标记抗体液中，室温 30min。

④如②，用缓冲液充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片。

⑤将离心沉淀小块，用四氧化锇固定 30min。

⑥常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。

第三节 免疫酶细胞化学技术一、基本原理免疫酶细胞化学技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。在光学显微镜下观察时，要求反应的终末产物是不溶性的有色物质，具有可观察性。在电镜下观察时，则要求底物的终末产物具有较高的电子密度。由于辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase, HRP）具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶—抗过氧化物酶技术（即 PAP 法，见第四章）。

二、电镜标本制备方法免疫酶细胞化学技术可用于包埋前和包埋后染色，但以前者应用较多。

1．单层细胞培养物免疫酶染色法（1）用 4% 多聚甲醛（在 0.05mol/l 磷酸缓冲液中，pH7.2）在原位固定（4℃）1h。

（2）用 0.05mol/l PBS 充分洗涤后，用 HRP 标记的抗体血清作用 18h，再用 PBS 充分洗涤。

（3）2% 戊二醛固定 1h，再水洗。

（4）呈色反应，用 DAB—H2O2呈色反应，水洗。

（5）1% 锇酸后固定 30min～1h，原位用环氧树脂包埋，光镜作半薄切片定位，作超薄切片。

2．组织切片酶标记抗体染色法（1）1mm 厚组织块，在 4 ℃下用固定液固定后，置于含 4.5% 的蔗糖 PBS（0.05mol/l pH7.2），4℃中漂洗，换数次固定液，过夜。

（2）随后，作 10～40μm 的冰冻切片，放入第一抗体血清作用 12～18h，4℃，用含蔗糖的 PBS 洗数次。

（3）置于 HRP 标记抗体液（第二抗体）4℃过夜。然后用 4℃含蔗糖 PBS 反复冲洗数次。4℃浸漂过夜。

（4）2.5% 戊二醛（pH7.4 磷酸缓冲液）再固定 1h，4℃用含蔗糖 PBS 反复冲洗去戊醛，每次 5min，共洗 3 次。

（5）DAB-H2O2显色 15～30min。

（6）0.05mol/l PBS 冲洗 3 次，每次 30min，再置于室温中用 1%～2% 锇酸固定 1h，脱水、包埋、切片复染和观察。

3．PAP 包埋前染色法（Pickel 等，1975）经固定组织、应用振动切片机（Vibratome）切 35～50μm 厚片，或用组织铺片，以漂浮法在反应板上进行下列步骤：

（1）正常羊血清（1：30PBS 稀释），室温孵育 30min。

（2）第一抗体（A 种动物抗血清），4℃湿盒中 48～72h。

（3）羊抗 A 种动物血清（1：100）室温 30min。

（4）A 种动物血清 PAP 复合物（1：100）室温 30min。

（5）DAB·4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)，室温 1.5min。上述每一步骤后应用 PBS 洗涤（5min×3 次）。

（6）在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织，用 0.1mol/ L 磷酸缓冲液稀释的 1% 锇酸（pH7.4）后固定 30min～1h。

（7）按常规电镜样品制备，脱水、包埋、超薄切片、染色观察。

4．PAP 包埋后染色法（Ordronneau, 1982）（1）将载有切片的镍网（或金网）在 5% 的 H 2O2液中蚀刻（etch）2～3min。生理盐水冲洗，滤纸吸干。

（2）正常羊血清用 0.05mol/L Tris 盐液（TBS）稀释成 1：30，pH7.0，室温 5min。

（3）兔抗血清（第一抗体），内含 1% 正常羊血清，用 0.05%mol/l Tris 缓冲液稀释，pH7.6,4℃，48h 后以 Tris 缓冲液洗涤。

（4）正常羊血清 1：30，室温 5min。

（5）羊抗兔 1：10（第二抗体，0.05mol/l Tris 缓冲液稀释，pH7.0），室温 5min，Tris 缓冲液洗涤。

（6）正常羊血清 1：30，室温 5min。

（7）兔 PAP 复合物，内含 1% 正常羊血清，室温 3min,Tris 缓冲液洗涤。

（8）DAB—H2O2液显色（含 H 2O20.01%～0.03%）, 室温 3min。

（9）4% 的磷酸盐缓冲的锇酸溶液 10～15min，蒸馏水洗涤（此步用于改善微细结构的反差），电镜观察。

5．PAP 免疫电镜双重标记在连续的超薄切片上进行，用包埋后染色法在相邻的两张切片上分别以不同的抗体进行免疫染色。可在超威结构水平判定细胞内抗原共存的情况。

第四节 免疫电镜胶体金标记法金标法是 Faulk 和 Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了要喜的进展，解决了一些过去未能解决的问题，80 年代以来似有取代免疫电镜 PAP 技术的趋势。胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点：首先，手续不如 PAP 法烦琐，不需用 H 2O2等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少。其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别。因此，金标法还可以和 PAP 法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。另外，利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。由于金具有强烈的继发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性，对人体无损伤。胶体金及胶体金标记物的制备见第五章 第 3 节。在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中，胶体金的标记术被科技工作者认为是当前最理想的标记物（详见第二十章）。

一、电镜水平的免疫金染色法应用于电镜水平的免疫法，可分为包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原标记，如需穿透细胞膜，则需辅以冻融法或加入 Triton X—100、皂素等活性剂，后者会加重细胞超威结构的破坏，因此，现较普遍采用包埋后染色，现分别介绍如下：

1．包埋后染色（1）超薄切片厚 50～70nm 左右，载于 200～300 网孔的镍网上。

（2）置 1%H2O2内 10min 至 1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入 1%H2O2液 1 滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以 1% 过碘酸钾（KIO4）代替 H 2O2的。

（3）双蒸水洗 3 次，每次 10min，第 1，2 次洗法如（2），浮于液滴上，第 3 次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。

（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室温 30～60min，以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。

（5）PBS 漂洗 3min，洗 1 次（有人主张不洗）。

（6）滤纸吸干，孵育于第一抗体血清滴上，先室温预孵 1h，再置于 4 ℃24～36h。

（7）PBS 漂洗 3min，3 次。

（8）PBS（内含 1% 的牛血清白蛋白）pH8.2 中，5min，此步为胶体金结合作准备。

（9）胶体金标记抗体液 1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液，室温孵育 10min 至 1h。

（10）双蒸水洗 3min，3 次。

如作双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤（2）～（10）。

（11）5% 醋酸铀（双蒸水配制）染 5min，然后用双蒸水洗。

（12）枸橼酸铀（或醋酸铅）染色 5min，双蒸水洗净。

（13）电镜观察。

2．包埋前染色（1）组织经过适当固定，为增强细胞穿透性，可在固定液中加入皂角素（Saponin），使其浓度为 0.01%，经含皂角认固定剂处理 5～8min 后，应用 0.01mol/l PBS Ph7.4 冲洗 12h 左右，中间换洗 3～4 次。

（2）组织切片贴于明胶涂抹的坡片上，细胞可制成混悬液，用离心法操作或制成涂片。

（3）0.05mol/l PBS pH7.4 洗 3min。

（4）以 1：5 正常羊血清处理切片 30min 室温，以阻断非特异性吸附。

（5）第一抗体 4℃孵育 20h 后室温 2h 或过夜。

（6）0.05mol/l TBS pH7.4 洗 3min×3。

（7）0.02mol/l TBS pH8.2 洗 3min×3，为与胶体金结合作准备。

（8）再次阻断非特异性吸附，同（4）。

（9）以金标记的第二抗体（工作浓度 1：40 左右）在室温下孵育 1h。

（10）0.05mol/l TBS pH8.2 洗 3min。

（11）0.05mol/l TBS pH7.4 洗 3min×3

（12）1% 锇酸（0.1mol/l PBS 溶液）1h。

（13）双蒸水洗 15min。

（14）系列酒精或丙酮脱水，包埋、超薄切片。（15）枸椽酸铅对照染色。

为增加抗非特异性染色，有的实验室倾向在 TBS 中加入 1% 小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma）。理想的免疫金染色切片，背景应清洁，无残留的金或其他无机盐颗粒，金粒集中在抗原、抗体反应部位。要获得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗体血清的高度特异性和亲和力；②被检组织应有较高浓度的抗原；③冲洗液的清洁度，冲洗的彻底程度以及整个过程中应用的各种器皿的清洁度等；④所有溶液最好用微孔滤过器（milipore filter 滤过），滤膜孔径 0.2～0.45μm，所有器皿应清洁和专用。整个操作过程应在湿盒内进行，以使载网保持湿润。

二、胶体金标记蛋白 A 技术（Protein A-goldtechnique, PAg 法）在电镜水平应用较为广泛，因该法具有特异性中、灵敏度高、方法简便和背景染色淡等优点。蛋白 A 的免疫特异性在第五章 已作了介绍，PAg 复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白 A 和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白 A 的活性，又能保持高度的稳定性，PAg 复合物分子最小易于穿透组织。

1．蛋白 A—金（PAg）复合物的制备（Slot 和 Geuze,1981）（1）胶体金液的制备，应用枸椽酸三钠还原法（见第五章）。

（2）待标记蛋白质和金溶液的准备，同前。注意点是用 0.2mol/l K2CO3将金溶液 pH 调至 5.9～6.2 之间。

（3）确定胶体金与蛋白 A 的结合用量比例。取一系列盛有 0.1ml 胶体金液的小玻璃管，分别加入不同量的蛋白 A，5min 后，再各加 0.25ml 10% 的 NaCl。如加入的蛋白 A 浓度不够，不能稳住金粒，在电解质 NaCl 的影响下，金粒聚合沉淀，溶液由红变蓝。选择能防止溶液由红变蓝的最低浓度的蛋白 A 的量作为两者的结合比例。以枸椽酸钠法制成的胶体金每毫升约需要 5μg 蛋白 A 来结合，方能保证其稳定性。

（4）胶体金与蛋白 A 的结合和纯化，依上法测得所需的比例超过 10%，即每 30ml 胶体中加入 2mg 蛋白 A，5min 后，加入 0.3ml PEG 作为稳定剂，然后以 15000r/min 离心 45min（不同方法制备的金离心速度不同），略带红色的松散的复合物沉淀即为 PAg 复合物。小心弃去上清液，加入 PBS 冲洗，如上，松散的 PAg 复合物置于 PBS 溶液中，按 0.2mg/ml 的比例加入聚乙二醇作为稳定剂，保存于硅化的玻璃器皿中备用，也有主张将上述 PAg 复合物放入 3～6ml 5% 甘油—0.05% 聚乙二醇—0.02% 叠氮钠混合液中，再离心，弃去无色上清液后，收取管底部浓缩纯化的 PAg 复合物置 4 ℃保存。

据文献报告，此 PAg 复合物的原液在 4 ℃可保存达一年之久。

2．在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须 1% 卵白蛋白—PBs（pH7.4）或 1% 卵白蛋白—0.05mol/l Tris 缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为 PAg 复合物能够与正常血清组中的 Ig 结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和 PBS 冲洗后作第二抗血清即 PAg 复合物孵育前的准备时，应用的 PBS 或 TBS 的 pH 应变更为 pH7.4。在变更这两步后，其它可参照本节 中包埋前、后染色法进行。也可采用下列步骤进行包埋后染色。

（1）载有超薄片的镍网或金网浮于 1% 卵白蛋白—PBS 液滴上，室温约 5min。

（2）载网不冲洗，直接移至第一抗血清液滴上，在室温孵育 2h 或 4℃18～24h。

（3）PBS 冲洗 3min×2 次。

（4）将 PAg 原液稀释 10～20 倍，载网浮于该液滴上，室温孵育 1h。

（5）PBS 冲洗 5min×2 次。

（6）5% 醋酸铀水溶液染色，水洗。

（7）枸椽柄铅染色。

（8）电镜观察。

三、胶体金双标记技术（常用为蛋白 A—胶体金）1．单面法 以不同直径的金粒分别标记两种不同的抗体，以间接法先染第一种抗体，洗净后再染第二抗体。

2．双面法 以不同直径的金粒标记的抗体于镍网的两面分另进行免疫染色。本法的优点是可防止两种金标记的抗体的相互干扰，又可防止第一次应用的一抗与其相应的抗原相结合，占据了空间，第二次应用的抗体没有适合的空间使之与相应的抗原相结合。

3．异种动物抗原—抗体染色法 如一抗分别用人与兔抗血清，人抗组织抗原 A，兔抗组织抗原 B。第二抗体分别以不同直径金粒标记的抗人和兔免疫球蛋白。由于种属不同，两种抗血清不会互相干扰，在应用一抗和二抗时都可将两种血清一次混合使用，将四步减少为两步。

4．金标记抗原检查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法）此法是 Larson（1977）年首先提出的，应用放射性同位素如125 I 或酶标记抗原进行染色。先用特异性抗体与组织抗原反应，标记的纯抗原又与特异性抗体反应。Larson（1980，1981）又在此基础上提出应用胶体金在电镜水平进行双抗原甚至多抗原定位。GLAD 原理是：双价的 Ig 抗体分子过量地加到有抗原的组织切片上，使分子的两个抗原结合点中有一个结合到组织抗原上，而另一端可与标记金的抗原起反应。双标记时，预先将两种不同的抗原标以不同直径的金粒，可分别与相应的第一抗体相结合，从而显示出两种抗原在组织切片的定位。此法的优点是标记物所显示出的组织抗原的部位经过两次选择，标记了抗原只能与相应的特异性抗体相结合而不能与切片中非特异性 Ig 相结合，因此具有较高的特异性。但由于使用此法时需备有与欲检抗原相同的纯抗原，并要对不同抗原分别进行标记，非一般实验室所能做到，所以至今尚未被广泛应用。

双面金标记法操作程序（Cai et al 1993, 改良自 Bendayan et al 1982）.

（1）镍网面 A（树脂包埋）

①蒸馏水冲 10min。

②10% H2O2蚀刻 10min 室温

③10% 正常血清（以 0.5mol/l Tris 缓冲液 pH7.4、含 1%BSA 和 2%Tween20 稀释，简称 TBT 缓冲液）室温 30min。

④以滤纸吸去多余液体，覆于特异性第一抗体 1：500（Tris 缓冲液，pH7.4, 含 1%BSA 和 0.1% 叠氮钠）4℃，孵育过夜

⑤彻底清洗，应用 0.5mol/L Tris 缓冲液 pH7.2, 不含 BSA

⑥继之用 0.5mol/L Tris 缓冲液 pH7.6, 含 1%BSA 冲洗

⑦0.5mol/L Tris 缓冲液 pH8.2, 含 1%BSA，室温孵 15min

⑧羊抗兔 IgG 标记以 15nm 金粒，应用 0.5mol/l Tris 缓冲液 pH8.2、含 1%BSA 稀释 1：40，孵育 2h，室温

⑨0.5mol/L Tris 缓冲液 pH7.4 冲洗

⑩蒸馏水冲洗

（2）镍网面 B，重复①～⑩，只在第④时更改另一特异性一抗，在⑧时羊抗兔 IgG 标记以 5nm 金粒。

（3）铀铅双重染色，电镜观察，可见二种不同直径金粒标记。

注意事项：①所有溶液均须经加有微孔滤纸（0.45μm 孔，国内外现均有商品提供）的注射器过滤，过滤后直接以注射器冲洗。②滤纸最好用无纤维吸水滤纸。③冲洗在胶金标记技术上是个决定性关键，仅次于抗体血清的纯度。笔者的体会是一般应漂洗 3×5min，以注射器喷水漂洗效果优于杯漂洗法，但漂洗水流需与网面平行，勿使水压破坏切片。

四、免疫电镜金—银法染色技术关于免疫金银细胞化学的原理、试剂配制和光镜显示技术在本书第五章 已作了较详尽的叙述。免疫金银细胞化学技术说可应用于电镜水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步骤如下：

（1）组织固定振动切片机切片 10～30μm。

（2）人 3% 正常羊血清，含 0.1%Triton X—100 的 PBS 孵育 30min，以封闭非特异性结合部位

（3）1% 硼氢化钠的 PBS 孵育 30min。

（4）一抗 37℃，2h。

（5）PBS 含 0.1%BSA pH7.4 冲洗 3min×3 次。

（6）PBS 含 0.1%BSA pH8.2 冲洗 3min×3 次。

（7）人 10～15nm 金标羊抗兔抗血清，工作浓度约 1：10，37℃孵育 45min。

（8）硝酸银液物理显影（详见第五章 第六节）。

（9）在解剖显微镜下取免疫反应阳性部位，人 1% 锇酸后固定 20min，常规脱水，树脂包埋。

（10）超薄切片机切 0.1μm 左右半薄切片, 定位阳性反应部位, 制超薄切片。如有暗视野微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位，微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位。

（11）铀—铅电镜染色，电镜观察。

免疫金银法敏感度高，金银颗粒电子密度高，反差强；应用包埋前染色可先定位阳性反应部位再作电镜超薄切片，获得阳性反应机率高，特别适用于含微量抗原的部位，如突触等。其不足是须经暗室显影，手续较烦杂，包埋前免疫染色易增加非特异性染色。另外，由于单个金粒周围结合的银粒不是固定的，受多种因素影响。因此，电镜免疫金粒染色法的金粒银粒计算不适于做半定量观察，误差较大。

第五节 其它免疫电镜技术一、凝集素电镜标记技术凝集素的特性及标记原理详见第五章，近年来，凝集素电镜标记技术应用日益广泛，且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多，常用的有凝集素—酶（常用为 HRP）、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术（包埋前染色）简介如下（Sterit 和 Kreatzberg,1987）。

（1）固定：常用为 PLP 或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织，可将已藻注动物在 4 ℃过夜，次日取脑组织置 0.1mol/ L 磷酸或二甲胂酸钠缓冲液（含 7.5% 蔗糖）中漂洗。

（2）振动切片机（Vibratome）切 60μm 的厚片。

（3）切片孵育在 PBS（内含 0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和 MnCl2）10min（有作者主张此步可省略）。

（4）为增强细胞通透性，切片可孵育于含 0.1% 胰蛋白酶和 0.1CaCl2水溶液中，pH7.8,37℃孵育 30min。

（5）PBS 洗 3 次，每次 2min。

（6）凝集素—HRp 1：10 在 PBS 中（含 0.1%Triton X–100）4℃过夜，最好不断轻轻振荡。

（7）PBS 洗 3 次，每次 2min。

（8）DAB-H2O2显色。

（9）1%OSO4水溶液固定。

（10）系列酒精脱水，EPON 包埋，切片。

（11）电镜沿—铀双染观察。

凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上，易与电子染色相区别。

二、扫描免疫电镜技术扫描免疫电镜技术可为研究细胞或组织表面的三维结构与抗原组成的关系提供可能性。

（一）标记物应用于扫描电镜的标记物应能在扫描电镜可分辨的范围内，并能对细胞或组织抗原有较好的定位能力。在选择标记物时应根据研究目的而定，如标记细胞等由于体积较大，可用体积大的标记物；如鉴别阳性（标记细胞）与阴性（未标记细胞），而要定位受体等则需选用较小的，易于辨认的标记物。

常用的标记物为颗粒性标记物。依其特性可分为：

1．蛋白类 如血蓝蛋白、铁蛋白等。

2．病原体类 如烟草花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、噬菌体 T 4、大肠杆菌 f 2、噬菌体等。

3．金属颗粒胶体金、免疫金银标记技术和同位素放射性自显影的银颗粒等。其中以金属类颗粒标记物应用最为广泛。最常用的是胶体金，胶体金商品提供的直径从 3～150nm 不等，扫描免疫电镜常用的金颗粒直径在 30～60nm 左右为宜。由于金本身系重金属，有较强的发射 2 次电子的作用，故不需喷镀金属膜，这是胶体金应用于免疫扫描电镜的标记优于其它标记物之处。免疫金银染色能加强细胞或组织表面金属颗粒聚集的密度。金、银粒在电镜显示为电子密度高，外形清晰的颗粒易于识别和定位。病原体标记物主要利用其特异殊的外形和结构以达到标记定位的目的，如噬菌体 T 4形似星形的球拍，头部大约 100nm 直径，呈六角形星状，尾长约 100nm，由颈部与头部相接；烟草花叶病毒为 15×30nm 的杆状病毒，而南方菜豆花叶病毒是直径 25nm 的园形颗粒，这些病原体的典型外形很易于辨认。铁蛋白由于含有致密的铁离子核心具有较高的电子密度，从而达到标记定位的目的。血蛋白是由海螺类软体动物中提取的多分子聚合物，其外形为 35×50nm 的柱状体，多应用于病毒研究，但也有利用血蓝蛋白与过氧化物等的糖蛋白部份可与凝集素相结合的特性，进行细胞膜受体的定位。

（二）免疫标记方法金属类标记物的免疫标记法同切片免疫染色，即将标记物与抗体相结合，通过直接或间接法显示抗原部位。胶体金可与蛋白 A 相结合后与 IgG 分子中的 Fc 段相结合。哪与卵白素（a-vidin）相结合可与结合抗体的生物素（biotin）反应。免疫金银染色法在胶体金标记后，再进行银液显影。病毒（包括噬菌体）标记物多采用不标记抗体法，即搭桥法。此法的原理是采用同种动物制备抗原的特异性抗体与标记物抗体（例如兔抗 A 抗原与兔抗 HRP）。再用另一种动物制备第一种动物血清抗体的抗体（例如羊抗兔 IgG 抗体）。利用后者为桥，把抗原的特异性抗体与抗标记物抗体结合起来，后者再与标记物结合，以达到定位抗原的目的，其基本原理与 PAP 法类同。病原体免疫标记可不用标记物显示，而利用其形态学特征定位或采用抗原抗体凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特异性抗体在与相应的抗原反应后，使后者之间发生交联而凝集，经浓缩后用阴性染色法（负染）便可在电镜下显示定位部位。

（三）扫描免疫电镜的具体操作步骤1．标本处理

（1）细胞悬液：用 10ml PBS 内含 1mg/ml 牛血清白蛋白（PBS—BSa）悬浮细胞，离心 250g,5min×2。加入 PBS—BSA 至 105～106细胞 /ml，振摇成单细胞悬液。BSA 能减低生物标本的非特异性吸附，但注意浓度应适宜，过高会减弱特异性反应。

（2）细胞附着于固体支持物：由于固定与免疫标记的孵育过程会引起细胞凝集，妨碍细胞表面的暴露，而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变。因此，通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或涂有带正电荷聚合物的盖玻片上，在粘附之前可依（1）法清洗标本，以除去细胞表面的附着物。固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜的载片或直径 13nm、孔径 0.22 或 0.45μm 的过滤膜，载片制备方法：多聚—L—赖氨酸（Sigma）100μg/ml 重蒸溶解涂抹于载片上，4℃30min 后倾倒掉表面液体，令其自然干燥。注意载玻片事先需要清洁液浸泡，水漂洗过夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用绸巾拭干。将细胞悬液（如细胞数少可事先离心，取沉淀细胞），滴于滤膜或载片上，由于多聚赖氨酸的粘附性，在固定及免疫标记过程中细胞不至于脱落。但注意勿使细胞干燥。

（3）组织切片与固体组织：组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡，由二甲苯经梯度酒精至水。组织切片与固体组织（勿过大）均应以 PBS—BSA 冲洗，并保持湿润避免干燥。

2．固定

（1）固定前用 PBS—BSA 冲洗 5min×3。

（2）选择加入适合的固定剂；可为 4% 多聚甲醛 +0.1%～0.5% 戊二醛在 pH7.4 的磷酸缓冲液中。室温固定 10～60min，或 4 ℃30～120min。

（3）PBS—BSA 冲洗 5min×3。

（4）除去残留的自由醛基，选以下任一方法：

①0.5mg 硼氢化钠 /1ml PBS 10min（新鲜配制）

②0.05～0.2mol/l 甘氨醊或赖氨酸—HCl/PBs 30～60min。

③0.1～0.5mol/ L 氯化钠 /PBs 30～60min。

④PBS—BSA 冲洗 5min×3。

3．免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。

免疫金银染色法举例（张留保等，1997）

（1）血细胞以 PBS—BSA 冲洗 5min×3。

（2）2% 多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h

（3）PBS 或 TBS 反复冲洗 5min×3。

（4）胶体金免疫标记程序（略）

（5）暗室显影液显影

（6）扫描电镜样品制样

（7）观察

作者在血细胞膜外显示了密集的金银粒标记（特异性标记膜的谷胱甘肽过氧化物酶及激素肽）。

4．常规扫描电镜标本处理

（1）PBS—BSA 冲洗 5min×3。

（2）后固定：2.5% 戊二醛 0.1mol/ L 磷酸缓冲液，时间视样本大小而定，一般室温 30min 左右。

（3）PBS—BSA 洗 5min×3。

（4）1% 四氧化锇后固定 1～2h

（5）系列梯度乙醇或丙酮脱水

（6）临界点干燥或冰冻干燥

（7）喷镀碳与金

（8）扫描电镜观察

三、冷冻蚀刻免疫电镜技术冷冻蚀刻法（Freeze Ftching），也称冷冻复型法（Freeze Replica）或冷冻切断（Freeze Fracture），是研究生物膜结构的重要方法之一。其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻，然后放到真空喷镀仪中切断，切断后的切面上有细胞器，其间还有冻成洋的水分。再加热使冰升华，将水份蒸发，把细胞器的膜结构暴露出来，这一步骤就称为冷冻蚀刻。如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结构上喷镀铂—碳投影，再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜。在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取出样品，把复型膜下面的组织腐蚀掉，再把复型膜捞在铜网上，在透射电镜下观察复型膜。

关于生物膜的分子结构，目前被大家公认的并为冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型（图 7 -1），即脂质—球状蛋白质镶嵌模型。依照这上模型学说表明，生物膜是一种流动

图 7 -1 生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解

的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜；脂质双分子层中每一分子分别具有两极，一端为亲水极，朝向膜的内、外表面，而另一端的疏水极朝向膜的中线部位，两排分子彼此相对，构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种，前者大约占蛋白质总量的 3 / 4 左右，外形近似球状，镶嵌在脂质分子层的不同深度内，而后者则大多附着于细胞膜的胞质面。在冷冻劈裂后，生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极。因此，膜的亲水部，分别命名为 PS（与细胞质，核质或线粒体内基质相邻的面）和 ES（与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面，如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等）。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做 EF（面向细胞质、核质、或线粒体基质的面）和 PF（向细胞外间隙或内间隙的面）。从 70 年代初期开始，冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用，但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行，所以仅能标记细胞外表面（ES）。80 年代开始建立了断裂—标记细胞化学方法，将细胞膜劈开后，中央的两侧断面（EF 与 PF）以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标记，为此技术的广泛应用创造了条件。应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。

1．冷冻蚀刻表面标记免疫电镜技术（1）新鲜或固定的细胞进行直接法或间接法免疫标记。

（2）PBS（pH7.5）冲洗 3min×2，加入 1mmol/l MgCl2蒸馏水洗洗 3min×3，离心沉集细胞。

（3）将细胞团置于小纸板上，入液氮冷却的 Freon 中，取出入冷冻蚀刻仪中进行断裂操作，再于 -100℃蚀刻 1min。

（4）制做断裂面复型。

（5）再次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗后进行观察。

本法可显示断裂暴露的 PF 位于中央，周围则是蚀刻后露出来的 ES，标记物只出现在 ES 上。

2．断裂—标记免疫电镜技术此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记，从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。

（1）临界点干燥法

①固定：1.0%～2.5% 戊二醛 PBS 液 4 ℃1～2h，PBS 冲洗 3min×3。

如为细胞悬液，可加入 30%BSA 后加入 1% 戊二醛，使 BSA 凝胶化，将凝胶切成 2mm 左右的小块，用 30% 的甘油—PBS 浸透后置于用液氮冷却的 Freon 中冷却。

②冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中，培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。

③解冻，置碎块于 30% 甘油—1% 戊二醛磷酸缓冲液中解冻。

④置换甘油，放入 1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS 冲洗，3min×2。

⑤免疫标记。

⑥1% 锇酸，室温固定 30min。

⑦系列梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷镀铂—碳膜，次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗，捞于有 Formvar 膜铜网上透射电镜观察。

（2）超薄切片法

步骤：①至⑤同临界点干燥法。

⑥1% 锇酸，室温固定 2h，系列酒精或丙酮脱水，常规电镜包埋。

⑦切半薄片，光镜定位合适的断裂部位，再切超薄切片，铀铅染色，透射电镜观察。

断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术，常用的如刀豆球蛋白（Con A）– 胶体金免疫标记技术，如第六章 所述，Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合，能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的 EF 面，有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。

为保证实验结果的准确性，每组实验在免疫标记阶段应设立对照组。对照组的设计同第一章 总论中的免疫对照染色。

参考文献1．Altaman IG,et al．Rapid embedding of tissue LowicrylK4m for immunoelectron microscopy．J Histochem Cytochem, 1984,32：1217

2．Bendayan M．Double immunocytochemical applyingthe protein A-Gold techniqnes．J Histochem Cytochem, 1982,30：81～85

3．Cai WQ(蔡文琴),et al．Colocalization of vasoactivesubstances in endothelial cells of human umbilical vessel．Cell Tissue Res, 1993,274：533～538

4．De Mey J．Clloidal gold probes inimmunocytochemistry．In：Immunocytochemistry(Eds：Polak JH and Noordren SV)1983；82,wright PSG Bristol LondonBoston

5．Faulk WP and Taylor GM, Am immunocolloid method for theelectron microscope．Immunocytochemistry, 1971,8：1081

6．Mclean I and Nakane PK．Periodase-Lysine-paraformaldehyxefixative for immunoelectron microscopy．J Histochem Cytochem, 1974,22：1077

7．Ordronneaa P．Technique inimmunocytochemistry(Eds：Bullock GR and Petrwoz P, 1982, 269～280

8．Roth J, et al．Application of the protein A-goldtechnique for electron microscopic demonstration of hormone．Endocrinology, 1981,108：247

9．Spour RC and Morlarty GC．Improvements of glycolMethacrylats．I．Its as an embodding medium for electron microscopic studies．J His-tochem Cytochem, 1977,25：163

10．Sterit WJ and Kreatzberg GW．Lectin binding by resting andreactive microglia．Neurocytol, 1986,16：249

11．Solt JW and Geuze HJ．A new method of preparing goldprobes for multiple-labelling．Cytochemistry．Eur J Cell Biol, 1985,38(1)：87

12 ．Tokuyasu KT．Immunocytochemistry on ultrathinfrozen sections．Histochem J, 1980,12：381

13．Vacca LL, et al．A modified peroxidase procedurefor improved localization of tissue ontogens,localization of substance Pin ratspinal cord．J Histochem Cytochem, 1980,28：297～307

14．Wang Bao –Le, et al．Simplified purification andtesting of colloidal gold probes．Histochemistry, 1985,83：109～115

15．Cai WQ(蔡文琴),et al．Localization of neuropeptide Y andatrial natriuretic petide in the endothelial cells of human umbilical blood ves-sels．Cell Tissue Res, 1993,272：175～181

16．蔡文琴．胶体金标记法在免疫细胞化学电镜的应用．解剖学杂志,1985,8(2)：19

17．张承志．软型包埋剂 GMA 制作薄切片的原理及其应用．解剖学杂志,1986,9(1)：73

18．李文镇主编．组织细胞冷冻复型图谱．人民卫生出版社,1981

19．孙榆, 蔡文琴, 李巍, 等．改良低温包埋胶体金免疫电镜技术．第三军医大学学报,1991,13(8)：417～472

第八章 蛋白质与多肽激素的放射免疫分析第一节 概述1960 年，美国学者 Yalow 和 Berson 创立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血浆中胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。其后 30 年中，内分泌科学的飞速进展，充分证明了这一超威量分析技术的巨大推动力。1977 年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其它领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我们放射免疫分析研究起步于 1962 年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起着很大的促进作用。

一、放射免疫分析的优缺点（一）RIA 的优点

放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。

1．灵敏度高一般化学分析法的检出极限为 10-3～10-6g, 而 RIA 通常为 10-9（毫微克，ng）、10-12g（微微克,pg），甚至 10-15g(毫微微克，fg)、10-18g(微微微克，ag)。

2．特异性强由于抗原—抗体免疫反应专一性强，所被测物一定是相应的抗原。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。

3．应用范围广据不完全统计，目前至少已有 300 多种生物活性物质已建立了 RIA。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析，应用范围还在不断扩展。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于 RIA 的探测极限，都可建立适当的 RIA 法。

4．操作简便 RIA 所需试剂品种不多，可制成配套试剂盒；加样程序简单一次能分析大量标本，标本用量也少；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；RIA 属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。

（二）RIA 的缺点

1．只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性百失去免疫活性的物质是测不出的。因此 RIA 结果与生物测定结果可能不一致。

2．由于使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性。

3．灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。

4．由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。

5．存在放射线辐射和污染等问题。

尽管 RIA 存在以上缺点，但它毕竟是定量分析方法的先进技术。随着科学技术的进步，放射免疫分析技术将会得到更加广泛、更加深入的发展。

二、基本原理放射免疫分析技术，是把放射性同位素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超威量物质的测定方法。

RIA 的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合。竞争结合反应可用下式表示：

在上述反应系统中，当只有 *Ag 和 Ab 时，只产生 *Ag—Ab 复合物，并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入 Ag, 因 Ag 与 *Ag 免疫活性完全相同，故与 Ab 具有相同的亲合力。当 *Ag 为一定量、Ab 为有限量、Ag 与 * Ag 的量之和超过 Ab 上的有效结合位点时，*Ag –Ab 复合物的生成量与 Ag 的量之间呈一定的函数关系。即当 Ag 量少时，Ag –Ab 生成量多，而 *Ag –Ab 生成量增多，游离的 *Ag 减少。可见 *Ag –Ab 复合物生成量是受 Ag 含量制约的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同浓度的标准物和一定量的 *Ag 及限量的 Ab 反应，采取一定方法将 B 与 F 分开，即可算出该标准物在各浓度下 *Ag –Ab 复合物的结合百分率（B/T）。

这一反应过程，可用以下简图（图 8 -1）说明。图中黑圈表示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。

图 8 -1 放射免疫分析原理示意图

从图中可见，当标记抗原与抗体量一定时，结合率（B/B+F）随抗原量增加而降低。在实际工作中，以 B / T 的值为纵座标，标准物的浓度为横座标，绘成曲线，即竞争性抑制曲线，或称准确曲线。将未知浓度的样品按同样条件操作，所得结合率（%）与标准曲线相比，即可查出样品中待测抗原的浓度。

放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知浓度的标准溶液，并各取一定体积；于其中加入一定量的标记抗原和特异性抗体；在一定条件下使之反应平衡后，采取适当方法将 B 与 F 分离；分别测量其放射性；绘制标准曲线（图 8 -2）。对样品中抗原的测定，则可在同样条件下操作，在标准曲线上查得含量。

图 8 -2 标准曲线

左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度

由此可见，要成功地进行放射免疫分析，必须解决好以下 3 个关键性技术问题：

（1）标记抗原：要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性强、用量适当。

（2）制备抗体：要求其特异性高、选用的稀释度适当。

（3）分离 B 与 F：理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、操作简单、适用范围广。

第二节 放射性碘标记在 RIA 中，标记抗原质量的优劣，直接影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。

一、同位素的选择同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵敏而方便，故多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131 I 和125 I 等。在使用上各有其优缺点，可根据所进行的放射免疫分析的类型特点，标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择（表 8 -1）。大多数抗原分子中都含有 C、H 等原子，所以用14 C 或3 H 标记不改变抗原的结构及其免疫学活性，且14C、3 H 半衰期长，所标记的抗原长时间放置后仍可使用，这都是其优点。14 C 或3 H 标记的不足之处是操作较繁琐，并难以获得高比放射性的标记物；3 H 及14 C 放出的都是弱 β 射线，需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率的测量，且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免疫化学或生物学活性者，则仍以采用3 H 或14 C 标记物为佳。

表 8 -1 标记抗原常用的放射性同位素及其性质

放射性元素半衰期射线种类及能量（百万电子伏特）βγ14C5720 年0.155-3H12.5 年0.0189-125I60 天-0．035131I8.05 天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722大多数抗原分子中是不含碘的, 引入碘原子就改变了抗原的分子结构，往往容易损伤抗原的免疫化学活性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用，放射性碘放出 γ—射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量，测量操作也很简单。由于这些突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘标记物最多。

从应用角度来看，131 I 和125 I 又各有其优缺点，可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言，125 I 有较多的优点，一是半衰期适中，允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间；二是它只发射 28keV 能量的 X 射线和 35keV 能量的 γ 射线，而无 β 粒子，因而辐射自分解少，标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象（包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等）的标记，且操作简单，一般实验室都不难做到。

二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物，首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性，所以若用纯度不高的抗原作标记，则标记后必须采取适当的步骤除去杂质，以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法，否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质（这时表面上活性可能还是良好的），再经标记反应时所受的损伤，活性就会显着降低，影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原，还要采用适当方法加以标记，尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。

多肽激素与蛋白质多用碘标记，最常用的是125I。碘化反应的基本过程如下：通过氧化剂的作用，使碘化物（125I–）氧化成的碘分子（125I2），再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法，标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团，即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原，在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。

因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反应条件（pH、温度、反应时间等）及所用氧化剂的性质等也有影响。

常用的标记方法有：

（一）氯胺 T 法氯胺 T 法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。

1．原理 氯氨—T（Chloramine–T）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。

2．方法 以125I—AVP 的制备为例。

（1）碘化反应：AVP5μg+0.5mol/lPB50μl（pH7.5）+1251800μCi, 混合后，加入新配置的 Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀，室温下反应 40s。

（2）终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠 40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5), 以终止碘化反应。

（3）Bio—Gel P2层析纯化：将碘化反应混合液注入 Bio—Gel P2柱，用 0.1n HAC 溶液洗脱，分部收集，每 2min 收集一管，共收集 60 管。

（4）放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为125I—AVP，第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管，留下备用。

为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记上多少放射性碘，以及每微克抗原结合上多少放射性碘。

（5）标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入 1 / 8 体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐中，在 -20℃以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因，使 B / F 明显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用 SephadexG100 长柱（40～80cm）过柱，洗脱后出现 3 个峰。第 1 个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的大分子，尚保留部分抗原决定簇，免疫活性弱；第 2 个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第 3 个峰是游离125 I 或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第 2 个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第 3 个峰是游离125 I 或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第 2 个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。

2．注意事项

（1）放射性碘源的选用：无载体的 131 I 或125 I 均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50～100mCi/ml，至少也要 >30mCi/ml，否则加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所需加入）量也增加，这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源，一方面因衰变致比放射强度降低，另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是131 I 源），都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂（如 Na2S2O5 等）量多时，会抵消氯胺 T 的作用，降低碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，标记投入的放射碘量不宜过大，一般以 <5mCi 为宜。

（2）放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时放射性投入量不宜过多，示踪实验室中常规每次只用 1～2mCi，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，多肽、蛋白质用量多（即 I / 多肽、蛋白质比值低），能获得高碘利用率，但所得标记蛋白比放射强度低；相反多肽、蛋白质用量少（即 I / 多肽、蛋白质比值高），则碘利用率降低，但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动；而当此比值 <1 后，则碘利用率再下降的幅率较小，标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。

（3）氯胺 T 与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间：氧化碘化标记法中，会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺 T 是氧化剂，早期用氯胺 T 法作碘化标记时氯胺 T 用量都比较大，或碘化反应时间较长，结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺 T 用量大，或长时间进行碘化反应，结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少，反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时，试以各种蛋白质（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等）作微量标记，当氯胺 T 用量为 20μg/0.1ml 反应液、0～20。 C 反应 20s，碘利用率都已接近或达到最大峰，再加大氯胺 T 用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多，氯胺 T 用量也应增加，以达到预期的碘利用率，但决不应盲目加大氯胺 T 用量和延长碘化反应时间（通常反应时间不要超过 1min），否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活，不能用于实验。当然，减少氯胺 T 用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上，否则碘源中还原剂量较多，双盲目减少氯胺 T 用量，就会使标记失败。一般用125 I 标记时，氯胺 T 用量要适当加大。加入氯胺 T 后必须迅速混匀，以防标记不均匀。氯胺 T 与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

氯胺 T 用量减少了，Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应，实验时加入 Na2S2O5一般都是过量的。氯胺 T 用量大时，加入 Na2S2O5的剩余量也就会随之增加，这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此，Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的，以重量计算 Na2S2O5加入量与氯胺 T 相同就足以保证终止碘化反应（按反应克分子浓度计算，Na2S2O5/ 氯胺 T 重量比约 0.4），不要盲目加大用量，并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来，以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。

某些蛋白质或多肽对氯胺 T 较敏感，还可进一步减少氯胺 T 用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度，以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。

（4）碘化反应体积：系指加入 Na2S2O5终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小，局部反应物浓度愈高，所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以，标记应采用比放射标记效果。当反应液量少（<0.2～0.3ml）时，反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大；当反应液量大（>0.5～1.0ml）时则影响较小。微量氯胺 T 法放射碘标记时，一般多控制碘化反应体积 <100μl。

（5）碘化反应温度：温度升高，碘化反应速度加快，碘利用率有所增加。但总的来看，反应温度的影响不很大，一般从 0 ℃到 20℃碘利用率相差不过百分之几，故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性，则可在 0℃进行碘化反应。

（6）碘化反应的 pH 值：受氧化剂氧化生成的活性碘，对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用，最适 pH 是 7.3～7.8 之间。当 pH 变化时，碘化位置也会发生变化，例如 pH 值较高时，组氧酸的咪唑环也可被碘化；当 pH4～5 时，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚，导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应，或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时，除放射性碘源外，所有的试剂都应用适当的缓冲液配制，保证碘化反应在最佳 pH 条件下进行。

（7）微量蛋白质或多肽的吸附损失：界面的吸附损失，在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的，但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I—ACTH 时，所用 ACTH 浓度低到 50Pg/ml 时，因表面吸附可损失 10%～30%，甚至高达 75%。改变 pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时，能减少吸附，但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的 2%～8%、残留在层析柱上折占 5%～10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减，残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见，微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失，所以标记时投入蛋白质、多肽量过微（如 <2μg）也是不适宜的，否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低，并在计算上会造成较大的误差。

（8）不同蛋白质、多肽碘化标记的差别：由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同，而且其空间结构也不相同，分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应，有的就不容易碘化，因此同样条件下进行碘化标记，不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如 ACTH、促性腺激素释放激素（GRH）、促黄体激素释放激素（LRH）等多肽，碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性；而 AFP 及人绒毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化标记，则较容易保存良好的免疫化学活性。

尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别，但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素，就容易成功地获得合格的标记物。

不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同，放射碘化标记反应后，可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质（或多肽）与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开，常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。

（二）乳过氧化物酶法（LPO）本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为 20～40%。

1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对 125I– 的氧化作用，生成125I+，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

2．方法以标记蛋白质抗原为例。

（1）反应液组成：蛋白质 2～5μg 溶于磷酸缓冲液 10～25μl 中，加入 Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液 25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl)；

（2）在室温保温 7min；

（3）加入 H 2O2200ng(10μl)；

（4）过 7min 再加入 H 2O2(3μl)；

（5）保温 7min 后，加入 0.5ml、10mmol/ L 巯基乙醇以停止反应；

（6）10min 后加入 NaI 载体溶液 1ml；

（7）按常规方法分离纯化。

3．注意事项

（1）LPO 质量好坏，可直接影响标记率，LPO 应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。

（2）LPO 用量应小于总蛋白质用量的 1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。

（4）碘化反应在 pH4.0～8.5 较宽范围内均可进行，最适 pH 值应依据蛋白质本身性质而定。

（5）H2O2应保持低浓度，如高于 0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。

（三）Iodogen 碘化法此法具有标记率高、反应体积小（3ml 水平）、可用低浓度的125 I 原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。

1．原理 用 Iodogen 为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把125 I 直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与 Iodogen 混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。

2．方法

（1）标记之前，先把 Iodogen 溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。

（2）标记时，将蛋白质溶液 10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，125 I 与蛋白质克分子之比例为 1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达 10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有 200μl0.01mol/L、pH7.2PB 和 0.15mol/L NaCl 溶液中，层析分离前再放置 5min，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。

3．注意事项

（1）涂有 Iodogen 的反应管，有氮气中密封，并贮存在 -20℃条件下，至少可用 3 个月。打开管，使用时间很短。

（2）碘化反应时间，7min 时标记率达最高，10min 时略有减少。PH6.0～8.5 时，标记率最高。

（3）Iodogen 与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是 1 克分子的 Iodogen 与 8 克分子或再多量之比。

（四）酰化试剂（Bolton 和 Hunter 试剂）法1．原理这个方法用酰化剂 3 –（4- 羟苯基）丙酸—N 琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter 试剂）做连接试剂，将125 I 标记在羟苯基的 2，5 位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将 3 –（4—羟基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

2．方法125I—Bolton—Hunter 试剂可用氯胺 T 法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用 3～5μmol 标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白 5～10μg 及缓冲液 10～50μl,pH8.0～8.5 为宜，在冰浴中反应 15～30min 后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。

此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于 1 万的蛋白质。

三、放射性标记化合物的纯化与鉴定（一）纯化标记化合物的常用方法不论使用何种制备方法，要获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，一些标记化合物，经过一定时间的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（125–HGH）, 在刚标记的第 2 天，从 Sephadex G-100 过滤谱上可见，几乎所有的碘化 HGH 都集中在峰 II；保存 1 个月后，峰 II 组份减少，峰 I 和峰 III 成分明显增加，峰 I 是集聚的标记生长激素，而峰 III 是不具有免疫活性的放射性化学杂质（图 8 –3）。

图 8-3125I—HGH 的 SephadexG-100 过滤谱

实线：新鲜制备的125I—HGH 虚线：保存 1 个月的125I—HGH

标记化合物的纯化方法，除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外，一般需用微量分离技术，较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例，说明以上各种方法的适用情况。

1．凝胶过滤法常用的是 SephadexG 系列，也有 Biogel—P 系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用 Sephadex G—25 或 G—50，然后用 G—100 进一步纯化。

2．离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化短肽标记物。

3．透析法 能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。

4．电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。

5．亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。

6．高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。

7．伴刀豆球蛋白 A（ConA）吸附法 ConA 是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含 0.2mol/ L 甲基 α - 吡喃葡萄糖苷的 PBS 洗脱。

（二）标记化合物的主要质量指标作为示踪剂及分析试剂的标记化合物，应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括：放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。

1．放射性核纯度及其检查方法

（1）放射性核纯芳可用下式表示：

放射性核纯度（%）= 所需放射性核素的活度 / 样品的总放射性活度×100

（2）放射性核纯度的检查方法：每一种核素都有它的特征，即物理半衰期及射线能量，故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。

①测定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用时间跟踪法，每隔一定时间测量放射性一次，共测 3～5 个半衰期，以每次测得的放射性计数为纵座标，时间为横座标，在半对数纸上作图，并通过分析，可求出该放射性核素的纯度。

②测定射线能量法：利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ 发射体可用 γ 能谱仪，如检测57Co 和58Co 的核纯度：纯 β - 发射体可用液闪仪，调节 道宽及淬火校正后，对如3H、14C、32 P 的核纯度进行测量；而 β、γ 混杂垓素，则用吸收法测量，如99mrTc 中母体杂质99mMo 的含量测量，是通过适当厚度的铅屏蔽，将99mTc 发射的能量为 141ke V 的 γ 射线减弱后，测定99Mo 发射的能量为 739Kev 的 γ 射线。

2．放射化学纯度及放化纯度鉴定

（1）放射化学纯度：放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的，所以：

放射化学纯度（%）特定化学形态的放射性活度 / 样品总放射性活度×100

放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产物存放条件等影响，一般放化纯度控制在 95% 以上。

（2）放射化学纯度的测定方法：原则是高效的化学分离与灵敏的放射性测量相结合。常用下列方法：

①放射层析法，又称放射色谱法：本法是利用色谱技术使混合物中各组份分离，然后测定各组份的放射性活度。它具有选择性高、分离效果好、操作简便等优点，在放化纯度鉴定中是一种重要的分析方法。最常用的是放射性纸层析法和放射性薄层层析法。

②放射性高效液相层析法：它对分离纯化标记化合物及鉴定标记化合物的放化纯度都有很大潜力，具有分析速度快、分离效率高、适用范围广等特点（几乎 80% 的有机化合物均可应用）。关键是要选择合适的固定相和流动相，使产品与杂质分离。在流动相中，被分析物各组份的浓度变化可用紫外或荧光检测器检测，而其放射性活度，可同时由放射性探测仪测定。放射性活度测定最简单的一种办法，是将洗脱液分部收集，然后在 γ 仪或液闪仪上进行测量；另一种较理想的是连续测量，在洗脱液流通池外包围一个固体闪烁探头，进行 γ 计数或在流通池前加一个三通混合室，用另一个泵混入闪烁液，测定软 β 射线。可以与紫外控测器的扫描图，同步描绘出放射性的分布图。

③放射性核素反稀释法：取一定量（W1）已测定比活度（SO）的标记化合物（约 0.1～10mg），用 >1000 倍化学量（W2）的纯载体稀释，充分混匀后反复纯化到比活度恒定不变（Sp），此标记化合物的放化纯度值应为：

有时该值 >100% 时，往往是由于所用载体化学纯度不够。因本法操作要求严格，一般不作常规放化纯度鉴定用。

3．化学纯度及化学量的测定标记化合物中的非放射性化学杂质虽一般不会对示踪结果带来直接干扰，然而这种杂质的含量越多对标记化合物在使用、存放过程中分解、变性的影响就越大。此外，也已发现某些标记化合物的化学杂质会给使用带来直接影响。如用氚标记类固醇作放射免疫分析试剂，其中的化学杂质会影响标记抗原与抗体的结合率，使分析灵敏度降低。因此，对标记化合物的化学杂质含量，同样必须加以控制。

要制得化学纯度的标记化合物，最好是对可能产生的杂质加以防止。这要在冷试验中解决。因为冷试验所得产品是非放射性的，其化学纯度可用常规方法，如溶点、沸点测定，NMR、红外、紫外谱分析等手段加以鉴定，得到合格产品后，再按同样方法及条件进行标记制备。

对于标记化合物的化学含量，则必需在标记反应及一定纯化步骤后进行，由于需要高比活度的标记化合物，往往样品的放射性很强，而化学量极微（如某氘标记化合物，分子量为 300，每分子上标记 2 个氘原子，氘的同位素活度为 99.8%，则理论上每 25mCi（925MBq）的化学量还不足（130μg）, 所以需用微量分析法才能测定其含量。一般而言，各种常规微量分析技术均可应用。目前大多用紫外分光、荧光光度等进行含量测定。

4．放射性比活度及其测定

（1）放射性比活度简称比活度，过去也称比放射性。

比活度=放射性活度/单位化学量

（2）比活度的理论值计算：每种放射性核素有一个比活度理论值，取决于该核素的半衰期和衰变常数。若 N 是 1 毫克原子（1mA）的总原子数，衰变常数 λ（单位时间衰变的 %），则

任何元素每 1mA 的原子数都相同，等于阿伏加德罗常数，即 6.023×1020个，故

若 T1/2min 为单位，则上式的活度单位为 dpm/mA, 进行单位换算后为：

根据上式，可计算出每种放射性核素比活度的理论值（常用放射性核素的比活度理论值见表 8 -2）。如果标记化合物每分子接上一个放射性核素原子，则以上原论值亦为该标记化合物的比活度（每毫摩尔的活度）理论值。

表 8 -2 一些常用放射性核素的比活度理论值

（亦即每分子一接一个该放射性核素原子的标记化合物的经活度理论值）

放射性核素半衰期比活度理论值（每 mA 或 mmol 的活度）14C5730 年0.0624 Ci (2.3 GBq)3H12.33 年29.0 Ci(1073 GBq)45Ca165 天793 Ci (29.3 TBq)75Se118.5 天1100 Ci(40.7 TBq)35S87.4 天1494 Ci (55.2 TBq)125I60.2 天2196 Ci(80.3 TBq)131I8.04 天16240 Ci (600 TBq)(3)放射性比活度测定方法

①直接测定计算法：将标记产品经分离纯化后，配成合适的溶液，测定每毫升的放射性活度（如 mCi/ml）及含量（μg/ml）从而计算其比活度。对于高经活度的标记物，化学含量甚低，一般需用光谱法，如紫外分光光度法测定其含量。

②层析扫描面积计算法：一般应用纸层析或薄层层析，将反应结果尚未分离的反应液点样、展层，然后在扫描仪上描绘放射性分布图，根据描绘的面积来进行计算，如图 8 -4。

图 8 -4 放射层析扫描面积计算比活度示意图

1为标记物峰面积：

S2S3为杂质峰及放射性原料峰面积

先计算标记率：

放射性比活度的计算：若投入的待标记物重量为 W，且 100% 转化为标记物，则比活度 =A·Y/W，其中 A 为投入的总放射性。

如果层析扫描仪有紫外监测器和放射性活度计数率仪可同步测定扫描，则直接可给出比活度。

③自身取代计算法：这是间接测定标记物比活度的方法。所测定的标记物，需是分离纯化后可用于 RIA 或 RRA 标记试剂。

方法的原理是：作一条常规的 RIA（或 RRA）标准曲线，另作一条不加非标记标准品，只加抗体和不同量标记试剂的自身取代曲线。两者用同一种抗体，且抗体用量完全相同。若反应平衡后测定结合部分的放射性，掏算成所加总放射性（注意：对标准曲线总说总放射性各管相同，对自身取代曲线来说各管不同，需分别换算）的百分数，即结合率 B。由于两条曲线所用抗体的质和量严格相同，标记物与非标记标准品与抗体亲和力也相同，故 B 的大小就完全取决于各管中标记物和非标记标准品的总量。亦即若从两标准曲线上取一点相同的 B，则

（标记物 + 标准品）标准曲线 =（标记物） 自身取代曲线

故由此便可直接计算标记试剂的化学含量并进一步求得比活度。为求准确度高，可取我点 B 求出平均比活度。

用自身取代法测定标记化合物的比活度，只适用于 RIA 的标记抗原及受体的标记配基。使用时应注意：①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力应相同；②非特异性结合应较小，且计算时应扣除；③制备标准曲线与自身取代曲线时，操作步骤应相同，特别是 B 与 F 分离的条件要一致。

5．生物活性、免疫活性测定

（10）生物活性、免疫活性测定的重要性：放射性标记化合物作为示踪剂用于生物体内的示踪研究，或作为分析试剂用于生物活性物质分析，都要求标记化合物不改变其原有的生物活性和免疫活性。当给化物引入放射性原子，即使“同位素标记”大多需经过原子交换或化学反应及分离纯化等物理化学处理，有可能造成光学构型及立体构型的改变而使标记物改变性质。“非同位素标记”，如蛋白质分子中引入碘原子，则更易引起蛋白质失活、变性。故测定放射性标记化合物的生物活性和免疫活性，对保证使用效果十分必要。

（2）生物活性和免疫活性测定的要求：需根据使用要求而定，因为同一标记物其生物活性的变化与免疫活性的变化不一定相关；同一标记激素，其与受体结合能力的改变与抗体结合能力的改变也不一定平行。

（3）测定方法：测定标记蛋白质或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述几种：

①物理化学方法：可用电泳法、吸附法及凝胶过滤法等物理化学方法来测定标记蛋白质的结构改变情况，如标记后受损全伤的蛋白质在电泳时泳动性减少，碘化受损的多肽激素在血红蛋白涂碳上的吸附性质也有改变，而蛋白质变性聚合时大分子聚合体将在凝胶过滤时不停留在凝胶柱上。这些测定虽较快速方便，但对标记物的生物活性和免疫活性的严格判定来说，还是很不够的。

②特异结合试验：根据放射性标记化合物用于放射免疫分析等不同要求，分别与其相应抗体或受体进行特异性结合试验。以放射免疫分析试剂为例，测定其免疫活性的方法是：先观察标记物与抗体的结合率，如果结合率高，说明抗原的免疫活性较好。进一步观察标记抗原与非标记对抗体亲合力是否一致，做法之一是用不同稀释度的抗体，分别与标记抗原及与标记抗原加非标记抗原的混合物进行特异结合，其中混合物抗原总浓度要和单独使用放射性抗原的浓度相同。如单独使用标记抗原 1.0ng, 而混合抗原的总浓度亦为 1.0ng，其中标记抗原为 0.1ng，非标记抗原为 0.9ng，比较两者的结合率，如果基本相同，说明标记抗原保持其原来的亲和力，在标记等操作过程中未受到明显损伤。如图 8 - 5 中，A 线与 B 线基本平行；如果标记抗原免疫活性已有降低，则如 C 线所示。

图 8 -5 标记蛋白的免疫活性测定

A；为标记抗原与血清的滴度曲线 B：为非标记抗原（加入少量标记抗原）的滴度曲线；C：与 A 相同，但标记抗原免疫活性已有降低

③生物特性测定：如125I—纤维蛋白原，可用凝血酶测定其可凝能力，与非标记物相比，视是否有改变。使用何种生物特性测定，根据标记物的生物性质而定。另外，上述特异性结合试验，如果受体作异结合剂，也是检验用作 RRA 或 RBA 分析试剂的标记物生物活性情况的有效方

第三节 结合和游离部分的分离放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B）和游离的（F）抗原，所以，B、F 的分离是放射免疫分析中的一个重要环节。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。

一、对分离方法的要求分离方法的选择直接影响分析的质量，通常需满足以下要求：

①使 B 和 F 分离完全；②不受外界因素的干扰而影响分离效果；③与游离抗原的非特异性作用尽可能小；④操作简便，分离迅速，重复性好，适用于大量样品分析；⑤来源广，价格低廉，便于使用，适合 RIA 技术自动化。

二、常用的分离方法目前用于放射免疫测定中的分离方法很多，各有其优缺点，下面介绍几种常见的分离方法：

（1）吸附分离（固相颗粒）

活性碳吸附剂（目前常用）

硅镁吸附剂（滑石粉等）

交换树脂吸附剂

（2）蛋白沉淀剂

硫酸铵、硫酸钠

聚乙二醇（PEG）（目前常用）

无水乙醇、丙醇等

（3）免疫分离剂（第二抗体）

（4）磁性分离剂

磁化活性碳吸附剂

磁化固相抗体

（5）固相包被分离法（固相分离剂包被在测试管内）

（一）吸附分离法

这种吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。

活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时，小分子的游离抗原被活性炭吸附，达到分离 B 与 F 的目的。

活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉，缺点是离心沉淀部分是 F 而不是 B，不适用目前自动化放免测定，分离时易受温度和时间的影响。

（二）沉淀分离法

沉淀分离法的原理，是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀（这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中）。常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG）。PEG 是一种直链大分子聚合物，使用 PEG 溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在，而且要求 γ 球蛋白的最终浓度达 250mg/ml 以上的情况下才能实现。PEG 沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响，PEG 离心温度在 20℃以下进行。PEG 沉淀的优点是 PEG 价格低廉，操作简便，一次可处理大量样品。其缺点是 PEG 单独使用时非特异结合高，所以常与其它方法联合使用；其分离效果易受 pH、温度等影响。

（三）双抗体分离法

双抗体分离法也称免疫分离法，是特异性分离，应用十分普遍。本法是以抗 IgG 抗体和可溶性的抗原 - 抗体复合物结合，形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体，形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清 IgG 免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体，该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的（图 8 -6）。

图 8 -6 双抗体法分离原理模式图

第二抗体分离的优点是重复性好，B 和 F 分离较为完全，非特异结合低，可同时处理大量样品，使用方便。缺点是分离时间长，非特异性结合可有较大的波动，第二抗体用量较大。

（四）磁性分离法

1975 年，Hersh 报道了用磁化分离技术分离血清狄高辛放免测定的 B、F 后，受到了广泛的重视。近年来国内外许多学者对磁化颗粒的制备进行了系统地研究，应用于 B 与 F 的分离，并取得了引人注目的进展，使放免的 B、F 分离不再使用离心，缩短了放免操作时间，便于放免自动化测量。磁性分离的具体原理为血清样品与标准品中的抗原与磁颗粒上的一定量的抗体反应，产生的抗原抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分与游离部分分离。在磁性分离器上弃上清，进行测量。优点是简化了操作程序，B、F 分离也较完全，稳定性好。

目前常用的磁性分离技术除磁性固相抗体外，还有磁化活性炭吸附分离剂。

（五）固相包被分离法

近年来由于固相技术的研究使其固相所被（埋）技术发展迅速，再有固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等优点，有逐渐取代液相法的趋势。

1990 年，Causse 报告了活化塑料管新技术及生物素结合抗体、亲和素标记物的应用，使放免技术对多数微量物质的检测可达到 10-15 g 级水平，大大提高了放免测定的精确度、灵敏度。

抗体包被：物理吸附法—方法简便，但包被量低。

价键结合法—需要纤维素、琼脂等固相载体，操作复杂。

Causse 活化塑料管新技术，提高了包被量，主要特点是将顺丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚体涂布试管，在试管壁形成一层活性薄膜（这种方法操作简便）。

（六）双抗体 +PEG 的分离法

这种分离方法利用双抗体特异性强、PEG 沉淀简便快速的优点，从而克服了双抗体时间长、PEG 方法非特异结合高的缺点。这一方面是当前分离技术中较理想的一种方法。

这种联合方法分离方法减少了第二抗体的用量，PEG 的最终浓度也只需 2～4%，成本较低。这种方法既适用于蛋白质、酶、大分子物质，又适用于小分子肽等半抗原物质。

1991 年，北京中国同位素公司北方免疫试剂所采用 80 年代法国广泛应用的双抗体 +PEG、再加一定剂量的 γ 球蛋白（免疫第二抗体时应用的 γ 球蛋白）的分离剂，溶解于磷酸缓冲液中，pH 在 7.4 左右。这种分离剂推广应用产生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特异性结合低，时间短（加入分离剂 15min 后即可离心），受温度影响小，受到用户的广泛好评。

以上方法，要依据反应液中反应物分子量大小，酸碱度等特点，选择合适的分离方法及分离剂。

第四节 样品的前处理样品的正确收集与处理，是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目，其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例，介绍样品的前处理方法。

一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例）1．大鼠称重后，在尽量安静的情况下，迅速断头、取躯干血。

2．尽快取下全脑、脊髓（某段）与垂体，在沸生理盐水中煮 5min，以灭活酶，保持神经肽的稳定。

3．

4．脑区等称重。

5．把脑区、垂体或脊髓，分别置于玻璃匀浆管内，加入 1mol/l HAC（或 HCl）1ml，充分匀浆后倒入塑料指形管中，在室温下放置 100min，使生物活性物质充分溶解在酸中。

6．加入 1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

7．离心，取上清。

8．低温（-20℃以下）保存待测。

二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法（以下丘脑为例）1．大鼠迅速断头，取出全脑，置沸生理盐水中煮 5min。

2．将全脑置于取材角度器上，分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断，取下丘脑块。

3．将双面刀片装在切片机上。

4．将下丘脑置于切片机机载物台上，腹侧向下，并用 502 胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

5．开动振动切片机，缓慢移动推进器，切片厚 400～500μm。用毛笔沾生理盐水，小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

6．将脑切片平置于橡皮板上，并在体视显微镜下，参照鼠脑立体定位图谱，确定神经核团位置。

7．选择相应直径的穿孔器，分别于两侧核团上垂直插下，然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

8．加入 1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中，放置 100min。

9．加入 1mol/l NaOH 0.5ml 中和酸，离心（3000rpm/min）20min，取上清液，低温保存待测。

三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取（以胃粘膜为例）（1）取下胃粘膜后，迅速称重置于试管，中沸蒸馏水 1ml，在水浴中煮 100min。标本在室温下放置，其中的生物活性物质会被酶降解，所以要立即加热处理。

（2）冷却后倒入特殊的匀浆器中，充分匀浆（使用电动搅拌器）。匀浆液倒入塑料指形管中，再用蒸馏水 1ml，冲洗匀浆器，并倒入上述管中。

（3）离心，取上清，低温保存待测。

四、血浆1．直接测定

（1）加酶抑制剂：准确采全血若干毫升，注入预冷的加有①抗凝剂 0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二钠）溶液（每毫升全血 20μl）、或 1% 肝素（每毫升全血 10μl）；②抑肽酶（每毫升全血 500 单位）的塑料指形管中，迅速低温离心，取血浆低温保存待测。

抑肽酶有液体的（标签写的有每毫升含多少单位）与固体的（每毫升含 12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含 10800 单位）。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解，使之每 20μl 含 500 单位。

（2）酸化处理：每毫升血浆加 1mol/l HCl 0.2ml，低温保存待测。测定前加 1mol/l NaOH 0.2ml。

以上两种方法，任选一种即可。

2．间接测定 血标本经提取后，可去除蛋白质等干扰因素，并使微量的生物活性肽浓缩，但较费时，成本也高。常用的提取方法有：

（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用 Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤步：

①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈 10ml。蒸馏水 20ml，使柱中的生物胶活化。

②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。]

③淋洗：用 4%HAC 溶液 100ml 注入柱中，以洗去一些杂质。

④洗脱：用 7ml 酸性乙腈（按容积算，每 100ml 中含有乙腈 75ml、HAC4ml、蒸馏水 21ml）作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。

⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。

⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

Sep-Pak C18柱层析，也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

（2）加膜藻土提取法：

①抽血：用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血 4ml，置于加有肝素（125 单位 /ml 全血）指形管中。

②分离血浆：在 4 ℃下离心，取出血浆。

③血浆酸化：取 2ml 血浆，加入 1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

④吸附：加入 0.5% 藻土悬液 2ml，在水平震荡器上震 30min。离心，去上清，留沉淀。

0．5% 藻土县液（Fuller’s earth)的配制：

0.5gFuller’s earth

0.1gDextran T70

100ml 去离子水

⑤洗脱：在沉淀管中加入 80% 酸性丙酮 1ml，在漩涡振荡器上振 2min，离心，取上清置于经硅化的玻管中。

80% 酸性丙酮的配制：

80ml 丙酮

20ml1mol/L HCl

⑥去脂：加入石油醚 1ml，摇匀，脂肪溶解在石油醚中，分层后吸去上层。

⑦干燥：下层液体，置于 37℃水浴中，用氮气（或空气）吹干。

⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

（3）有机溶剂提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例，加入标本内，混匀、振荡、离心，取上清吹干，冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

在这些方法中，以柱层析法最稳定、准确，但成本高，推广不易。加膜藻土法，提取率较高，但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便，成本也低，虽稳定性较差。

五、脑脊液1．煮沸收集脑脊液时，管子浸在冰水中。收集完毕，立即在沸的水浴中煮 5min。离心、取上清；低温保存，待测。

2．酸化在 1ml 脑脊液中加入 1mol/l HCl 0.2ml；测定时，再加入 1mol/l NaOH 0.2ml 中和。

3．加酶抑制剂

4．柱层析提取

以上方法，任选一种。

六、尿尿液收集于事先加有适量醋酸或盐酸的容器中，使 pH 达 4 左右，煮沸 1～2min，冷却后离心，取上清，加适量 NaOH 液，使尿液 pH 达 7.0 左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

尿认提取法相同。采用 Sep—Pak C18柱层析提取较为方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。

七、胃液抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，离心，取上清，低温保存待测。

第五节 放射免疫分析法的建立一、放射免疫分析的基本试剂（一）标准品

标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

（二）标记物

标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

要准确测量 B 与 F 的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用125 I 时达 5000～15000cpm。

（三）抗体

应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为 50% 作为抗血清的稀释度。

（四）B 与 F 分离剂

以 2% 加膜活性炭溶液为例，2% 加膜活性炭溶液的配制：

活性炭 2g（杭州木材厂生产，森工牌 732 型）

右旋糖酐 T 200.2g

加 0.1mol/L PB 至 100ml

电磁搅拌 1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

（五）缓冲液

放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris–HCl 缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为 0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用 0.1% 叠氮钠、0.01% 柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定 cAMP、cGMP 时，需加入 EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。常用的阻断剂有 8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白：采用二抗作 B 与 F 分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用 PEG 沉淀剂分离 B、F，必须加适量 γ 球蛋白或正常人混合血清。

在神经肽的 RIA 时，常用 PELH 缓冲液，（按 1000ml,pH7.6）：

0．1mol/l PB980.0ml

0.3mol/L EDTA·2Na 10.0ml

0.2% 洗必泰溶液 10.0ml

溶菌酶 1.0g

二、加样程序由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

（一）平衡饱和加样程序

1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育 24～48h，再加双抗体，继续温育 24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

以大鼠垂体、下丘脑 β - 内啡肽 RIA 测定程序为例：

（1）加样（单位 μl；总反应体积 500μl）

标准曲线样品TNSBBo5Pg10Pg50Pg100Pg500Pg1ng垂体下丘脑管号1234567891011β-EP 标准液///100100100100100100//样品/////////1100β-EP 抗血清//100100100100100100100100100125-β-EP 溶液100100100100100100100100100100100缓冲液/400300200200200200200200299200（2）孵育：4℃，24h

（3）分离 B 与 F：每管加入 2% 加膜活性炭溶液 300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的 CPM 数。

（二）顺序饱和加样程序

1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应 6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应 12～24h，最后分离 B 与 F，这称为顺序饱和分析法。

应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger 在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第 2 天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第 1 次温育时间可以长，而第 2 次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

2．加样程序 以人血浆精氨酸加压素 RIA 测定程序为例（直接测定）。

（1）加样（单位 μl；总反应体积 600μl）

标准曲线血浆TNSBBo1Pg5Pg10Pg50Pg100Pg500Pg管号12345678910AVP 标准液///100100100100100100/样品/////////300无肽血浆/300300300300300300300300/AVP 抗血清//100100100100100100100100缓冲液/200100//////100在 4 。 C 下孵育 12～24h125I-AVP100100100100100100100100100100（2）孵育：4℃，24h。

（3）分离 B 与 F。

无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取 2% 加膜活性炭溶液 5ml，共两管，离心、去上清。血浆 5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡 10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡 10min，再离心，取上清，即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

（三）计数、绘制标准曲线与测定样品含量

以活性炭分离 B 与 F，沉淀计数是 F 的 cpm。T—F—NSB，得 B 的 cpm 数。

计算标准管与样品管结合（B）的 cpm 数及与零标准管结合（B）的比（B/B×100%）。

用半对数纸，以标准管的 B / B 为纵座标，以各标准管含量为横座标，绘制标准曲线。

根据样品的结合率（B/B×100%），从标准曲线中找出被测样品抗原的含量，再换算成每毫升血浆含某抗原的量，或每毫克（组织湿重）含某抗原的量。

三、放射免疫分析的质量控制（一）质量控制的目的和内容

放射免疫分析的质量控制实际上就是控制测定误差，监督测定结果。它包括两方面的内容：一方面对测定结果做精确分析；另一方面鉴定常规测定方法，对那些测定结果不好的方法加以改进，并建立新的测定方法。质量控制分四个方面：

1．在一个测定方法内产生的误差。

2．在同一实验室内不同方法之间产生的误差。

这两种情况属于内部质量控制。

3．用同一测定方法，在各实验室之间产生的误差。

4．采用不同方法，在各实验室之间产生的误差。

后两种情况属于外部质量控制。

（二）放射免疫分析中造成测量误差的因素

误差包括系统误差和随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。

造成误差的可能来源有以下几个方面：

1．各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如：①由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。②由于样品的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。③在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。④由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。

2．试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。

3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。

4．样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件，微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能造成测量的误差。

5．提取及层析分离过程中的丢失。

（三）放射免疫分析中测量误差的控制

1．选择准确性高的方法：对各种方法进行比较，淘汰粗糙及难以重复的方法。

2．建立方法对比。用相同的测量方法和不同的测量方法在同一实验室和不同实验室，在同一地区和不同地区，在同一时间和不同时间，对同一样品进行对比，检查产生误差的原因。

3．建立各种类型的标准。对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮存条件。

4．建立操作规程，按章 操作。对使用的试剂、仪器设备要经常检查其有效性，更换试剂时应进行必要的鉴定，必要时对测定方法要做重复性试验和回收试验。

5．建立可靠的检查制度。经常对测定结果进行核查，利用控制血清、标准血清检查每批结果的准确性。

参考文献1．汪美先. 免疫学基础. 西安：陕西科学技术出版社,1983；9

2. 夏宗勤. 实验核医学与核医学. 上海：同济大学出版社,1989；1

3. 放射免疫测定基础. 天津：天津科学技术出版社,1985；8

4. 李振甲, 韩春生, 王连勋. 实用放射免疫学. 北京：科学技术文献出版社,1989；5

5. 李振甲, 王仁芝. 激素的放射免疫分析. 北京：科学技术文献出版社,1985

6. 赵惠扬, 张承刚. 实用核医学. 太原：山西人民出版社,1984；3

7. 放射免疫分析在医学中的应用. 北京：原子能出版社,1991,6

8. 刘真, 等. 抗精氨酸加压素血清的制备及其初步应用. 动物学报,1987；33：309～315

9. 祝元祥, 等.β- 内啡肽的抗血清制备及其放射免疫测定. 第二军医大学学报,1986；7：332～336

10. 宁朝佑, 等. 催产素的放射免疫分析. 中华核医学杂志,1987；7：224～497

11. 王成海, 等. 强啡肽 A 1-13的放射免疫测定. 中国药理学报,1987；8：494～497

12.Abrahom, GE. Handbook ofRadioimmunoassay. New York：and Basel, 1977

13. Yalow , RS. Methods isRadioimmunoassay of Peptide hormones. Amsterdam：North –HollandPub. Co, 1976

14. Pasternak, CA. Radioimmunoassayin Chinical biochemistry.London Heyden, 1975

第九章 免疫细胞化学与图像分析在细胞生物学中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节 较多，只要有一个环节 失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成了理想的标本后，如何进行观察，才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本章 的编写目的。

一、定量分析的重要性

目前有许多研究免疫细胞化学的文章，是做定性和定位研究的。如有文献中提到，P 物质在脑组织中存在于 30 处以上，这只是解决了定性定位问题，这些部位含 P 物质的量是否相同？可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析？从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅，其所占的长度或面积等，就要借助于图像分析仪（image analyzer）了。

以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察，对反应产物的量常用“+”号表示，一般可分为 0～+++，共五个等级，这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的，但存在以下三方面的问题：①同一张标本，不同的观察者可以得到出不同的结论，因为这种分级没有明确的客观标准；②即使同一张标本同一个观察者，间隔若干天后进行再次观察时，可能结论也不一样的；③最后一点也是最重要的一点，人的视觉是有一定限制的，用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息，因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计 (microspectrophotometer) 和显微密度计（microdensitometer）等以外，还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过，就其精确与灵敏来说都是够的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，告诉你有无显著性差异。

二、图像分析仪简介

图像分析仪又称图像分析系统（image analysis system），主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息，可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具，并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容，是人们从客观世界中获得信息的重要手段，因此，正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题，并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术中微图形检测、精密机件尺寸检测，光波干涉图、医学生物学的研究及应用等有关领域中。图像测量将会随着信息科学和人工智能的发展而日益显示其重要作用。现代图像测量是光学、电子学、计算机技术等相互渗透的跨学科的结果，涉及广泛的学科领域，医学只是其中一个分支。

我们在光学显微镜下看到的是光学图像，而在图像分析仪屏幕上看到的是电子图像，因此在显微图像分析中，整个系统最重要最关键的工作就是要保证得到的电子图像能最精确地反映出光学图像，这个过程由摄像机（图像扫描器）、显像管和图像处理机（计算机）来完成（图 9 -1）。图像可通过光学显微镜、透射电镜或扫描电镜传到摄像机而产生电信号，照片或胶卷上的图像也可以通过摄像机反映到电视屏幕上进行分析。图像在电视屏幕上是由许多像素（pixel）构成的，单位面积屏幕上像素愈多则图像愈清晰，即分辨率愈高。各厂家生产各种不同规格的产品，如有 640×480 像素的、896×704 像素的、512×480 像素的屏幕等。当图像显示时，每个像素含有两方面的信息，即此像素的灰度及其在标本中的位置，两种信息决定了图像的形状和颜色深浅。

图 9 -1 图像分析系统简图

有关图像分析的学术活动，1963 年召开了第一届国际讨论会，此后每四年有一次国际学术交流活动。1983 年在美国召开了第六届国际学术会议，与会代表约 150 人。1987 年 9 月在法国召开了第七届学术会议，在 200 多正式代表中有 2 / 3 是生物医学方面的专家，而我国生物医学界没有人被邀参加，可见我国过去对如何将图像分析应用于医学生物学方面的研究重视得不够，对国际上这方面的信息掌握得不及时。国内自 70 年代末期相继从国外引进大型自动图像分析仪后，80 年代才开始将医学生物学研究与图像分析方法结合起来。从 1981～1983 年召开了三次全国体视学与图像图像分析学术会议，1987 年召开了第四次学术会议，虽然在宣读的论文中医学研究已占了很大的比例，但具体应用到免疫细胞化学则实例极少，仅是一个开端。1988 年中国体视学会正式成立，是在民政部登记的属于新学科的第一个学会。并于 1991 年 11 月在重庆第三军大学召开了“全国计量学在形态学研究中应用研讨会”，与会代表来自 22 个省市，形态计量学的方法已应用到组织学、解剖学、病理学、细胞学等领域。更为可喜的是过去此类研讨会都是请外商到会介绍他们的产品，为他们提供中国市场，而此次会议上本国的三家研制生产图像分析仪的单位在大会上介绍各自的产品，以较好的性能价格比与国外产品竞争，扩大国内市场，我国在此领域的研究进展也是很快的。

三、常用的测量方法

（一）灰度

灰度（grey level）指图像各种分颜色的深浅程度。比较高级的图像分析仪可将灰度分成为 256 级，也有的只能将灰度分成 64 级，总之都是 2 n,24 是 2 6256 是 2 8。免疫细胞化学标本上反应产物的染色深浅即可用灰度来表示。能将一张标本上不同染色深度区分为几十或更多的等级，这是人眼所不及的。因此，某些实验的结果，如果用光学显微镜作一般的观察，似乎实验组与对照组无明显差异，而用图像灰度法经统计学分析，则可反映出显著性差异，说明仅仅用显微镜观察是不够的，在某些情况下可能会辜负了制片过程中所花费的大量精力，而得不到应有的结果。

由于免疫反应产物在细胞内不一定是均匀分布的，在同一个细胞中就可产生各种灰度，这种情况如何进行比较？有两类方法可供选用：一种是测每个细胞的平均灰度，近年较新型的图像分析系统有此性能，而比较早期的或比较简单的图像分析系统就没有这种性能，例如某一细胞在电视屏幕上占有 120 个像素，按灰度级进行测量后，也许 120 个像素中有十多种不同的灰度，分析仪可立即显示其平均灰度。另一种方法是在反应产物不均匀的细胞中可用每一种灰度所占的百分率来表示，例如你要观察 1000 个细胞，在这些细胞中各种灰度所占的百分率可测出，并作出曲线，或用其他统计学方法处理，来进行比较。

如果用彩色图像分析仪，除了上述的灰度测量以外，还可以将不同的灰度编成不同的颜色，使图像更鲜明美丽，而且便于测量。彩色有两种情况：在屏幕上出现与标本一样的颜色称为真色（real color），如果将不同的灰度转换成不同的颜色则称为假色（pseudo color），应用假色的目的是增强对比度，来改善对细胞结构的视觉识别，同时可增强轮廓用来强调结构的细节。例如，免疫细胞化学中常用的非标记抗体过氧化物酶—抗过氧化物酶法，最终反应产物呈棕色，假设在脑内某核团的许多细胞中，呈现出不同深度的棕色，深浅差别较大者显示在屏幕上人眼还能区别，若差别小的则不易区别了，操作者可将灰度 11～15 用红色显示，灰度 16～20 用蓝色显示、灰度 21～25 用黄色显示、灰度 26～30 用绿色显示等。一般可呈现数十种颜色。也可以将灰度 11～20 用深红色显示、灰度 21～30 用淡红色显示、灰度 31～40 用蓝色显示等，由操作者随心所欲加以编辑。这种图像如拍摄下来，旁边显示出一条彩色带，表明什么颜色代表什么范围的灰度，如此可将一种颜色的免疫细胞化学标本转换成多种彩色的，对比鲜明的照片。

有些图像分析仪中带有光密度计组件，光密度计能将扫描器视频信号变换成对数等值，然后数值化，就能用绝对光密度单位来校正。因此，光密度计把被测物的积分光密度作为主要输出，所谓积分光密度即各个单独探测的像素密度分布的总和。因为容易得到被测物的面积，也就很容易求出平均密度。光密度在细胞化学反应的定量领域内极为有用。灰度是一种相对值，因为你可将标本上的灰度随你编辑分为 64 级、也可将其分为 128 级或者 256 组，而光密度是绝对值。在文献中光密度常用 OD 表示（optical density）。有的单位购置了图像分析仪后才发现不能作光密度测量，但已无法再去掉换，所以在购买前必须详细了解其性能，包括屏幕像素数、有无光密度计组件等。

（二）长度

形状不规则的线形组织结构，一般方法很难计算出其长度，如组织中的毛细血管，神经纤维、细胞超微结构中的各种膜性结构等，以往常用排列稀疏或密度集等词描述，图像分析仪则可测出各种图像周界线的长度。例如：在活检组织的子宫颈上皮细胞的电子显微镜照片上，测出在一定范围的细胞膜长度为 8128 像素，桥粒长度为 1229 像素，计算出桥粒长度占细胞膜总长度的 15%，wiernik 等用此方法观察到癌细胞的桥粒值远小于正常细胞，提出这可能与癌细胞易于失去相互间的的细胞连接，从而形成转移有关。用免疫细胞化学法显示的神经纤维，在局部组织中可能出现纵横交错的复杂图像，用图像分析仪可获得单位面积内神经纤维的总长度。又如去甲肾上腺素神经纤维呈串珠样，如果测出一定范围内神经纤维总长度及局部膨大数目，即可计算出串珠平均间隔距离，比较精确。

（三）面积

无论是在光镜或电镜免疫细胞化学标本的观察中，都要涉及有关标本中某些结构的面积问题。即使是极不规整的结构，用图像分析法容易算出其面积。在一定的放大倍数下，每 μm2中含多少像素可以测出，画出待测结构的轮廓，在所勾画的范围内含多少像素是立即可显示出来的，这样，很快可算出面积的数值。例如免疫电镜技术中的铁蛋白法、胶体金法等，可用上述方法进行单位面积中反应产物颗粒的计数，可进行各种实验条件的比较。

曾有人在肝脏切片上进行图像分析，在一定范围内所有细胞核的总面积显示为 51554 像素，其中肝细胞核总面积为 27431 像素，可知肝细胞核占全部细胞核总面积的 53%。

四、图像分析仪工作程序

使用者对硬件不需操纵，它们可完成复杂的运行过程，完整的计算机软件可按实际需要使其执行功能。对操作者来说，图像分析仪的实际操作很少，几乎完全是通过一个称为光电鼠标（mouse）的附件来操纵的。计算机屏幕上显示出多项指令，可由光电鼠标来指明你所需要的程序，光电鼠标可控制计算机屏幕上的一个光标，移动光电鼠标也随着移动，将光标移到计算机屏幕上显示的某项功能的区域内，就表示选择了该项功能，可以开始工作，极简便。图 9 - 1 为图像分析仪的简化图。

图像分析仪主要包括输入（input）、中央信息处理机（central processor）和输出（output）三大部分。实际上，工作程序并不是一成不变的，后面的步骤的信息常会反馈到前面，于是又重复前面的程序，具体步骤如下：

1．标本成像 移动标本使需要观察的部位在电视摄像机上得到适当放大的图像，标本包括组织切片或电镜照片或照相底片等。

2．图像获取 用电视摄像机或其他方法将图像转变为电信号，在此过程中，摄像机的性能极重要，不能使用那些便宜的适用于监视的电视摄像机，一定要用使图像具有很好的清晰度的摄像机。

3．加强图像 加强电子图像（electronic image）使其更适合于分析。

4．检测检测（detection）是图像分析过程中设法从图像中确定并且分离出需要分析灰度相的步骤，“相（phase）”是图像中我们想要测量的部分的总称。检测是通过选择一定的阈值来完成的，如果所需相比背景暗，那么所有暗于下限的东西都被选，例如相的灰度是 20～50，20 是下限，50 是上限，背景的灰度小于 20，检定时暗于灰度 20 的东西都被选。如果所需相比背景亮，如免疫荧光细胞化学技术的标本，那么亮于上限的东西都被选。如果所需相比背景亮，如免疫荧光化学技术的标本，那么亮于上限的东西都被选，例如相的灰度是 5～20，5 是下限，20 是上限，背景灰度大于 20，所谓上限既指比灰度 20 浅的亦即灰度 20 以下的相被选，而背景是暗于上限的，不被选作测量。如果相暗于图像某些部分而又亮于图像的另一些部分，那就要在二限之间的部分选择灰度了。

在检测过程中要使用图像框（image frame）和测量框（measurement frame）。检测只在图像框内进行，框的大小按需要而定，测量框在图像之内，是进行测量的部位。两个框之间的部分称为保险区（图 9 -2）。

图像中每个被测物都有其特有的特征计算点（feature count point, FCP）,FCP 在被测物的最底点，如图 9 - 2 中上面 10 个被测物的 FCP 均在测量框内，可计数或作其他测量，而最下面 2 个被测物的 FCP 不在测量框内，则不计在内，在测其他区域时再计算，有的被测可能被测量框截断，那么测量框外的那部分被测物应该位于保险区，即保险区要大于被测物，才能观察 FCP 是否在测量框内而决定取舍。这样当换到相邻的区域进行测量时，不会使某图形重复测量，可避免测量误差，图 9 - 3 显示放置标本的显微镜载物台的移动方式，可由计算机控制，用编制好的程序，使载物台按一定方式移动，也可以人工操作。图中可以看出每个部位都将通过测量框，不会遗漏。

图 9 -2 示测量框位置，图中有 10 个被测物的 FCP 在测量框内

5．阴影校正校正图像细节 直到正确无误并达到能被测量的要求。所谓阴影（shading）是指人眼看来是均匀的视场内存在着不均匀的电子反应，这使得灰度相同的图像成分由于在视场中所处位置不同而显示出不同的灰度，这种影响必须校正才能使图像得到准确测量。阴影有三个主要的来源：

（1）图像源的不均匀的光照。

（2）穿过透镜时光路发生变化引起的透镜阴影。

（3）显像管本身的图像灵敏度差异引起的扫描阴影。]

任何图像分析在具体运用中都有这些阴影存在，前二者可通过精密安装图像分析仪来控制，后者可通过对显像管的质量严格筛选来减少影响。阴影可贮存起来，并且在每上次扫描时同步地从图像信号中去掉。

图 9 -3 显微镜载物台移动方式

1. 载物台移动方向；2. 晕微镜观察视场；3. 图像框；4. 测量框

6．测量经以上各步骤后，可以用图像分析仪的计算机对图像进行测量来取得所需的参数，如灰度、面积、长度、个数等。原始的参数可由计算机转化成容易理解的数值，例如面积可由某图形所占像素数转化为平方微米，使观察者容易理解。

7．资料分析 将资料进行分类，并加以说明，以便做出结论。也可将资料贮存，随意可提取出来，供研究者使用。

8．其他事项

（1）标本要清洁：如果标本上有污点，研究者可分辨哪些是正常的免疫反应产物，哪些是污染引起的，但仪器不会区别，只要是电视屏幕上测量框内有的东西都会被测量，如测灰度时切片上有污点，会影响结果。

（2）电压要稳定：这一点是结合我国目前情况而言，虽然仪器使用时是通过稳压器的，也要经常注意稳压器上的电压指针是否稳定，否则也影响结果。

（3）价格问题：图像分析仪广泛应用于工业、农业、医学等领域，因此并不是价格愈贵就愈好，而要看我们的应用目的及其性能，以免购置一些用不着的昂贵的附件而造成浪费。一般可以从以下三方面来考察仪器性能：在本专业范围内应用的广度、运算的速度和操作的方便程度。

（4）合作使用：分析仪价格昂贵，根据国内目前实际情况，有些工厂购置了图像仪而仅仅用作工业金相分析，闲置的时间很多，我们从事医学研究的人可以去充分利用它的性能，联合进行科研工作，发四川省目前最高级的图像分析仪就是在工厂中而不是在高等学校中。

五、没有图像分析仪可否进行图像分析？

当没有图像分析仪时，研究者早已想到用网格来进行图像分析，也获得了客观的评定结果。网格可分为两大类：一类是置于目镜内的网格，可测量切片标本上的各种数据；另一类是大的网格，可放在照片上，光镜电镜照片均可用，对照片上的各种结构可进行测量。以上二者至今仍被采用。英国标线片公司提供许多型号的市售标线片（即网格）。有的国家制造的显微镜，将目镜与带有六种不同型号标线片的旋转盘装在一起，以便于观察者作各种测量。国内某些单位有自制标线片，并有少量出售。

Aalto 等 1982 年曾在“免疫组织化学的形态测量法一卵巢肿瘤内的胚性癌抗原”一文中推荐用视野评分法，他用三种方法对 PAP 法免疫组化标本进行分析：①对全切片的染色进行分级。②在 10×10 放大倍数下，每一切片用目镜网格任选 25 个方形视场进行观察，并对每一视场进行分级。③在 25 个视场内取 25 个点的着色强度进行分级。染色强度分为 0 级、1 级（轻度）2 级、（中度）、3 级（重度）。方法①的结果不同于②③，而方法②和③差别不大，说明主观估算的鉴别能力低，一般镜下观察不能确切反映染色强度。

用网格进行图像分析的方法很多，如用免疫荧光等方法显示神经纤维，要表示各处的纤维密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用网格法就要客观一些，在目镜或照片上放上网格，观察阳性神经纤维与网格上的线条的交叉次数，排列密集的区域交叉次数必然多些，这就比较客观，重复性也较好。

用荧光显微镜观察免疫荧光标本，Ploem 曾在 1977 年指出荧光强度之差至少要二倍才能在直观估计时显示出差别，说明人视觉对荧光强度变化不够敏感。作者在工作中体会到，可利用照相的自动曝光系统来作相对定量，因为荧光愈强则自动曝光时间愈短，荧光弱则自动曝光时间长，相当敏感，用眼睛观察二个荧光强度几乎无差别的细胞，也能在自动曝光时间上显示出差别来。作者曾经将许多荧光标本用相同的曝光时间拍在同一个胶卷中，冲洗后，荧光强的区域胶卷上显色深，荧光弱的区域胶卷上显色浅，因为荧光容易淬灭，用此法可将胶卷较长期保存，而且胶卷上的信息还可通过图像分析仪测灰度等数据。这些都是在实践中的一点经验，供读者参考。

用网格测量的具体操作举例：图 9 - 4 为一关联方测格，由于测点、测线、测面之间有互相关联的关系，故称为关联方测格。方格直线交叉称为测点，总数为 100 个，方格中所有直线称为测线，小方格边长为 d 如图中所示，测线总长度为 200d, 整个大方格为测面，测面总面积为 100d2，测格周围的虚线不是测线。关联测格的优点是：只在计数位于欲测图像中的测点数 P，就可计算位于该图像中的测线长度 L 及测面的面积 A。计算方法为：L=2d·P，A=d2·P。

可将图 9 - 4 摄制于小的透明胶片上，剪成你所用的目镜筒的内径大小，将其置于目镜内，使测格清晰地叠映组织标本的图像上，则可进行测量。d 的长度可用台微尺来确定。也可将 9 - 4 复印在较大的透明胶片上，可用来测量电镜照片或光镜照片，将透明胶片叠加在照片上即可进行测量。图 9 - 5 为一测量的例子：

图 9-4 关联方测格

图 9 -5 示测点计数

此关联方测格共有测点 100 个（如果只计数粗测点则有 25 个），图像为一个肾小体的轮廓，包括血管球和肾小囊腔，测点计数的结果，在肾小囊腔内的测点数为 12，在血管球内的测点为 49 个，整个肾小体内的测点为 12+49=61 个，用台微尺测出 d 的长度，则可得到此图像中肾小囊腔的面积，血管球的面积，肾小体的面积。明小囊腔与肾小体的面积比 12：61=19.7% 等多个参数。

值得提出的是，在显微镜下网格的线条有一定宽度，如图 9 - 6 所示。计数测点时如①箭头所示，即横线上缘与竖线右缘交点处为真正的测点，若此点落在图像外面则不能计数。如②箭头所示，此测线的上缘才能作为真正的测线。

图 9 -6 示真正的测点与测线

表面积密度的测定：免疫细胞化学电镜照片中的膜性结构如内质网、线粒体、细胞膜等都可测定表面积密度，光镜标本中的各种结构也可同样测定。表面积密度是指单位体积参照空间内特征物的表面积，通过数学运算可简便地用以下方法测定：测量单位面积参照面内特征物断面周界线的长度。如果某一个细胞的电镜照片作为参照面，线粒体作为特征物，欲测单位面积电镜照片内线粒体断面周界线的长度，可用以下公式：

SV=2IL

SV表面积密度 2IL交点密度

IL= 测线与特征物断面周界线之间的交叉点数除以参照面内测线总长度。

图 9 - 7 为一咱摆线测格，可用来方便地测表面积密度。图中的平行直线不是测线，仅是为了便于计数交叉点和测点而画上的。图中的曲线即摆线，也就是测线，共 45 条，每条摆线长度 d =1/10 测格宽度 (1cycloid arc =1/10×frame width)，测格的宽度容易测量，如用目镜测格，可用台微尺测量，如用大的透明胶片，可实际用尺测量，因此每条摆线长度很易算出。测格中共有 45 条摆线，其总长为 45d。图中直角短线（L）示测点，共 90 个，测线长度 L 与测点数 P 的关联关系为 L =d/2·P。具体来说，用图 9 - 7 摆线测格，置于一个细胞的超微结构照片上，如果整个测格均位于照片内，则参照面内测线总长度为 45d, 如果 90 个测点只有 60 个落至细胞内（即测格中有 30 个测点落在此照片外）则参照面内的测线总长度为 d /2·P=d/2×60=30d。摆线与特征物（如内质网膜、线粒体的膜等）的交叉点容易数，用上述 I L 和 S V公式即可得出所需参数。此公式为经过数学上的研究而得出，我们可应用公式来作表面积密度的研究。

读者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的随机切片。若特征物呈各向异性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt 等曾提出在一个组织块中作三个互相垂直的切片（three mutually perpendiculersections）用作研究。目前通用的垂直切片的概念是 1986 年 Baddeley 等人提出，指垂直于某任意确定的水平面的随机切片，或平行于某一任意确定的垂直轴的随机切片。如图 9 - 8 所示，HP 为水平面（horizontal plane），VP 为垂直面（vertical planes），二个垂直面互相不是平行关系，成一定角度。在生物组织中，如皮肤的表皮、各种上皮的外表面均可作为水平面，只要与水平面垂直的各个方向所切的切片均为垂直切片。骨骼肌纤维的长轴、长骨的长轴均可作为垂直轴，与其平行的切片也作为垂直切片。管状的器官如消化管、呼吸管道等，可纵向剖开，展平，当作水平面，在其中作垂直切片如图 9 - 9 所示：以水平面为基准，垂直切片必需在随机的位置和随机的方向，在标本计划中，第一步是需要随机，常用一组系统随机位置的垂直切片（systematic randomly positionedvertical sections），第一个切面是随机的，其余切面则是与第一个切面或一定的角度而选择的，如图中（3）和（4）即表示三个不同的方向，但都垂直于同平面，即垂直切片互相间有一定的旋转角度。图 9 - 7 摆线测格中大箭头所示 vertical 表示箭头方向与标本垂直轴一致，即图 9 - 8 中的 verfical 所示方向。

如果有的标本没有可辨认的垂直轴，可任意确定一个水平面，来作垂直切片。

图 9 -7 示摆线测格

9-8 示垂直切片

VERTICAL：指垂直轴；

P：水平面；二个 VP 为垂直面，互相不呈平行关系

图 9 -9 示管状器官的垂直切片

六、实例介绍

因为将免疫细胞化学方法与图像分析结合起来进行研究的论文在国内国外都还不多。在第六届国际学术会议上发表的 90 多篇论文中只有 1 篇，因此在实例介绍中，包括一部分不是免疫细胞化学方法，而是用其他组织学方法与图像分析结合起来研究，但这种方法对研究免疫细胞化学标本也可借鉴，从中可得到一些启发的，也在此选择性地作一些介绍。

Mcmillan 等 1983 年在第六届国际体视学会议上曾报告了“用图像信息处理机客观评定免疫组织化学染色的组织”，阐明了当组织与第一抗体作用时，不断搅动血清，明显提高了免疫反应。Bordier 等 1982 年用图像分析法对大鼠的神经垂体进行研究，阐明了轴突占神经垂体体积的一半，分泌颗粒占轴突体积的 20%，加压素的含量与分泌颗粒的体积密度无关，而与分泌颗粒内激素浓度有关。这些结果如不用图像分析法是很难得出的。Steward 等 1983 年用测量家鸡脑单位面积内的突触数目等，来研究与记忆形成有关的细胞学改变。

英国现在有 300 万 75 岁以上的人，其中有五十万人患有老年性痴呆（Alzheimer 病），这种病过去认为是由于年龄增长的不可避免的现象。英国神经科学所用图像分析仪与谷氨酸盐受体的放射自显影法结合起来对此病进行了重要的研究。由于放射自显影会产生一些非特异性的结合，用图像分析仪可以从全结合图像减去非特异性结合图像，而得到特异性结合图像，可以测出特异性结合的百分率。目前已知道，老年性痴呆患者脑中，与记忆、理性行为及感情行为有关的区域内，神经元的进行性退变，神经递质发生改变，影响了从一个神经元到另一个神经元的信息传递。

我国 1991 年 11 月出版的“计量学在形态学研究中应用学术研讨会论文集“共收集论文 123 篇，其中有关免疫细胞化学与计量学结合的论文共 8 篇：①大鼠烫伤后下丘脑室旁核和视上核内 AVP 含量变化的形态学计量（第二军医大学张忠义等）用图像分析仪测定 AVP 阳性反应物的面积。②人脊神经节 内 SP、SK、CGRP 免疫反应细胞的比率（中国医科大学方秀斌等），用人工计数方法。③交感神经元和胆碱能神经元中 ACh 和 ChAT 显示比较（军事医学科学院汪家政等），用图像分析法测定各种参数。④大鼠脾树状突细胞的组织分布棗 S—100 蛋白标记和立体计量分析（南京铁道医学院张锦堃等）用目镜标线片的测格进行定量研究。⑤垂体 GH 腺瘤细胞分泌颗粒的免疫胶体金定位检测及定量分析（中国人民解放军总医院罗毅等），用图像分析法测定各种参数。⑥胃肠粘膜重度异型增生与腺癌细胞核 DNA 含量的测定及免疫组化的比较研究（上海第二医科大学吴平平等），用显微分光光度系统进行 DNA 测量。⑦免疫组化在胃癌病理棗生物学分型中的价值（滨州医学院张树毕等），将免疫组化反应分为阳性阴性而进行比较。⑧人胎十二指肠 EC 细胞的体视学研究（江西医学院朱清仙等）用目镜标线片测格进行定量研究。由此可大致体现我国在此领域的研究现状。

七、图像分析与体视学

图像分析还可用于三维重建，用连续切片可重建立体的原形，在神经组织的研究中很适用。我们在显微镜下观察到的是平面图像，而这些平面图像是从立体结构中切下来的，单凭平面图像不能反映组织的真实结构，例如圆形可以从球形、圆柱形、椭圆形物体中切下。如何从二维结构推导出三维结构，这就是所谓体视学（stereology）所研究的范畴。stereology 这个词是 1961 年开始正式应用的，由于体视学与图像分析的密切关系，无论是国际上的或国内的学术会议都将这二者放在一起讨论。

将体视学知识与免疫细胞化学标本观察联系起来，将是一种可以获取更多信息的研究手段，目前国外已很重视体视学的研究方法，发表了一些论文，国内也开始做这方面的工作，因此有必要将体视学的一些基本术语介绍给读者，供参阅文献时或自己进行研究时应用。体视学语言目前已是一种通用的术语，现将常用的介绍如下：

结构（structure）：在一个确定的组织模式中，由许多相互依赖的部分所组成的某物体称为结构。一个结构至少有二个组分构成，体视学的目的即弄清楚各组分之间相互关联程度、相对大小等。

组分（component）：在结构中能被截然分开而且能被辨认的部分。

相（phase）：所有在本质上相同的组分的集合称为相。例如一个细胞的所有线粒体构成了此细胞的线粒体相。

粒子（partiele）：假如组分是由许多离散的并且能够作为单元独立存在的要素所组成，则将这些要素称为粒子，粒子可以表现为各种形状。

凸面体（convex solid）：连接此实体内任何两点的线段，必需全部落于此实体内，换句话说，即此实体上切下的一个切片只能形成一个截面。

包容空间（containing space）：指包含被研究的组分的空间。当然，被研究的组分常与其他不被研究的组分并存。

密度（density）：单位体积、单位面积或单位长度内的量。

体积密度（volume density）：在单位包容空间内，某相的体积。

表面积密度（surface density）：单位包容空间内所含有某相的表面积。

长度密度（length density）：单位包容空间内某相的长度。

数密度(numerical density)：单位包容空间内某相的数目。

截面（profile）：任何结构的切片上的图像。

体视学的测量值往往是相对测量值，以两个彼此相关联的测量值的比率来表达，其中一个测量值与组分有关，另一个测量值与包容空间在关，后者也称为“参考系统”。体视学原理可确定在切片上测得的这些比率与空间结构内相应的比率之间的精确关系。上述性质反映在体视学符号中，而这些符号目前已普遍被使用，在有些文献中已不再作解释了。常用的符号如下：

P 测试点数

P1 单位测试线长上的交点数

Pa 单位测试面积上的点数

Pv 单位测试体积上的点数

L 测试线长

L1 单位测试线长上的截距

La 单位测试面积上线的单元长

Lv 单位测试体积上线的单元长

A 测试面积

S 表面积

Aa 单位测试面积上被测物的面积

Sv 单位测试体积内被测物的表面积

V 体积

Vv 单位测试体积内被测物的体积

N 被测物数目

N1 单位测试线长上与被测物相交的数

NA 单位测试线长上与被测物的数

Nv 单位测试体积内被测物的数

用测试网格的体视学方法，杨光等，1987 年曾对腹腔神经节 小强荧光细胞进行超微结构的定量分析，测量了线粒体、溶酶体、粗面内质网、颗粒小泡的 Vv、Sv、Na、Nv 等参数，得出了标准小强荧光细胞的计量值。此处的 Vv 即单位体积细胞质内某种细胞器的体积，据体视学原理，Vv 等于切片上被测的某种细胞器所占的面积的均数 a 与细胞质的面积的均数 A 之比，如用图像分析仪即可得出此二者的面积，而用测试格 a 等于落在此细胞器上的测试格的交点总数∑Pi，A 等于落在细胞质上的测试格交点总数∑Pc。

Vv=ā/A=∑Pi/∑Pc

测试格的交点数有各种规格，如果有 20 条横测试线与 20 条纵测试线组成的测试网格，则有 400 个交点，利用交点所落部位进行推算。

免疫组织化学形态计量研究中参照空间的“陷井”问题。在某种组织结构（参照空间）内测量特征物的密度值（如体积分数、表面积密度、长度密度、数目密度等），如果不知道参照空间的体积，得不到绝对值，就有可能作出错误的结论，就是参照空间的“陷井”。举一例子说明：实验的结果苯巴比妥对大鼠肝细胞中的内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，如果依此就认为苯巴妥对肝细胞（参照空间）内质网无显著影响，就错了，就进入了参照空间的“陷井”中去了。实际上，在些实验条件下，肝细胞质总体积显著增加，因而虽然内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，但其绝对值已显著增加了。因此，要测量或估计参照空间的体积、乘以密度值，获得绝对值，才能获正确的结论。

八、国内外生产图像分析仪的情况简介

（一）国内情况

80 年代初，以 IBM—PC 为代表的个人计算机得到了突飞猛进的大发展和在普及；紧接着各种功能强大面向图像处理与分析的专用超大规模（VLSI）蕊片或单板达到商品化水平，两者的结合，为微机图像处理系统的问世奠定了硬件基础。打破了以往只能在大中型计算机加专用图像处理系统的构成价格昂贵的图像处理系统的局面。为推广图像处理与分析技术创造了物质基础。从 80 年代中期开始，国内先后有武汉大学、清华大学、中科院自动化所、计算所、重庆大学、四川大学、华北计算所等单位，纷纷进行微机图像处理与分析系统的研制和推广应用工作。其中以四川大学计算机系图像图形研究所研制开发并定型生产的 MIAS 系列图像分析仪在国内具有较大的优势，获得了 1992 年国家级新产品证书。

现介绍如下：MIAS 系列图像分析仪包括伪彩色型 MIAS—300，真彩色型 MIAS—400，超高分辨率型 MIAS—1000 等面向生物医学、金相分析、石油地质以及其它专用目的的各种图像仪均由硬件系统和软件系统两大部分构成。硬件系统主要包括 MIAS 图像处理计算机、图像输入设备，图像输出设备和交互式处理设备等。其主要性能指标：图像分辨率 512×512，640×480，1280×1024。图像采集速度：电视方式 0.04s/ 帧，慢速高精方式 2～10 秒 / 帧。图像存储体：MIAS—3000.5MB～1.5MB（兆字节），MIAS—4001.5MB～4.5MB,MIAS—1000 2MB～10MB。灰度等级：256 或 4096。专用图像处理器特性：IPU40MHZ 主频，>10MIPS。IFU（图像浮点处理器）40MHZ 主频，>4MFOPS（每秒兆浮点处理指令）。在各种图像输入设备中，以视频摄像机为图像的基本输入设备，也可以配接视频录像机、数字扫描仪和连接扫描电镜的专用接口。高分辩彩色监示器为图像的基本输出设备。该系统还具备有自动移位的载物台和自动聚集控制系统可供用户选择。MIAS 系列图像分析仪的软件系统是在 DOS（磁盘操作系统）3.2 以上环境开发的，全部采用 C 语言和汇编语言（80286 宏汇编，TMS340 系列专用汇编）进行编程，共 98 个功能模块。主要功能包括初始化及环境设置、图像输入和输出、图像编辑、图像增强、图像分割、图像测量、实用程序等。测量参数包括一维和二维目标的各种形态参数，灰度参数和纹理参数等数十种。该系统在长期为华西医科大学、第一和第四军医大学、北京军事医学科学院、上海医科大学、湖南医学院、哈尔滨医科大学等数十个医学单位的服务中，积累了许多有效的实用算法和功能、用户界面和处理速度方面已达到和超过某些进口中高档图像仪的水平。

（二）国外情况

英国的主要生产厂家有剑桥仪器公司（Cambridge Instruments Company），在图像的测量、计算、比较、分类等功能上都比过去的产品更完善，使用了大功率的新型计算机，使用 QUIPS 程序可获得各种图像分析测量的数据，重现性好。操作者不必精通程序设计语言，只需接受几小时使用 QUIPS 语言的教学训练即可。

英国 Ealing—Beck 公司生产 Histotrak 图像分析系统，如用透射光，该仪器能自动改变放大倍数。具有阴影校正系统。最使研究工作者感兴趣的是该仪器中设有坐标发生器，能使被检图像的坐标数据通过台式计算机在输出打印机上打印出来。

英国 Micro Measurements 公司生产电视扫描图像分析仪，成本较低，用途较多。

英国 Joycez—Loebl 公司生产 Magiscam 图像分析系统，操作较简单，可解决一般图像分析问题，并可进行彩色图像分析，在医学和放射学等方面适用。

美国的主要厂家有美国美敦设备公司（Milton Roy Company），生产 OMNICON 图像分析仪，据上海多国仪器仪表展览会资料介绍，Ommicon 图像分析系统有 Omnicon Alpha500 用于常规检验和研究。Ommicon FAS—III 用于医学和生物学领域较合适。Omnicon 3500 为一种多用途的系统，配有 64K 通用 NOVA4×计算机。Omnicon 5000 是该公司发展的使用起来最方便的定量图像分析仪。Omnicon 7500 是为了对图像作实时分析而设计的产品。

德国 Leitz 公司制造 Leitz T.A.S 图像分析仪，图像输入装置是一台 Leitz Orthplan 显微镜，该仪器还包括一台 TU—58 双盒式磁带机，可用于存贮程序、数据、图像。该公司产品的新型号是 Leitz T.A.S PLUS，增加了自动调焦、自动图像旋转等功能。

德国 Carl Zeiss 公司的产品是 Micro—Videomat，主要优点是有适用于计算机和大型计算机的程序。型号有 Micro Videomat 2 型、3 型等。

德国的 OPTON 公司生产 IBAS2000 图像分析系统，可应用于显微图像分析的所有领域，如放射自显影、染色体分析、真色图像信息、细胞学分析、用连续切片来重建原形、颗粒大小分析、纤维分析、可测定交叉的或重叠的纤维长度及纤维的长 / 宽比例等。

德国 VEB Zeiss Jena 公司生产 EPIQUANT 图像分析仪，可进行自动或半自动分析。

日本浜板电视公司生产一系列特殊用途的、测量特殊参数的自动分析系统，如其中有一种称为 Multianalyser 的，与显微镜相结合，可用来测面积、长度等。

对国内外资料收集比较局限，总之购置仪器时要充分了解性能、对价格作比较、才能获得满意的结果。

参考文献

1．Jenkinson G. An introduction tothe operation and capabilities of image analysis systems.International Labmate,1987：12(3～4)

2.WeibelER. Stereological methods –practical methods for biological morphometry. London：Academic Press,1979

3.McMillanPJ. Objective evaluation of immunohistochemically stainned tissues using animage array processor. 6h International congress for Stereology, 1983

4.AaltoML, et al . Morphometric approach to immunohistochemisiry：carcinoembryonic antigen(CEA)inovarian tumours. Acta Stereologica, 1982；1(2)：347～356

5.BoudierJA. et al. Stereological analysis of the rat neurohypophysis. ActaStereologica, 1982；1(2)：323～328

6.StewardMG, et al. Stereologlcal analysis of synapses in the brain of the domesticchick following avoidance learning. 6th International Congress for Stereology,1983

7.CambridgeInstruments Issue 2, 1987

8.WiernikG, et al. A quantitative comparison between normol and carcinomatous squamousepithelia of the uterine cervix, British Journal of Cancer, 1973；28：488

9. 杨光，等. 豚鼠腹腔神经节 小强荧光细胞超微结构的定量分析. 中国第四届体视学与图像分析学术会议论文汇编(第一集),1987]

10. 孙培懋, 等译. 图像分析入门. 北京：计量出版社,1983

11. 管汀鹭译. 显微术中的分析与定量方法. 北京：科学出版社,1983

12. 杨正伟. 生物组织的形态计量研究中应特别注意的两个问题：参照空间的“陷井”和样本含量问题. 川北医学院学报,1992；7(3)：73～76

13. Crus- Orive LM, et al：Recent stereological methods for cell biology：abrief survey. Am J Physiol, 1990；258(Lung Cell/Mol . Physiol. 2)：L148～L156

14.Baddeley AJ, et al.：Estimation of surface area from vertical sections. J of Microscopy,1986；142：259～276

15.Mattfeldt T, et al. Orthogonal triplet probes：an efficient method for unbiased estimationof length and surface of objects with unknown ori-entation in space. J of Microscopy, 1985；139(3)：279～289

第十章 流式细胞术（FCM）在免疫细胞化学中的应用近些年来，流式细胞分析技术已经成为细胞生物学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域中的一项新的有效工具。本章 主要介绍流式细胞分离及分析的基石原理、流式细胞计的基本结构和操作、流式细胞术在免疫细胞化学中应用的技术思路、途径和方法，以及它们在临床医学中的应用。对 FCM 在外周血白细胞的免疫组织化学分析方面的应用作重点介绍。

第一节 流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在 1 秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM 目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。

1934 年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953 年 Crosland –Taylor 根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

1956 年，Coulter 在多年研究的基础上利用 Coulter 效应生产了 Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967 年 Holm 等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973 年 Steinkamp 设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代 FCM 计数技术的主要历程。

现代的 FCM 数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是 Kamentsky。1965 年，Kamentsky 在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky 不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。

流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是 Van Dilla 和美国的 Los Alamos 小组。他们在 1967 年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光 Feulgen 反应对 DNA 染色显示出 DNA 的活性与荧光之间存在着线性关系，并在 DNA 的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和 Dittrich 接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM 用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。

近 20 年来，国内外在 FCM 上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大 FCM 的应用领域和使用效果。FCM 在免疫组织化学中的应用也大致差不多，并注重了在临床应用的推广。

二、流式细胞计的基本结构和工作原理流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。国外又把流式细胞计称作荧光激活细胞分选器（Flu-orescence Activated Cell Sorter, FACS）。美国 Becton—Dickinson 公司生产的流式细胞计系列均冠以 FACS 字头。目前我国国内使用的仪器多为美国、西欧及日本等国的产品，国内有些单位也已研制成功，但尚无定型产品面市。

1．流式细胞计的基本结构 流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。图 10- 1 为其结构示意图。

图 10-1 流式细胞计结构示意图

（1）流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度 υ <10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。

（2）激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于 300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光 514nm 和蓝光 488nm 的谱线最强，约占总光强的 80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以 647nm 较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在 550nm 以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有 Rhodamine6G 水溶液的染料激光器, 则可得到 550～650nm 连续可调的激光，尤在 590nm 处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径 d 可由下式确定：d=4λf/πD。λ 为激光波长；f 为透镜焦距；D 为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长 λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用 525nm 带通滤片只允许 FITC（Fluoresceinisothiocyanate, 异硫氰荧光素）发射的 525nm 绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

（3）光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT 的响应时间短，仅为 ns 数量级；光谱响应特性好，在 200～900nm 的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从 103到 108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于 0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的 PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比 PMT 好。

从 PMT 输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例 DNA 测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差 1～2 个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

（4）计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模 - 数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的 6～8 个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。

2．流式细胞计的工作原理 下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据处理等工作原理。

（1）参数测量原理：流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为 2π 的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即 0 。角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称 90。角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞 / 活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

（2）样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十 KHz 的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百 μm。实验经验公式 f =v/4.5d 给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中 v 是液流速度，d 为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选 +150V，或 -150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十 ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

（50）数据处理原理：FCM 的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

①数据显示：FCM 的数据显示方式包括单参数直方图（histogram）、二维点图（dotplot）、二维等高图（contour）、假三维图（pseudo3D）和列表模式（listmode）等。

直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般 X—Y 平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用“道数”（ChannelNo .）来表示, 实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数。图 10- 2 给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在（图 10-3）。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

图 10-2 直方图

图 10-3 二维点图

二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图 10- 4 给出了二维等高图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。图 10- 5 为假三维图的示意图。

图 10-4 二维等高图

图 10-5 假三维图

列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用 ListMode 中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图 10- 6 给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。

图 10-6 从二维图设窗调出直方图示意

上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。

②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的 DNA 含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到 FCM 的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。

因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。

3．流式细胞计的技术参数 为了表征仪器性能，往往根据使用目的和要求而提出几个技术参数或指标来定量说明。对于流式细胞计常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。

（1）荧光分辨率：强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰，荧光分辨率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数（C.V 值）来表示。C.V 的定义式为：

C.V=σ/μ

式中，σ 为标准偏差，μ 是平均值。

在实际应用中，我们使用挖关系式 σ =0.423FWHM；其中 FWHM 为峰在峰高一半处的峰宽值。目前仪器的荧光分辨率均优于 2.0%。

（2）荧光灵敏度：反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出的 FITC（fluoresceinisothiocyanate 异硫氰基荧光素）的最少分子数来表示。目前仪器均可达到 1000 左右。

（3）分析速度 / 分选速度：仪器每秒种可分析 / 分选的数目。一般分析速度为 5000～10000；分选速度掌握在 1000 以下。

（4）样品浓度：主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在 105～107细胞 /ml 的数量级。

其它技术参数尚多，不再一一介绍。

4．流式细胞计的调试和使用 古语说：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地应用流式细胞分析和分选技术，必需先对仪器进行调试，使其处于良好的工作状态，并能正确使用仪器。下面简要介绍细胞计的调试项目及要点、使用的程序等等。

（1）调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。

液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节 气体压力大小以获得稳定的液流速度。

测量区光路调节：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90。散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而 FCM 中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。FlowCytometry Stands 公司可提供荧光强度药盒，在免疫实验中可用来作为定量荧光标准来测定每个细胞所标记的抗原位点数目。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取 3.8% 枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：鸡血 =1：4），经 PBS 清洗 3 次，再用 5～10ml 的 1.0% 戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化 24h，最后经 PBS 再清洗，贮 4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。

（2）仪器的操作和使用：

①打开电源，对系统进行预热；

②打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；

③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和 90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

⑧将所需结果打印出来。

在操作和使用中一定要注意如下事项：

1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；

2）光源不得在短时间内（一般要 1h 左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；

3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；

4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；

5）特别强度每次测量都需要对照组。

本节 着重介绍了流式细胞计的基本结构和工作原理、技术指标及使用操作中的基本问题。由于实际使用的仪器厂家、型号差别很大，不能一一介绍，可参照仪器使用说明书使用。至于流式细胞术在生物医学工程和免疫组织化学应用中的一些具体技术途径则在下节 详细介绍

第二节 FCM 在生物医学工程学方面的应用流式细胞术在细胞生物学、分子遗传学、微生物学、免疫学、分子生物学以及临床肿瘤学、临床血液学等诸多领域都有广泛应用。本节 概要介绍它们的技术途径及主要原理，大家可以从中看出它们是和细胞化学密切相关的。

一、FCM 应用的技术途径FCM 是通过测量细胞的多种参量来获取信息的。细胞参数分为结构参量和功能参量两大类。结构参量主要用于描述细胞的化学组分和形态特征；功能参量主要是描述细胞整体的理化和生物特性。这些参量有的需要经荧光标记方可测定，有的并不需要荧光标记。DNA 以及 RNA 的含量，蛋白总含量、胞内 pH 值和细胞大小等为结构参数；细胞周期动力学、特殊配体的鉴定、特殊细胞的生物活性等则为功能参数。

1．DNA 和 RNA 的测量和分析 DNA 和 RNA 的含量可以用多种荧光探针标记后测出。对细胞内 DNA 含量的测定可用于细胞生物学方面的研究和临床肿瘤学的诊断；测量 RNA 的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数；DNA 和 RNA 含量的测定可以用于区别细胞周期中的 G 和 G 1 期。常用的荧光探针有吖啶橙（AO，Acridine·orange）、派洛宁 Y（PY，Pyronine Y）、HO（Hoechst）系列和色霉素 A 3（CA3）等。利用 HO/CA3双染色还可分析 DNA 的碱基组成。还可以结合 Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脱氧尿嘧啶核苷)单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内 DNA 合成。

2．蛋白质总量测定 用 FCM 可以测定细胞中蛋白的总含量，以检测一个细胞群体生长和代谢的状态，或区别具有不同蛋白含量的细胞亚群，如血液中的白细胞的分类。检测总蛋白的常用荧光探针为异硫氰基荧光素（FITC，Fluorescein isothiocyanate），FITC 以共价键方式与蛋白上带正电的残基结合。

3．特殊配体的测定 配体是与不同的细胞结构特异结合很强的各种大分子和小分子，通过对特异性的荧光标记的配体的测定可以获得不少有关结构参量和功能参量的信息。例如用标记的外源凝集素可检测细胞表面糖；用标记抗体可测表面抗原；用标记多聚阳离子可检测细胞表面电荷；用标记的激素、生长因子、神经递质和病毒等可检测细胞受体；用标记的大分子、微生物等可检测细胞的内吞性；用荧光素标记的亲和素以及带有 DUTP 的生物素衍生物的 DNA 探针跟靶细胞的 DNA 杂交能够检测原位的特殊基因等。这方面的应用范围广、有前途，已经成为研究细胞和组织中的抗原、基因和各种生化过程的强有力的新技术。用于这方面工作的荧光探针主要有 FITC、若丹明系列（如四甲基异硫氰基若丹明 TRITC、异硫氰基若丹明 X -RITc 和美国德州红等）、藻胆蛋白系列等。由于各种荧光探针具有不同的光谱特性，在使用中要注意正确地使用激光光源和滤片。

4．生物活性的测定 就生物流行性来说，主要包括两方面工作：①细胞本身的死活；②活细胞生物功能发挥的强弱。前项工作单一，后项工作要复杂得多。FCM 用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类：一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质；例如下醋酸酯荧光素（FDA，flourescein Diacetate）它可被活细胞持留而发出黄绿色荧光；若细胞有损伤则会从细胞中流失，观察不到荧光。另一类是不能透过活细胞膜，但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide）和溴化乙锭（EB,Ethidiumbromide）就是常用的第二类荧光探针。

用 FCM 来测定活细胞生物功能发挥方面和性能的指标很多。例如可用来测细胞膜电位、细胞内 pH 值和细胞内钙等，这些都和细胞的激活密切相关。FCM 也可用来测膜结构的流动性或微粘度等。有报告可以用 FCM 代替51Cr 的放射免疫分析来测定天然杀伤细胞（NK, Natu-ral killer cells）对靶细胞毒理学活性的大小。

二、FCM 的典型应用简介下面简单介绍 FCM 在各个领域中应用的典型实例，以求对 FCM 应用的全面了解，并能深入了解 FCM 在免疫细胞化学中应用的背景。

1．在细胞生物学方面的应用 细胞生物学是 FCM 应用最广泛也是最基本的领域，细胞周期分析是其基本分析内容之一，而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的 DNA 含量来达到的。

众所周知，细胞周期由 G 1期、S 期、G2期和 M 期所构成的。各期细胞的 DNA 含量如下：G1期为 2C，G2期和 M 期为 4C，S 期则在 2C 到 4C 之间。所以在 FCM 的 DNA 直方图上形成的谱线则为峰分布，而且 G 1峰的道数恰好是 G 2和 M 峰道数的一半（图 10-7）。研究表明：对于正常细胞群，各周期时相的细胞数的比例是同一的；对于恶性病变的细胞群则是非均一的（图 10-8）。

图 10-7 细胞周期的 DNA 直方图

图 10-8 细胞周期中的细胞数目与肿瘤的关系

临床肿瘤病学已经注意到细胞动力学的重要性。研究工作表明：肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感程度与细胞的增生率高低密切相关；采取细胞同步化（Cell Synchronization）措施可以提高疗效。例如可以使用雌激素这种外源性药物让雌激素受体阳性的乳腺癌细胞同步化。

临床微生物学可以用 FCM 对大量细菌的 DNA 和 RNA 含量进行测量，进行微生物鉴定、医学常规中的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。

FCM 优良的分析和分选功能在分子遗传学领域也能充分发挥。例如流式细胞核型分析技术就是用 FCM 对染色体进行分类、纯化，检测或定量测量细胞表面或内部由特异基本所编码的成份。这方面的成果已用在畜类性别的预选择，以及对人类计划生育等方面的工作。

2．在免疫学方面的应用FCM 以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面，尤其是结合单克隆抗体技术，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。基于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基础，我们着重介绍 FCM 在免疫应用中的技术问题。

（1）免疫应用的激发光源和滤片系统：适用于免疫技术的 FCM 的激发光是氪离子气体激光器，光谱中波长为 531nm 和 856nm 的谱线最强。为了扩大仪器对双标记或三标记染色的荧光信号的分辨范围可使用双激光光源。

为了减少细胞由于激光束造成的散射光对光电倍增管的影响，要使用贴有干涉膜的滤片系统。为了同时测定两种波长以上的荧光信号，光路中还要使用二向性分光元件。

为了测定伴随细胞转化过程所产生的早期免疫及生化性质的改变，例如膜的流行性，DNA 构象变化等，可以使用偏振片。

总之，应用于免疫学时要充分考虑有关光源及光学滤片系统的正确使用。

（2）免疫应用的荧光染料及染色：免疫应用中的荧光染料主要有 FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻红蛋白，575nm）及其组合。在进行多种标记时特别要注意结合抗体的每种色素都不干扰抗体反应的特异性，也不相互干扰。

免疫荧光染色有直接法和间接法二类：

①直接染色法

1）取约 106的细胞置于尖底离心管内，管内液体要少些。加荧光标记抗体，在 4℃温度下静置 15～30min。若作双标记染色也可直接加入。

2）用冷的 10% 的小牛血清、0.1% 的叠氮钠溶液，1/15mol/ L 的 PBS（pH4.4）离心清洗细胞 2 次。1000rpm 离心 5min 或 4000rpm 离心 1min。

3）加入适量缓冲液待测。

②间接染色法：

1）取 106细胞加特异的第一抗体，4℃温度下静置 15～30min。

2）加缓冲液离心清洗 2 次后，吸尽残留液体，弹散沉淀，加入荧光标记的第二抗体，4℃静置 30 min。

3）缓冲液离心清洗 2 次后加入适量缓冲液待测。为减少无关因素干扰，操作尽量在水浴中进行。

染色中应注意的事项：①细胞标本在整个过程中要尽量保持新鲜，采用有效措施防止表面抗原消失和细胞死亡；②荧光标记物用前应用滤膜或高速离心去除颗粒或沉渣以减少非特异性干扰；③细胞标本染色前应除死细胞；④为提高灵敏度可用三步间接染色法。

（3）免疫荧光标本的特殊处理：

①死细胞及碎片去除：样品中不可避免地存在着死细胞及碎片，影响分析结果。对于血细胞可用 FCM 通过 0 。散射的差异不经染色而将死细胞分出弃除；对于培养细胞，由于其大小分布不均，可在样品内加少量 PI 染色后将死细胞去掉。一般情况下即可用仪器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用离法去除小碎片。

②标本的保存和固定：实验中大多数样品在染色或分析前需要保存一定的时间，有时甚至需要进行固定。

未染色的新鲜标本贮存方法如下：10% 二甲基亚砜，90% 小牛血清，5×106～1×107细胞在 -70℃过夜，然后置液氮中可长期保存。

免疫染色未经固定的标本在 4 ℃可保存 48h。若需存放时间较长、或标本具有传染性，应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是：1%～4% 的多聚甲醛和 PBS 或 0.8% 的生理盐水配成 p H7.2 的固定液；或用 0.37%～1.5% 甲醛和 PBS 配成 p H7.4 的固定液。固定方法是：将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀，再加入固定液混匀，放在 4 ℃温度保存。一般来说，经固定处理的标本保存 1 周至 2 个月，多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。

（4）主要检测的免疫指标：

①细胞毒试验：细胞毒是机体的一种免疫监督机制，细胞毒实验是一项重要的免疫指标。例如天然杀伤细胞 NK（Natural killer）是一种引起免疫媒介的效应物，在抗肿瘤及感染因子的免疫监督系统中起着重要作用。研究表明，对 NK 细胞的测量可以做为免疫治疗监测的重要参数和有效的预后征状的指标。所使用的荧光探针为 CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。

②吞噬功能实验：单核吞噬细胞系统是机体的主要防御系统之一。FCM 可以快速、定量地检查吞噬细胞的吞噬能力和速度。

③I 型变变态反应的 IgE 受体细胞、IgE 结合因子的检查。

④胞浆 Ig 及血清 Ig 分析，血小板表面的 IgG 测定，等等。

3．在临床方面的应用FCM 在临床诊断、疗效评价和预后预测等方面都发挥了一定的作用。工作做得较多的主要在肿瘤学、血液病学等。这些都和 FCM 在荧光细胞化学中的直接应用有关。

（1）癌前病变的检测和预后评价：有效地发现癌前病变而给予阻断治疗，无疑是肿瘤防治的重要环节。FCM 的探测对象主要是癌前细胞，即那些处于正常细胞向癌细胞转化的量变阶段、尚未达到质变的细胞。研究表明，除心肌、肝组织及精子细胞外，人类正常的体细胞都具有恒定的 DNA 二倍体含量，而那些癌前细胞和癌细胞则在其发生发展过程中伴有 DNA 含量变化异常。另在资料表明：癌前病变向癌变的转化发生率与细胞的不典型增生程度有关，而细胞的不典型增生程度又与 DNA 含量的异常改变呈平行关系。利用 FCM 可以定量地测出癌前细胞的 DNA 含量并根据 DNA 分布直方图直观地反映出细胞的周期分布状态，从而了解到癌前细胞增殖能力变化的动态过程，这样便可以获得一些从组织形态学中难以得到的信息。

表 10-1 是以胃粘膜为例比较正常细胞和胃癌细胞在 DNA 含量及细胞周期分布方面的差异。

表 10-1 正常与胃癌的胃粘膜细胞 DNA 含量方面的差异

二倍体DNA 含量（%）细胞周期分布（x±s）非整倍体G/G1 S 期G2/ M 期正常细胞10088.9±1.25.0±0.63.4±0.7胃癌患者细胞10077.3±1.810.9±1.17.4±0.7从表中看出差异是显著的。我国一些学者也提出有关 FCM 诊断癌肿细胞的细胞标准，并已付之临床应用。

目前，对于癌症病人预后评估的主要依据是病理组织学分级和临床分期等指标，不少人已认识到用 FCM 来检测 DNA 是对肿瘤预后评价的一个较为客观有效的指标。总的倾向是：异倍体的出现是恶性肿瘤的一个标志；异倍体肿瘤的恶性程度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及近二倍体肿瘤预后较好。

在临床血液学方面的应用目前也以血液系统的肿瘤诊断、分型和预后关系等方面的应用为主；其主要技术途径也是基于对 DNA 倍体分析和细胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多叙。有关的技术细节 将在下节 以 FCM 在外周血白细胞的免疫组织化学分析方面的应用为例详加介绍。

（2）DNA 指数：由于 DNA 的非整倍体细胞是肿瘤的特异性标志已经得到肿瘤学界的公认，在些学者提出建议采用流式细胞术 DNA 分级指数（Flow cytometry DNA Crading Index, 简称 DNA 指数或 DI）表示 DNA 含量的异常程度。根据 1984 年国际分析细胞学会名词审定委员会的规定：

一般样品应采用同种或同个体的正常细胞为标准二倍体细胞。在血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体细胞。需要指出的是，在报告 DNA 的测定结果时必需包括 G /G1峰的变异和系数，即 C.V 值，若有多个 DNA 干系则要给出各个 G /G1峰的 C.V 值。用于肿瘤临床诊断的总体依据是：a. 正常二倍体的 DI=1.0，判断为阴性；b. 出现二个或多个可以分辨的 G /G1峰则可判断为阳性；c. 虽无明显的 G /G1峰的分化现象，但峰的 C.V 值较大，则可根据 DI 数个及其它有鉴别意义的征状给出参考性的诊断。

以上我们主要从 FCM 在生物医学工程学领域应用的基本原理和技术途径介绍了和组织化学有关的内容，至于一些技术细节 则在下节 做较为详细的说明。

第三节 FCM 对外周白细胞的免疫荧光分析外周血是临床检验中的重要标本。FCM 分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用 FCM 的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息，这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节 主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。

一、白细胞的免疫荧光标记技术1．白细胞抗原 下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表 10-2）。

表 10-2 WHO 对白细胞分化抗原的命名

抗原分子量单克隆抗体反应阳性细胞CD1P45/12Leu6,T6,OKT6胸腺细胞、朗格罕细胞CD2P50Leu5B,T11,OKT11 E 玫瑰花受体、T 和 NK 细胞CD3P19-29Leu4,T3,OKT8 T 细胞CD4P55Leu3,T4,OKT4协助—诱导 T 细胞，单核细胞CD5P67Leu1,T1, T101 T 细胞、B 细胞亚群，慢粒（淋巴性）CD6P120T12 T 细胞CD7P41Leu9.3AT，T—ALLa和 NK 细胞CD8P32-33Leu2,T6,OKT8抑制 - 细胞毒 T 细胞、NK 细胞CD9P24BA-2淋巴细胞白血病相关抗原CD10P100CALLA, J5粒细胞、前 B 白血病细胞CD11P170/95CR3/Leu15,OKM1单核细胞、粒细胞、NK 细胞MO1 T 细胞亚群（C3bi 受体）CD15LNFP-ILeuM1单核细胞、粒细胞、激活的 T 细胞CD16P50~70Leu11NK 细胞、粒细胞（IgGFc 受体）CD19P95Leu12,B4B、CLLb前 B -ALL 细胞CD20P35Leu16,B1 B 细胞CD21P140CR2,B7 B 细胞、C3 a 受体细胞CD22P135Leu41B、CLL、和毛细胞白血病细胞CD23P45Blast2CD24P45，P55BA-1B、CLL 和前 B -ALL 细胞CD25P65IL- 2 受体数分裂因子激活的 T 细胞 HTLV-I、II、感染细胞a：急性淋巴细胞性白血病；b：慢性淋巴细胞性白血病。

2．样品的制备 供 FCM 分析的样品是单细胞悬液，而且大部分样品都需经荧光染色。样品的制备方法大致有三种：①用荧光单克隆抗体染全血，随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色。

（1）全血染色后溶解红细胞：由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行，这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节 省时间。由于此法未将粒细胞去除，故在用 FCM 分析时，要注意排除粒细胞的干扰。

具体操作步骤如下：

①全血 100～150μl，放入 5ml 试管，并用 50～100μl PBS 稀释，总体积为 200μl。]

②荧光标记的单克隆抗体染色 30min，4℃（或放于冰上）。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大，但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用 10μl。注意蔽光。

③用 3～4μl 冷 BPS 清洗。离心 250×g（约每分钟 1500 转），5min，洗 3 次。注意每次用吸管将上清吸出，决不能倾倒去液！

④用 2ml 氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约 10min。若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

【氯化铵液的配制】

Tris—氯化铵 1×氯化铵

0.16mol/L NH4Cl 0.38g/100ml 90ml0.16mol/LNH4Cl

0.17mol/L Tris 2.06g/100ml 10ml0.17mol/l Tris

pH 值 7.56 pH 值 7.2

⑤红细胞被彻底溶解，加入 1mlPBS 稀释的 0.5% 甲醛，立即离心，洗 3 次，条件同步骤③。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染。

⑥将染色完成的细胞悬浮于 0.5～1ml 的 0.1% 甲醛溶液内。置 4 ℃，蔽光，等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便。

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感，溶解红细胞后，还要经过多个染色步骤，这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下：

①室温下放入 14ml 氯化铵在 15ml 的试管里。

②加入 0.5～1ml 全血，混合 3～5min。

③立即离心 100～150×g，并用 PBS 洗 2 次。

④白细胞计数，注意存活率应在 90% 以上。做成每毫升含 5×106白细胞悬浮液。将细胞分配到 5ml 的试管，每试管 0.2ml，即 1×106个细胞。

⑤荧光标记的单克隆抗体染色 30min，4℃，避光。抗体浓度配制如前所述。

⑥PBS 洗 3 次后，用 0.5% 甲醛固定。方法如前。

（3）用 Ficoll—Hypaque 梯度离心法分离出单个核细胞：用此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等。血液标本应有抗凝剂。取血到分离不能超过 6h。

①抗凝全血 4～20ml，用等量 PBS 或 Hanks 液稀释。

②稀释血 8 或 40ml 置于 15 或 50ml 离心管内，4 或 10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分离液，比重为 1.007）从离心管底部轻轻加入到血的下面。这种方法对血的扰动较小，比将全血加到 Ficoll 上面为好。加完后，可以清楚看到 Ficoll 与全血之间有一明显的分界线。注意在 Ficoll 快加完时应特别小心，否则有可能加入气泡搅混血样，使血与分离液混合，达不到分离的目的。

③离心 350～400g,30min。红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部，中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。

④取出中间层中所有细胞，若在 Ficoll 中还有细胞也要取出，这也是单个核细胞（PBMC）。

⑤用 PBS 洗 3 次，第 1 次清洗时，可用较快速 400×g 离心 10min。因为有可能中间层中混有一些 ficoll，比重增加而细胞不易沉降。

⑥PBMC 计数，注意存活率应高于 90%。配成 5×106个 /ml 的细胞悬浮液。

⑦取出 0.2ml 的悬浮液加入到 5ml 试管（内含 1×106细胞），用荧光标记的单克隆抗体染色，方法如前。洗 3 次后固定。注意必须先染色后固定，固定后的细胞膜通透性改变，会导致荧光标记的抗体进入细胞中去，而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。当用 FCM 分析时，则均为阳性而达不到检验目的。这也是用 FCM 分析的细胞存活率应高于 90% 的原因。

（4）荧光标记抗体的细胞染色：如前所述，FCM 分析被荧光标记的抗体染色的细胞，在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的 FCM 的激发光谱相匹配。一般各个公司所采用的绿色荧光染料为 FITC，而选用的红色荧光染料却不尽相同，有的用 TRITC，有的用藻红蛋白（PE），所需要的激发光谱就不一样，因而若因匹配不当则会招致荧光抗体所染的细胞分析不出来，这是应该注意的。

这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。下面仅说明一些具体的注意事项：

①在用间接法染色时，染色步骤依次为第一抗体→清洗→第二抗体→清洗→红细胞溶解。为了实验的方便，将第二抗体也配成每次实验用 10μl。

②双色法：双色法多用于直接染色法。将分别用 FITC 和 PE 标记的抗体各 10μl 置入同一个含有约 1×106/0.2ml 的试管内，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体，分别用红、绿荧光染料标记后，制成一种试剂。如 CD2—FITC/CD20—PE；CD4-FITC/CD8-PE 等。可按说明使用，具体用量为每次实验 10μl。

③对照组：众所周知，免疫组化的染色过程中，阴性和阳性对照是必不可少的。在准备用 FCM 分析的细胞时，对照标本的制备显得格外重要。因为一次用 FCM 分析的样品可能会很多，甚至多达上百个试管。对同一病人也可能会用到 20～30 个不同的单克隆抗体。每一个病人都要有相应的阴性对照。阴性对照主要用于仪器分析细胞之前，设立阴性和阳性的分界线。阳性对照主要用于检查染色方法。阳性对照细胞选自那些已知的细胞和已知的单克隆抗体中的阳性反应最明显者。阴性对照细胞有以下几种：

1）非染色细胞：直接染色法时，用 10μlPBS 代替与荧光结合的单克隆抗体，其它步骤相同。间接染色法时，分别用 10μl 的 PBS 代替第一抗体和荧光第二抗体，其它步骤相同。

2）使用非特异性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特异性的单克隆抗体。这是由于所使用的单克隆抗体来自小鼠，可能造成非特异性的假性反应，因此使用 MsIg 作为对照。同时还需要注意选择与实验用单克隆抗体亚类一致的 MsIg。如大部分单克隆抗体为 IgG1，也有部分抗体为 IgM，所以用 MsIg 作对照组时，往往使用 MsIgG 和 MsIgM 两种。直接染色法时，用 10μl 与荧光结合的 MsIg，代替荧光单克隆抗体。间接染色时，用 10μl 无荧光的 MsIg 代替第一抗体。其它步骤与实验组相同。

3）双染色对照：将各 10μl 的分别与红荧光染料和绿荧光染料结合的 MsIgg 或 MsIgM，加入到同一个试管，代替荧光的特异性单克隆抗体，其它步骤相同。

4）间接法对照：用 10μl 的 PBS 代替第一抗体。荧光第二抗体的浓度和使用量均与其它实验相同，其它实验步骤也和实验组相同。

二、白细胞免疫荧光分析的数据分析在仪器调试和校准及标本制备完毕之后，就要做测试和数据分析工作。这里先讨论一下有关数据测量和分析的技术问题，而一些医学应用的具体参数的测量和分析后面做介绍。

1.0。散射和 90。散射的双指标的二维图像分析可以把 0 。和 90。散射分别选作二维图像的 X 轴和 Y 轴指标。通过图中数据点分布把全血分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞几个亚群（图 10-9）。

图 10-9 人的外周血白细胞分群的二维点图

图中，A、B 图的淋巴细胞数大约有 6000～9000 个；C、D 图约有 2000～4000 个。分群编号依次表示：①红细胞、死细胞和渣滓；②淋巴细胞群；③大颗粒淋巴细胞；④单核细胞；⑤粒细胞。数据是对 1000 个细胞分析得到的。

若用单指标直方图，对 PBMC 而言，可以把淋巴细胞和单核细胞分开。见图 10-10 中的 A、B 图。但对红细胞溶解后的全血，单指标图分辨率则不够了（图 10-10 的 C、D 图），图 A、B 给出的是经 ficoll 后的 PBMC；图 C、D 给出的是人外周血白细胞。图中数字编号所代表的组分和图 10- 9 相同。

由上可见，在分析红细胞溶解后的全血时，必须先采用双指标二维点图。从图上也可清楚地看出，粒细胞、未被溶解的红细胞和一些渣滓，由于不同的体积和致密度，明显地区别于淋巴细胞和单核细胞从而能把它们分开。看到清楚的细胞分群以后，可以在计算机的显示屏上将所要分析的细胞画线框出，并通过指令送入存贮器，以后就可只对框出部分做各种数据分析和深入考查。图 10-11 就是对双指标点图上的淋巴细胞群框定的示意图。数字所表示的意思和图 10- 9 相同。

图 10-10 外周血白细胞及 PBMC 的单指标直方图

图 10-11 双指标点图上细胞的框定

2．单维直方图 上阴性分界游标设置前面已经强调，在用 FCM 分析时，阴性对照是必不可少的。首先用非染色细胞，根据前面介绍的双指标二维点图的办法，将某一细胞群框定；然后分别选用绿色荧光（GFL）和红色荧光（RFL）单指标直方图。在直方图上所出现的细胞均为阳性。可用改变 GFL 和 RFL 增益的办法，将细胞恰好调节 到左侧并设立游标（图 10-12）。

然后再测试 MsIg 染色的阴性对照。某些细胞，由于膜上的 Fc 受体可以与对照抗体鼠 Ig 非特异性结合，因而有一定的背景染色，不过这种阳性百分率不应超过 5%。所以 MsIg 与非染色细胞的分界游标确立后，以后所测试的标本以此为标准，游标位置基本不变。

图 10-12 阴阳性细胞分界游标的设置

MsIg 的红、绿荧光阴阳性分界游标确立以后，可以测试实验标本。首先检查细胞分群情况，然后检查淋巴细胞群是否落在已输入计算机的淋巴细胞框定的范围里。若染色及 FCM 的工作性能都正常，则框定的位置不会改变。然后转换成荧光直方图。若为 FITC 标记的细胞，则 GFL 为 X 轴；若为 PE 标记的细胞，则用 RFL 为 X 轴。由于阴阳性分界游标记已确立，细胞阳性率及图像均显示于计算机荧光屏上；同时也可选用其它指标和图像、打印所需的资料等。

3．双染色分析游标设立和荧光校正

（1）游标的设立：游标设立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成。分别选用 GFL 和 RFL 为 X 和 Y 轴。先用不染色细胞测试，将阴性细胞集中在左下角（图 10-13）。分别为 X、Y 轴设立游标，再用 MsIg 的阴性对照测试。可将 X、Y 轴游标略为移动，使位于窗“3”内的细胞（阴性）在 95% 以上。

（2）红、绿荧光的校正：由于红色荧光探测器在最佳测试状态时，会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长较长。若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分 GRL，就会大大地降低 RFL 探测器的灵敏度。因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正，在 RFL 中适当扣除 GRL 的影响。

通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见，图 10-14 给出 CD11-PE（T 细胞、RFL）及 CD8-FITC（T 抑制细胞，GFL）双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图。X 轴为 GFL，Y 轴为 RFL，由 X 轴 Y 轴游标划分的四个窗的阴阳性和图 10-13 相同。各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比。图 A 表示未经校正时的情形。窗“2”内 31.46% 表示双阳性细胞，即在 T 细胞中 31.46% 为抑制细胞毒细胞。经过适当校正，可见有两群阳性双标记细胞出现（B 图）。高强度部分为真正的 CD8、CD11双标记阳性细胞；低强度部分属于 CD8绿色阳性细胞（NK 细胞）。此时“2”窗中细胞份额减为 7.59%。需要指出的是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少（图 C）。

图 10-13 双染色二维点图上游标的设置

1 区：红色荧光阳性；2 区：红、绿荧光均为阳性；3 区：阴性细胞：4 区：绿色荧光阳性细胞

图 10-14 双染色在二维等高图上荧光校正

双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电倍增管 PMT1有信号输出外，另一光电倍增管 PMT2也常会有微弱输出。调节 补偿器使 PMT2的输出为 0；然后再测另一种波长的荧光染料，调 PMT1的补偿器使之输出也为 0；然后再测另一种波长的荧光的染料，调 PMT1的补偿器使之输出也为 0：如此反复调节，使两种荧光的探测器都获得补偿。实际调节 时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子。利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。需要指出的是：当 PMT 高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时，都要对荧光校正做重新补偿调节。

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义淋巴细胞由于表面特异性抗原的差异可分为四大类（表 10-3），这些不同抗原表现型的亚群执行不同的机能。而且某些疾病会选择性地损伤某些亚群而造成亚群之间的比例失调。根据 FCM 双荧光分析的结果，现将不同的抗原和不同的机能的淋巴细胞亚群列于表 10-4。

表 10-13 主要淋巴细胞亚群的表面抗原

细胞表面抗原的类型抗原表现的细胞 T 协助、诱导细胞 T 抑制、T 细胞毒细胞NK 细胞 B 细胞独特的CD3（Leu4）++--CD4（Leu3）+---CD8（Leu2）-+-/+-CD16（Leu11）--+-CD19（Leu12）---+限制性的Leu7-/+-/++/--Leu8+/-+/--/++/-CD7（Leu9）+/-++/--CD11（Leu15CR3）-/+-/++-+：表现的抗原；-：未表现的抗原；+/-：主要亚群有表现的抗原；-/+：抗原仅表现于少数亚群。

表 10-14 淋巴细胞机能性亚群

细胞群细胞机能测试的单克隆抗体 T 细胞协助细胞Leu3+8–抑制细胞—诱导细胞Leu3+8+细胞毒细胞Leu2+15–抑制细胞Leu2+15–抑制作用抑制—诱导细胞Leu3+8+抑制 – 增强细胞Leu2+8–抑制—增强细胞（激活）Leu2+8–DR+抑制—效应细胞Leu2+8+15+组织相容限制的细胞毒性细胞第一类限制性Leu2+15–DR–(7+?)第二类限制性Leu3+第二类反应性Leu2+非组织相容性限制的细胞毒细胞NK 亚群Leu7+11+15+Leu7–11+15+Leu7–11+DR+ B 细胞Leu12+14+16+DR+CR2+k+或 λ +亚群Leu12+1+Leu12+1–外周血白细胞的机能，特别是淋巴细胞的机能状态在一定程度上反应了机体的免疫机能。近几年来，用 FCM 来测定某些疾病的淋巴细胞及其亚群已成为重要的诊断和预后判断的指标，如对骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的诊断和对免疫缺陷病的估价等。测定淋巴细胞亚群的主要依据是在于淋巴细胞表面不同的抗原表现型，而这些表现型又依赖于相应的单克隆抗体而被识别。所以，特异性很高的单克隆抗体结合先进的 FCM，已为临床提供了不少非常有用而重要的资料，但被 FCM 所分析的淋巴细胞的整个临床意义尚未完全认识清楚。随着更多确定淋巴细胞表现型的试剂的应用，FCM 对诊断和治疗计划的拟定以及预后的估计将会表现出更重要的实用意义。

1．T 淋巴细胞亚群的测定 如前所述，在使用 FCM 分析时，先用 0 。散射和 90。光散射双指标将白细胞分为三群：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。在二维点图上划出淋巴细胞群范围后，设立 GFL 的 RFL 单指标的直方图。命电子计算机仅计数所输入的淋巴细胞，即划线框出的那部分细胞。一般计数输入的细胞可设 1000～5000 个。直方图的分析可显示阳性细胞的百分率。应用输入细胞数、阳性细胞百分数以及白细胞分类计数，就能得到阳性细胞的绝对值，即每立方毫米血液中的绝对值。有时 T 淋巴细胞某亚群的绝对值比百分率更为重要，因为它可以表明 T 细胞某亚群的增高和减少。当然，淋巴细胞占白细胞的百分数也是一个重要数据，应当准确测出。

CD4/CD8细胞的比值，有时也用于反映病人淋巴系统的机能状态。不少临床免疫实验室已把 CD4/CD8的值作为常规血检查的项目。在国际上，淋巴细胞亚群以及 CD4/CD8并未建立统一数值，各实验室均需建立自己的标准。平均值一般为 1.73～2.00。

一般而言，影响淋巴细胞亚群的因素较多，如年龄、性别、种族、以及外周围环境如季节、药品等的影响。T 细胞的绝对值在儿童略高于成人。婴儿 CD4细胞的百分率较成年人高；老年人的 CD8略低。正常人在一昼夜内也有周期性的波动：上午 CD4略低，下午 4 时之后开始增加，直至次晨，平均波动为 15%～20%。尽管正常情况下淋巴细胞亚群有所变动，但仍属正常范围。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴细胞肿瘤，其淋巴细胞亚群及其比值测量结果均可能偏离正常范围。

有工作报道，传统的 T 辅助诱导细胞（CD4+）具有抑制机能，而在 T 抑制细胞毒细胞（CD4+）中，有些又具有协助的功能。因此，对原来设想的 CD4、CD8的机能分群有所混淆。预计会有新的单克隆抗体再从 CD4和 CD8的细胞中分出。不过就目前看来，不少临床免疫实验室已用 CD4/CD8比值结合淋巴细胞绝对值对多种疾病的诊断、治疗和预后的估计提供了不少有价值的资料。

2．艾滋病以及 HLTV—III 感染 艾滋病是一种由人类 T 淋巴细胞病毒（HLTV–III）感染而造成的疾病。这种病毒主要侵袭 CD4+ T 细胞，而导致 CD4淋巴细胞减少，CD4/CD8淋巴细胞比值下降，甚至可低到 0.5 以下。艾滋病多发生在同性恋性行为活跃的男性，这可能与多次重复感染 HLTV-III 有关。对异性性行为活跃的人来讲，对 HLTV—IIi 感染的机会也不容忽视。另一种感染的途径是 HLTV 血清阳性的献血者对受血者的感染。有部分人血液中 T 淋巴细胞减少，CD4/CD8比值下降，但 HTLV 血清反应不一定就是阳性。有些人 CD4减少不明显，但 CD8有所增加，也会导致 CD4/CD8的的比值下降。

对可疑为艾滋病及血清检验为阳性的人，T 细胞亚群是分析了解免疫系统被病毒破坏程度的标志。初诊时，CD4细胞越少，CD4/CD8值越低者，预后越差。所以经治疗后恢复的指标则是 CD4细胞数增加，CD4/CD8比值升高。用荧光标记双染色的 FCM 分析的结果表明，艾滋病人除 CD4和 CD8的改变外，同时还可以表现出 OKT10阳性细胞增多（图 10-15）。病人表现为 CD8和 OKT10同时增加时，预后比 OKT10阳性细胞低的病情严重。

图 10-15 健康人艾滋病人淋巴细胞表面抗原的比较

艾滋病人 Leu3+、Leu8–和 Leu3+、Leu8+细胞均减少，而 Leu2+、Leu8–细胞相应增加，

Leu2+、Leu7+与 Leu23+、Leu10+细胞明显增加

3．白血病和淋巴瘤的表现型 近年来，为了弄清这些肿瘤的病理组织形态、影响治疗效果的原因与免疫状态的相互关系，对于不同类型的白血病和淋巴瘤作为广泛的细胞表面表现型的研究。

在诊断方面，FCM 与单克隆抗体结合，可以弄清这些肿瘤的免疫起源，特别是分清 B 细胞性、T 细胞性或骨髓性肿瘤。同时，还可以证实一些与细胞起源相关的抗原，如普通急性淋巴细胞性白血病抗原（CALLA、CD10）。另外，可以用适当的试剂从反应免疫过程中来证实单克隆的肿瘤细胞的增殖。

大部分淋巴系统肿瘤均起源于 B 细胞。而 B 细胞肿瘤常用抗免疫球蛋白的抗体来证实。由于前 B 细胞与浆细胞表面均无免疫蛋白，所以用检测免疫球蛋白的办法就只能证实 B 细胞发育中间时期的肿瘤。目前，已有一系列的 B 细胞表面抗原被发现，而可以证实 B 细胞个体发育的各个时期的肿瘤。

对 B 细胞肿瘤最有价值的抗原是 CALLA。这种抗原仅存在于 B 细胞正常以育期的前 B 细胞、早期 B 细胞以及 80%～90% 的急性淋巴细胞性白血病。因此，抗 CALLA 抗体可以区别淋巴细胞性和髓性白血病。用抗 CALLA 结合其它一些成熟 B 细胞的单克隆抗体，如 CD19，CD20，CD24（B4，B1，BA-1）将能证实大部分 B 细胞来源的肿瘤。图 10-16 给出了 B 细胞分化的各个时期细胞膜的表现型。来源于 B 细胞的肿瘤和正常 B 细胞的表现型相似，也就是说，B 细胞前身、成熟 B 细胞及最后分化为分泌 B 细胞—浆细胞。

图 10-16 B 细胞分化各时期的细胞膜表现型

由于 T 淋巴细胞来源的肿瘤浸润性较强，预后较差，并需要多种治疗。T 细胞肿瘤的表现型千变万化，但大部分均表现 T 细胞抗原 CD7（Leu9,3A）或其它 T 细胞抗原 CD2、CD5（OKT11，OKT1）。这些抗原与肿瘤的细胞成熟时间有关，因而有助于拟定治疗方案。从 FCM 分析的结果表明，非成熟的 T 细胞肿瘤常表现非成熟的 T 细胞抗原，如 CD1和 t 10。而成熟的 T 细胞肿瘤则仅表现成熟 T 细胞抗原：CD2、CD3、CD5和 CD7。有时也可表现 CD2、CD8，但不会出现在同一个细胞上面。

由于肿瘤细胞的多种来源，很难避免在肿瘤标本中混杂正常细胞，这给 FCM 的分析带来技术上的困难。如残留的红细胞在 FCM 分析时，落入淋巴细胞框定的范围内而造成淋巴细胞各种亚群百分率下降。所以在制备标本时，应尽量想法去除红细胞。另一种污染是正常细胞存在于肿瘤细胞之间，这是一个很头痛的问题。例如骨髓常被外周血污染，反应性的正常淋巴细胞渗入到肿瘤组织中等，因此估计污染程度对解释 FCM 分析的资料有一定的意义。因为在 FCM 分析时，正常细胞与肿瘤细胞可能由于不同的体积和密度而被分开，根据对污染的估计，仔细分析图像就能得到比较正确的结果。

4．FCM 对正常 B 细胞和 B 细胞肿瘤 分析 FCM 对正常 B 细胞和 B 细胞肿瘤的分析在免疫学研究和临床诊断上有着重要的实用价值，B 细胞的某些特征必须使用 FCM 来分析，但是这在 FCM 技术方法中仍存在着一些需要解决的问题。

（1）B 细胞的标记：B 细胞膜表现免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟 B 细胞。最早的 B 细胞前身，细胞质内含有免疫球蛋白 M（IgM），但不存在于细胞膜表面。细胞质内 IgM 的证实以及同时测定细胞表面的 SIg，对 FCM 是很困难的，当然今后可能会用双染法来解决这样的难题。大部分成熟 B 细胞具有 SIgM 和 SIgD，少量具有 SIgG 和 SIgA，当然这也可能是因为不同的亚群的缘故。但仅以 Ig 的重链来分类 B 细胞是不可靠的，因为 B 细胞可以从膜表面的 IgM 逐渐转变成 IgG，因而从重链着手无法把 B 细胞分类。大部分 B 细胞肿瘤也表现出带有 SIgM 和 SigD。随着 B 细胞逐渐转变成浆细胞，膜表面 Ig 逐渐丧失，在细胞质内又出现大量的免疫球蛋白。

与重链相反，B 细胞的整个发生期只有一种 k 或者 λ 轻链，B 细胞肿瘤克隆仅表现一种轻链，因此通过在 FCM 上显示的不平衡的轻链表现可以确定 B 细胞肿瘤。测定方法见（3）。

用 SIg 的最大缺点是它的“嗜细胞性”，因为正常 B 细胞、自然杀伤细胞（NK）、激活 T 细胞以及所有巨噬细胞均有 Fc 段受体，因而可以不同程度地与抗 SIg 单克隆抗体的 Fc 段结合而产生非特异性的结果，因此选择抗体时，应使用已被胃蛋白酶消化过的、Fc 段也被去除的、仅留下来的 F（ab’）2。

（2）FCM 测定 B 细胞的临床指证：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或获得性的。低丙种球蛋白白血症和无丙种球蛋白白血症常伴有免疫球蛋白分泌的紊乱，因此有必要分析 B 细胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80% 来源于 B 细胞。因而一旦怀疑为淋巴瘤，就应仔细用 FCM 对 B 细胞的表现型进行分析，可以分析血、骨髓、以及活检淋巴结等。首先确定肿瘤细胞的来源：B 细胞性（CD20+，SIg+）或 T 细胞性（CD3+）。也有可能某些淋巴病来源于单核细胞（CD11+）成裸细胞而表现出非 T 非 B。一旦确立为 B 细胞来源后，就应更进一步分析克隆增殖的性质：单克隆、少克隆、或是多克降珠。单克隆性的增殖往往是肿瘤的标志。可以用 SIg 的轻链和重链分别加以测试，往往轻链比重链更有价值。在不久的将来，或许可以直接用免疫球蛋白的基本加以鉴别。

对 B 细胞亚群的确定，目前并未定论，但某些 B 细胞被 CD5（T1，OKT1）染色。正常 B 细胞中这些细胞较少，而多见于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷时期。在 B 细胞的肿瘤病人中，10% 的也可以出现 CD20（B1）阴性反应，这是 B 细胞成熟而将分化为浆细胞的标志。在异常 B 细胞上，往往有一些 B 细胞的标记缺失或其它表现型出现，因而对异常 B 细胞的 FCM 的分析尤为重要。图 10-17 显示 CD19—FITc（B 细胞）和 CD5-PE（T 细胞）双染色的假三维图像分析。X 轴为绿色荧光的 Leu12(B 细胞)，Y 轴为红色荧光的 PE—Leu1(T 细胞)。从图中可见，有较多的细胞表现出 Leu12+tLeu1+, 阴性区内为 NK 细胞和红细胞等。

图 10-17 异常 B 细胞双染色的假三维图

（3）k- λ 测定 B 细胞克隆：k、λ 测定法是一种从正常 B 细胞中测定少量 B 细胞克隆生长的方法。其基本原理是：若有 B 细胞克隆存在，将改变某一种轻链（k 或 λ）的荧光强度的分布。若轻链为 k 的 B 细胞生长，则抗 k 的抗体能测试出这种变化，而抗 λ 的抗体的测试没有任何改变。正常情况下，B 细胞的 k 和 λ 的荧光强度分布是一致的（见图 10-18）。

图 10-18 k- λ 克隆的测定

正常情况，B 细胞轻链分布图像，一致 κ 和 λ 的波形没有区别。但在异常时，若有单克隆生长，κ 链有分布则与 λ 不一致，在总和的曲线形态上也会产生差异。

在实际应用中，血液、体液、组织细胞的悬浮液效果均较好，而对于骨髓，大量细胞的非特异性标记会影响测定的结果。这里面必须强调，正常 B 细胞中的克隆细胞生长并不意味着它们必然是肿瘤细胞，还必须结合其它指标再做结论。不过这种方法对确定肿瘤细胞的存在、细胞发育阶段、以及经治疗后病情控制的状况等，都可以提供一些有用的资料。

以上仅限于从外周血的白细胞分析这一侧面介绍了 FCM 的某些疾病中的临床应用。其实，它也仅只是问题的一个部分。例如，有研究工作表明：CD34抗原在由红系、巨核系、粒系和巨噬细胞三个细胞成株单元组成的成株细胞中有所表现。CD34+细胞在人的骨髓细胞中约占 1～4%，而在外周血中却探测不到。又如，NK 细胞近来被认为可能和人类的某些疾病的发病机理有关，对 NK 细胞的测量可以作为免疫治疗的免疫监测的重要参数和有效的预后征状的指示。以前是用放射性的51Cr 的释放来检测 NK 敏感的靶细胞的毒理学活性从而评估 NK 的功能的，而采用荧光探针 CFDA（car-boxy—fluorescein diacetate）标记则可用 FCM 技术更为安全可靠地进行测定。有报告指出，健康男人的数值为（67.1±22.7%）%，健康女人为（63.9±20.0%）；患有妇科癌肿病人则为（38.5±23.1）%, 明显偏低。这些工作表明，FCM 的技术从免疫组织化学角度还会有所发展。在第二节 我们曾简单介绍了流式细胞分析技术在生物医学工程中应用的一些技术途径，这也可以启发我们借助于 FCM 来提高免疫组织化学的分析能力。可以预见，FCM 一定会成为免疫组织化学的一项重要的技术工具，并将在医学科研和临床应用中发挥更大的作用。

附【美国 Becton –Dickinson 公司可提供的 FCM 标准】荧光微球（Fluorescent beads）；鸡红细胞核（Chicken erythrocyte nu-clei）和小牛胸腺细胞核（Calf thymocyte nuclei），用于 DNA 测量的质量控制；单克隆抗体试剂；以及用于免疫表型（immunopheno-typing）和其它临床应用的药盒。

参考文献1．Holm DM, et al. An improved flow microfluoremeter for rapid measurement of cell fluorescence.Exp. Cell . Res. , 1973；80：105

2.Steinkamp JA, et al.Multiparameter analysis and sorting of mammalian cells . Exp . Cell Res. , 1974；84：15～32

3.Steen HB, et al. Differentialof light-scattering detection in arc—lamp –illumination flow cytometry.Cytometry, 1985；6(3)：273～275

4.Loken MR, et al. Flow cytometryas an analyticaal preparetive tool in immunology. J. Immunol. Methods., 1982；50(3)：85～112

5.Smart YC, et al. Flowcytometric ceumeration of absolute lymphocyte number in peripheral blood usingtwo parameters of light scatter. Cy-tometry, 1985；6(2)：172～174

6.Dvaies EG, et al. Lymphocytesubpopulations in primary immunodeficience disorders. Arch . Dis. Child. , 1983；58：346～351

7.Campbell A, et al. Lymphocytesubpopulations in the blood of newborn infants. Clin. Exp . Immunol. ,1974；18：469～482

8.Shackney SE. The use of flowcytometry in the diagnosis and biological characterization of the nonHodgkin’slymphomas. Ann . NY. Acad. Sci., 1986；486：171～177

9. Foucar K, et al. Flowcytometry in lymphoma. Am. J. Surg. Pathol., 1986；10(8)：584～585

10.Hoffonan RA, et al.Immunofluorescent analysis of blood cells by flow cytometry. Int. J.Immuno—Pharmacol, 1981；3(3)：249～254

11.Fahey JL, et al. Quantitativechanges in T—helpper or T—suppressor /cytotoxic lymphocyte subsets that distinguishacquired immune defi-ciency syndrome from other immunesubset disorders. Am. J. Med., 1984；76：95～100

12. Eichner RD, et al.LAV/HTLV-III plays a dominant role in the etiology of AIDS. AIDS RES., 1984；1(4)：237～241

13. Smith BR, et al. Circulationmonoclonal B lymphocytes in non—Hodgkin’s lymphoma. J. Med., 1984；311：1476～81

14. Committee on Human LeukocyteDifferentiation Antigens, IUIS-WHo Nomenclature Subcommittee. DifferentiationHuman. Leukocyte Antigens：a proposednomenclature. Immunol. Today, 1984；5：158～159

15.Cleary ML, et al.Immunoglobulin gene rearrangements as a diagnositic criterion of B celllymphomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984；81：593～597

16. Weinberg DS, et al.Cytofluorometric detection of B cell clonalexcess：a new approachto the diagnosis of B cell lymphoma. Blood, 1984；63：1080～1087

17. Gray JW, et al. Cell cycleanalysis using flow cytometry. Int. J. Radian . Biol., 49(2)：237～255

18.Marti GE, et al. Normal humanblood density gradient lymphocyte subset analysis. An interlaboratory flowcytometric comparison of 85 nor-mal adults.Am.J. Jematol., 1985；20(1)：41～52

19. Levy EM, et al. Defective Tcell differentiation in acquired immunedefecience syndrome (AIDS).J. Clin.Immunol., 1986；77(6)：1756～1761

20. Schjnitzer B, et al. Americanadult T cell leukemja/lymphoma：aflowcytometric and morphological study. Ann . NY. Acad. Sci. 1986；486：256～267

21. Van dilla MA, et al. (eds)flow Cytometry：Instrument and Data Analysis. London：Academic Press, 1985

22. Melamed MR, et al, (eds) flowCytometry and sorting . 2nd ed . New York：John Wiley& Sons, 1990

23. Iwao Nishiya et al, (eds)flow cytometry and Image Analysis for clinical applications, Excerpta Medica.Netherlands, 1991

24．宋平根，等. 流式细胞术的原理和应用. 北京：北京师范大学出版社,1992

第十一章 免疫细胞化学在神经科学中的应用免疫细胞化学的发展对许多领域的研究起到很大的推动作用，在神经科学的研究中尤为突出。本章 仅就免疫细胞化学在神经科学的基础研究方面的应用做一简要介绍。

一、确定神经递质的性质、定性和分布早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作，但由于技术方法的限制，对神经递质的性质无法确定。1949 年 Koelle 建立了胆碱酯酶染色法（cholinesterase staining method, ChE）1964Rh，Karnovsky 和 Roots 在此基础上改良并建立了一步完成的乙酰胆碱酯酶（Acetycholinesterase,AChE）直接染色法，使显示胆碱能神经成为可能。从生物测定来看，AchE 和胆碱能神经的标志酶存在平行关系。因此，一般认为，在加用乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况下，用 Ache 显示胆碱能神经，仍不失为一种简便易行、可信的技术方法。但必须指出的是，一些接受胆碱能神经支配的细胞（称为胆碱能敏感细胞）和一些非神经细胞（如红细胞和骨骼肌）也可呈 AchE 阳性反应，甚至中枢神经系统内去甲肾上腺素（NA）能神经元集中的部位—蓝斑也呈现 AchE 阳性反应。因此，AchE 阳性反应的不能就简单地确定为胆碱能神经元或神经。

50 年代，Eranko 就已发现用甲醛水溶液可使肾上腺髓质内含 NA 的神经细胞发生荧光。瑞典的 Falck 和 Hillarp（1962）在此基础上改良并建立了用冷冻干燥和甲醛蒸汽诱发荧光，1974 年 Lindvall 和 Bjorklund（1974）和 de la Torre 等（1976）相继建立和改良了乙醛酸诱发荧光法，开展了荧光组织化学的新篇章；为研究单胺类神经递质的定位和分布提供了手段。

70 年代以来，免疫细胞化学技术的应用，使我们在对上述经典神经递质研究的基础上又迈进了一大步。与上述方法相比，免疫细胞化学技术具有较高的敏感性和特异性，例如应用胆碱能神经元的标志酶—胆碱乙酰移换酶（Choline acetylase, ChAc）的单克隆抗体就能较 AChE 法更准确地确定胆大能神经元，同样，应用多巴胺羟化酶（DβH）抗血清能较甲醛或乙醛酸诱发荧光法更为准确地研究 NA 神经元及其通路，而且不需借助显微分光光度计测定各种单胺递质呈现荧光的不同波长加以区别，免疫细胞化学应用不同的标志酶免疫染色就可区别各种神经元和 / 或确定神经元内所含的不同的神经递质。如 DβH 免疫反应阳性在哺乳动物即可做为 NA 能神经元的标志，因为哺乳动物不存在其它合成 NA 的酶，所有合成 NA 的部位均有 DβH。酪氨酸羟化酶（TH）和多巴脱羧酶（DDC）阳性表示多巴胺（DA）能神经元系统，而 TH，DDC，DβH 和苯乙醇胺位甲基移酶（PNMT）免疫反应阳性即为肾上腺素（E）能神经元系统。

借助免疫细胞化学技术，至目前为止，还发现了有 40 种以上的神经肽分布于中枢神经、下丘脑、垂体、松果体、脊髓、神经节 及外周神经系统特定的神经元中。在脊椎动物，这些肽类物质在体内的分布呈多位性，不局限于神经组织或神经内分泌系统，如原先在脑或下丘脑、垂体中提取的神经肽如脑啡肽（ENK）、生长抑素（SOM）和血管活性肠肽（VIP）等也存在于消化道的内分泌细胞和壁内神经丛中，反之，一系列先从胃肠道分离的肽类激素如胆囊收缩素（CCK）、P 物质（SP）等也在神经组织中发现，如 CCK 在人和猪大脑皮质含量非常丰富，达 11nmol/ 每克脑组织，P 物质在脑中 30 处以上的地方存在，这些多肽被称之为脑肠肽（brain gut peptides）。在外周器官如消化道、呼吸道中的肽类物质统称为调节 肽（regulatory peptide），包括存在于消化道与呼吸道等器官内分泌细胞内的多肽（在消化道又称胃肠激素）和存在于器官壁内神经丛中的神经肽。虽然神经肽，包括脑肠肽在机体中的确切生理作用还有待研究，是作为神经递质、神经调制物（neuromodulator）或神经激素（neurohormone）或二者兼而有之，还存在争论。但免疫细胞化学在神经科学中的应用已为我们开辟了一个新的研究领域，它确定在机体中除传统的胆碱能神经和肾上腺素能神经以外还存在第三上分枝—非肾上腺素能非胆碱能神经（non—adrener-gic non –cholinergic nerves, NANC）。Bloom 等认为这第三种神经成分其末梢释放的递质是多肽类物质，又称肽能神经（Peptidergic nerves）。研究结果表明，机体全身的各个器官内都有不同种类和不同数量的肽能神经分布。在大鼠和丘脑下部、杏仁复合体，延脑内一些神经核和脊髓后角内均有较多的肽能神经元和纤维，小脑内仅有散在的肽能神经纤维，而大脑皮质内多数神经肽缺如，仅发现有 CCK、SOM 和 VIP 等数种。在消化道，存在一个壁内神经系统，Langley 称为胃肠神经系统（Enteric Nenvous System），现已发现其中含有 VIP、SP、ENK、SOM 等 20 余种神经肽，其它各脏器中也都有肽能神经分布。

参考文献1．Abney ER, et al. Astrocytesependymal cells and oilgodendrocytes develop on schedule in dissociated cellcultures of embryonic rat brain. Dev Biol, 1981；83：301

2.Andrzejloeschand Burnstock G. Ultrasturctural identification of VIP-containing never fibresin the myenteric plexus of the rat ileum. J Neurocytol, 1985；14：327

3.BaumgartenHG. et al. Auerbach’s plexus of mammal and man：electron microscopic identification of threetypes of neuronal processes in myenteric ganglia of the large intestine fromrhesus mondeys, guineapigs and man. Z Zellforsch, 1970；106：376

4.BishopAE, et al. Peptidergic nerves. (Basic Science in Gastroenterology,Structure of the Gut, Eds Polak JM, Bloom SR, Wright NA and Daly, MI) , PP ,221Were Herst. UK Glaxo Group Research Limited, 1982

5.Cook RDand Burnstock G. The ultrastructure of Auerbach’s plexus in the guinea-pig. I.Neuronal elements. J Neurocytol , 1976；5：171

6.EpsteinLM, et al. Deyelopment of serotonergic neurons in the chick duodenum. DevelBiol, 1980；77：22

7.FriedG, et al. Evidence for differential localization of noradrenaline andneuropeptide Y in neuronal storage vesicles isolated from rat vas deferens. TheJ Neuroscience, 1985；5(2)：450

8.HokfeltT, et al. In：Neural peptides and Neuronal communications, Eds：Costa E and Trabucchi M. PP. 1～23, 1980

9.KarnovsdyMJ and Roots L. A“direct-colouring”thiocholine method for cholinesterase. JHistochem CYtochem, 1964；12：219

10.Lindvall O and Bjorklund A. The glyoylic acid fluorescence histochemical method：a detailed account on themethodology for the visualization of central catecholamine neurons.Histochemistry, 1974；39：2>7

11.Larsson LI, et al. Localization of vasoactive intestinal polyptide (VIP) tocentral and peripheral neurons. Proc of the National Academy of Sciences USA,1976；78：3197

12.Larsson LI, et al. Occurence of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-likeimmunoactivity in certain cholinergic neurons of the cat：evi-dence from combined immunocytochemistry andacetylcholinesterase stainin.Neuroscience, 1979；4：1539

13.MantyhP and Hunt SP. Neuropeptides are present in projection neurons at all levels invisceral and taste pathways；from periphery sensory to cortex. Brain Ros,1984；299：297

14.Marangos PJ, et al. Developmental profile of neuronspecific (NSE)and non-neuronal enolase(NNE). Brain REs. 1980；190：185

15.Mirsky R et al. Myelin –Specific proteins and glyclipids in rat Schwann cellsand oligodendrocytes in culture, J Cell Biol,1980；84：483

16.Probert L, et al. Ultrasturctural localization of four different neuropeptideswithin separate populations of P-type nerves in the guinea-pig colon.Gastroenterology, 1983；85：1094

17. PolakJM and Bloom SR. Regulatory peptides of the gastrointestinal and respiratorytracts. Arch Int Pharmacol, 1986；280(suppl)：16

18.Schwartz JP and Costa E，Hybridization approaches to the study ofneuropeptides. Ann Rev Neurosci, 1986；9：277

19.Sterit WJ and Krewtzberg W. Lectin bining by resting and reactive microglia.Neurocytol, 1987；16：249

20. 朱长庚. 免疫细胞化学在神经科学研究中的应用. 解剖学杂志,1986；9(1)：68

21. 杨恬蔡文琴. 人胚胎期小肠六种肽能神经发生的研究. 解剖学报.1994(25)：84

22. 韩济生, 主编. 神经科学纲要. 北京医科大学、北京协和医科大学联合出版社,1993

二、探查和发现新的神经递质免疫细胞化学可作为组织探针（Histological probe），不断探查和发现新的神经递质。除上述的乙酰胆碱及其合成酶、肾上腺素及其合成酶、活性多肽以外，还可用以确定其它的疑义神经递质（Neurotransmitter chemical suspect）的性质和分布，包括 5—HT 及其有关酶类、γ—氨基丁酸（GABA）、甘氨酸、天门冬氨酸和牛磺酸等。

近年来，重组 DNA 工程与免疫细胞相结合而发展起来的原位杂交免疫细胞化学（In situhybridizationImmunocytochemistry）作为组织探针，在发现神经系统特有的蛋白质和肽类方面。具有更高的特异性和灵敏性。重组 DNA 工程系列用制备的脑的多聚腺苷酸的 mRNA，反转录为互补 DNa（cDNA），克隆后与组织切片中的 mRNA 杂交，再按其 cDNA 核苷酸顺序推断出氨基酸顺序合成新的多肽，以此作为抗原，制备抗血清进行免疫细胞化学的研究，以发现新的神经肽。原位杂交免疫细胞化学技术，简言之，就是利用放射性同位素（或生物素）标记的 cDNA 片段与组织或细胞中特异的 mRNA 进行杂交来观察 mRNA 在体内的分布（详第二十章）。发展这项技术，对发现神经系统特有的蛋白质或肽类，具有极大的潜力，如脑内特有的 mRNA 有 30000 种，目前已知的数 10 种神经肽仅占其中的一小部分。

三、追踪神经束的行径及其投射区免疫细胞化学技术的引入，使神经解剖学追踪神经束的行径及其投射区的研究方法从单纯的采用损毁核团或压榨、切断神经不引起溃变，然后用镀银或其它染色法观察溃变的神经细胞体和末梢这一传统的技术中解脱出来。与 70 年代的 HRP 技术和放射性自显影术相比，免疫细胞化学技术不但能追踪神经束的行径及其投射区，而且可以定性，确定神经细胞核团或神经束所含神经递质的种类。量单纯用免疫组化染色在连续切片上追踪，常不能获满意结果，因为神经组织的多肽含量较低，在免疫组化染色的连续切片追踪过程中常有丢失的可能。故现在普遍采用的是免疫细胞化学技术与其它技术相结合的“杂交技术”，如与 HRP、荧光物和放射自显影技术等相结合的逆行或顺行标记法、与 AChe 和单胺荧光组织化学技术相结合的多重染色法等。Westlund1983 年应用 DβH 抗血清注入脊髓，经轴浆运输到胞体，证明脑桥的 NA 能神经细胞群是脊髓内 NA 能神经纤维和终末的唯一来源。利用免疫荧光与荧光素进行标记相结合的方法，Mathy 和 Hunt 查清了过去一直了解得不太清楚的内脏感觉和味觉的传入径路，证明在内脏感觉和味觉由周围感受器传导至感觉皮质，中继部位在延髓的孤束核，脑桥的解剖学工作者还发现用麦胚凝集素（WGA）或霍乱毒素（Cholera Toxin）结合的 HRP（CT—HRp），在神经束行径追踪方面，较游离的 HRP 灵敏数 10 乃至 100 倍以上，因为结合的 HRP 是通过受体介导而被神经元摄入的。万选才等的研究工作表明 CT-HRP 较之单纯的 HRP 在显示树突终末状结构方面有很高的灵敏性。结合 HRP 的优点可归结为四点：①灵敏度高；②剂量低微；③充分、恒定地显示轴突、树突顺行（离胞体）标记；④降解时间长。以古老的切断神经或损毁神经细胞核团的研究方法与免疫细胞化学技术相结合以追踪神经细胞的起源仍在沿用，如 Hokfelt 在研究小肠 SOM 免疫反应性神经的来源时发现，切除肠系膜神经后，小肠 SOM 免疫反应性神经减少，而结扎肠系膜神经后 DβH 和 SOM 免疫反应物在结扎的神经近端聚集，说明小肠的 DβH 和 SOM 主要是通过肠系膜神经传运来肠壁的。也可采用化学神经阻断剂如 6—羟多巴胺（6–OHDA）、红辣椒素（Capsaicin）等代替手术切断，与免疫细胞化学技术结合应用探寻神经束的行径和反射。

总之，免疫免疫化学技术的应用，使能在中枢较前更迅速、准确地显示了一些神经束的行径、神经细胞核团的定位和定性以及外周器官神经纤维的来源等。

四、区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞免疫细胞化学的发展进一步揭示了神经组织成分的特殊化学性质，利用这些特征不仅能区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞，而且可进一步区分不同的神经胶质细胞。S—100 是一种从脑组织提取出来的酶性蛋白，是钙结合蛋白的一种，它主要存在于神经胶质细胞、周围神经的雪旺氏细胞、交感神经节 中的卫星细胞和肠肌间神经丛的肠胶质细胞（Entericglial cell）。S—100 也可用于人类肿瘤组织发生的分类，如星形胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤雪旺氏细胞瘤显示 S—100 免疫反应阳性而脑膜瘤和髓母细胞瘤为阴性反应。神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific Enolase, NSE）是从脑组织分离出的一种酸性可溶性蛋白，是烯醇酶的同工酶之一。NSE 是神经元特异性蛋白质，存在于神经细胞和 APUD 系统的神经内分泌细胞中，可作为神经元和神经内分泌细胞的标志酶，在星形胶质细胞瘤、脑室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤和雪旺氏细胞瘤中，NSE 呈免疫反应阴性，而神经母细胞瘤为 NSe 免疫反应阳性。皮肤的 Marker 细胞，细胞学分类归属不明，经 NSE 免疫染色反应呈阳性结果，结合电镜观察证明在该类细胞中含有致密核心的大囊泡，属 APUD 系统的神经内分泌细胞。在 APUD 系统的其它细胞如垂体前叶中肽类细胞、肾上腺髓质细胞等以及 APUD 瘤中，NSE 均呈阳性反应。NSE 又是神经元分化的标志酶，可以用以研究体内、外神经元的分化发育过程。

近来，免疫细胞化学工作者又利用各种细胞中所含中间丝提纯制成特异性的单克隆抗体血清用于细胞学归属和病理学的检测。这些中间丝包括：①上皮细胞或上皮源细胞中的前角质蛋白（Prekeratin）或称细胞角质蛋白（cytokeratin）；②心肌、平滑肌或骨骼肌细胞中的结蛋白（Desmin）；③间质细胞或间充质细胞中的波形微丝（Vimentin）；④神经胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillory Acidic Protein,GFAP）；⑤神经细胞中的神经微丝（Neurofilament, NF）等（详见第十二章）。实验证明，GFAP 是星形胶质细胞特异性标志蛋白，具有星形胶质细胞分化潜能的肿瘤如髓母细胞瘤也含有 GFAP，而少突胶质细胞和小胶质细胞呈阴性反应。肠道肌间神经丝内胶质细胞原来细胞学分类归类不明，经 GFAP 染色呈阳性反应，说明其中与中枢星形胶质细胞属于同一细胞学范畴。O1—O4抗原和半乳糖脑苷脂（Galactocerebroside）只存在于少突胶质细胞，griffonia simplicifloia 凝集素仅对小胶质细胞呈阳性反应（小胶质细胞膜上有 2—d –半乳糖）。据此，可区分不同类型的神经胶质细胞。

总之，免疫细胞化学技术的发展，解决了过去依赖 Nissl、Cajal 和 Golgi 等传统的神经组织染色法所不能完全解决的问题。进一步揭示了神经细胞的特殊化学性质，现在神经组织内已证实的物质包括蛋白质、肽类、酶类、神经递质和胺等不下 50 余种，其中神经系统的特异性蛋白质有 20 余种，与神经元有关的除 NSE 外，还有神经微丝蛋白，微管蛋白，碱性蛋白（只存在于大脑神经元内的一种组蛋白）和只存在于嗅球神经元中的嗅球蛋白等；与神经胶质有关的有：神经收缩蛋白、小泡蛋白、突触蛋白（Synaptin）、GP350 和 D 1、D2、D3等，为进一步研究神经细胞、神经胶质细胞、神经内分泌细胞及其结构成分提供了有力的手段。

五、研究神经递质的超威结构定位应用免疫电子显微镜技术（常用为 PAP 法或胶体金标记技术）可显示抗原在神经细胞内的超威结构定位及在突触水平神经元间的联系的化学本质。Pickel 应用免疫电镜观察证明 TH 存在于 DA 和 DA 能神经元的细胞体、树突和近侧轴突。在胞体内此酶定位于内质网、Golgi 器和微管上。神经终末枝的突触小泡一般认为是神经递质的亚细胞贮存部位，在电镜下观察神经末梢内突触小泡呈现不同形态，目前已有文献报道的近 10 余种，比较常见的为无颗粒小泡型（Small agranular vesicles , SAV）或称清亮小泡型（SmallClear Vesicles, SCV），其直径 50～90nm，中心无颗粒（图 11-1E）；该型常混有不同比例含致密核心的大囊泡，直径 80～150nm。其次是颗粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV），直径 45～70nm，内含有电子密度高的致密核心（图 11-1A）。第三是大颗粒泡型（large granular vesicles, LGV），直径 80～160nm 的突触小泡内含有电子密度高的致密核心（图 11-1B）。其它还有扁平囊泡型、线粒体型等（图 11-1）。是否不同形态的突触小泡代表了含有不同种类的神经递质尚有争论。有学者认为不同形态的突触小泡只是使用不同种类固定液的人工假象，然而越来越多的实验证明表明，固定液的种类固然有一定影响，但神经终末突触小泡的形态和内含递质的种类似乎存在一定的相关性，SAV 型是取得比较一致意见的神经终末类型，它和骨骼肌运动终板（也是神经—肌肉的突触）内所含突触小泡的形态相一致，后者已证明为乙酰胆碱神经递质的贮存处，细胞化学示 Ach 阳性反应，电刺激时突触小泡减少，示释放现象。这种类型的突触小泡内可能含有乙酰胆碱。

图 11-1 神经末梢突触中囊泡类型

SGV 型一般认为是单胺介质的贮存部位，单胺类介质。包括儿茶酚胺和吲胺二种，属于前者的介质有去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、属于后者的介质为 5—HT。在常规电镜生物样品处理的过程中，小颗粒囊泡不易显示，须应用 0.1mol/ L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）配制的 3% 高锰酸钾溶液（Richardson1966）或铬酸盐 / 重铬酸盐溶液（Tranzer 1976）固定，方能获得满意结果。认为 SGV 是单胺递质贮存部位的根据是：用利血平注射能使小泡内致密核心消失，而用伪介质（Pseudo—neurotransmitter）如 5 - 羟多巴胺（5—OHDA）注射动物，由于伪介质能置换内源性单胺而被吸收和贮存于突触囊泡中，末梢中小颗粒囊泡的数目增加，电刺激交感神经可使小颗粒囊泡减少，而将 α 甲基去甲肾上腺素给予被拟交感神经药物或被电刺激耗竭了介质的动物，其神经末梢中的小颗粒囊泡又可重新出现。但 1982 年 Wilson 等应用多种实验证明，至少在小肠肌间神经丛内，肾上腺素能神经的终末支是扁平无颗粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV），而不是 SGV 型。1965 年 Taxi 在两栖类动物的肠道中发现含大颗粒囊泡的神经终末支 LGV，Baumgarten(1970)在哺乳动物肠道也发现了 LGV 型神经终末支，因其形态与丘脑下部含肽的神经末支相似，故命名为 P 型神经终末支，意即肽能神经（Peptidergic nerves）终末支，而有作者认为凡是颗粒囊泡，包括 SGV 和 LGV 都是单胺类递质的贮存部位。免疫电镜技术部分地解决了这一争论。应用 PAP 和胶体金免疫电镜技术证明 VIP、SP、降钙基团相关肽（CGRP）和神经肽 Y（NPY）等多肽类物质确实定位于大颗粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probertet al, 1983）。有作者还认为不同种类的多肽分别被包含于不同直径的大颗粒囊泡中，如 SP 定位于直径 85nm 的大颗粒囊泡中；VIP：囊泡直径 98nm；ENK：囊泡直径 110nm 等，但不同作者在不同动物种属和不同组织、应用方法不同报告结果各异，难以结论。Fried（1985）应用免疫组化、电镜技术和密度梯度离心法相结合，证明在大鼠输精管神经终末支小颗粒囊泡中含有 NA，而大颗粒囊泡分为三种类型：单纯含 NPY 或 NA，或 NA 与 NPY 共存于一个囊泡中。Burnstock 还提出直径 100～200nm 的大的不透明囊泡（LOV 型）系嘌呤能神经递质的贮存部位（图 11-1，G），神经终末支内全为线粒体所充满的可能属感觉神经终末支（图 11-1，H）。凡此种种，都说明虽然免疫电镜提供了神经递质超微结构水平定位定性的可能，但神经终末内突触小泡的形态与神经递质种类之间的关系始终还有待于进一步的研究。如 SAV 型在外周可能是代表胆碱能神经的终末支，在中枢能否说 SAV 内所含的都是乙酰胆碱，其它各型的突触小泡内所含神经递质的种类也还需要进一步研究。在技术方法上的运用，根据笔者体会，应用免疫电镜 PAP 法，免疫反应复合物相当大，有时很难准确地判断免疫反应复合物的定位，因在囊泡基质内和囊泡膜上雹有反应物附着，免疫胶体金电镜技术避免了上述缺点，胶体金颗粒的沉积比较集中于囊泡基质内，在递质超微结构定位的研究上似较 PAP 法优越。

六、神经递质共存的研究免疫细胞化学在神经科学的运用打破了传统的一个神经细胞只产生和释放一种神经递质的概念。在中枢和周围神经系统，近年来，有较多的实验报告证明在一个神经细胞内存在两种或两种以上的递质，这种递质共存不是偶然和个别的现象，而是一种带普遍规律的问题。在光镜水平显示神经细胞内两种抗原的共存，其分辨率只限于胞体，观察神经纤维内两种抗原的共存，必须借助免疫电镜技术。共存情况可出现于：（1）经典神经递质间，如在大鼠颈上交感神经节 的相邻照片上，同一神经细胞分别显示 NA 和 ACh 阳性；（2）经典递质与单胺类递质间，如在松果体交感神经末梢中，不仅含有 NA，而且含有 5—HT；（3）经典递质和神经肽间，如在大鼠的椎前神经节 中，大约有 60% 的 NA 能神经细胞同时显示 SOM 免疫反应阳性，说明 SOM 与 NA 的共存，在交感神经系统中 NPY 与 NA 的共存，在副交感神经系统中 VIP 与 ACh 的共存，已得到较为普遍的证实；（4）单胺类递质与神经肽的共存，如大鼠输精管的交感神经终末支中 NA 与 NPY 的共存，在豚鼠肠道肌间神经节 中 5—HT 与 SP 免疫反应物共存一个神经细胞内，和（5）神经肽间的共存，如 SP 与 CGRP 常共存于感觉神经终末支，Gibbins 等（1987）在豚鼠背根神经节 细胞中证明 SP、CGRP、CCK 和强啡肽（Dynorphin，DYN）四种神经肽的共存。对于神经递质共存的亚细胞部位，Hokfelt 曾对肽和胺的共存提出了一种假说，即：①它们可分别贮存于同一神经终末内的不同形态的突触小泡内；②共存于大颗粒囊泡和小颗粒囊泡内；③仅共存于小颗粒囊泡中；④仅共存于大颗粒囊泡内；此假说尚待进一步证实。Fried 的实验结果表明，在大鼠输精管，胺和肽的共存仅发生于大颗粒囊泡内，Andrzejloesch 和 Burnstock 实验证明在豚鼠肠道肌间神经丛内 VIP 和 ACh 共存于 SAV 小囊泡内。应用胶体金免疫电镜技术，以不同直径的金粒标记不同的抗原，是研究递质共存的超微结构定位较为理想的手段。

关于递质共存的生理意义，目前还不十分清楚，有作者设想与经典递质共存的肽类可作为辅递质，在神经细胞释放时，对突触后膜上主递质的受体起调制作用，从而调制信息传递。Hokfelt（1980）提出两种递质共存的生理意义有以下五种可能性：①两种递质可穿过突触间隙作用于突触后细胞，作用于相同或不同的受体；②一种物质激活突触后细胞的受体，另一种物质则封闭另一种类型的受体，如在 5—HT 和 SP 共存的情况下，5—HT 直接抑制突触后细胞，SP 封闭其它末梢释放的 ACh 对突触后的细胞的兴奋作用；③一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于突触前末梢的自身受体（autoreceptor），从而调制细胞终末对神经递质的释放；④一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于其它末梢上的突触前受体；⑤一种物质作用于一类细胞，另一种物质作用于另一种细胞，在这方面典型的例子是汗腺，汗腺的交感神经元内含有 VIP 和 ACh，前者作用于周围小血管，增加血流量；后者作用于腺体，刺激汗腺分泌。

总之，递质共存的研究是神经科学领域中一个崭新的课题，它的研究对进一步了解复杂的神经系统的结构和功能有重要意义，而在这项课题的研究中，免疫细胞化学（包括光镜和电镜）无疑是一项有力的工具。

七、个体和种族发育的研究神经系统是一个历史发展的产物，有种族发育和个体发育的历史。在种系发生方面，有不同的发育规律，如一些神经肽自腔肠动物已经发生，而 VIP 自鱼类才开始发生。免疫反应的强弱和神经肽的含量亦因种属不同而异，如笔者对输精管的神经支配的研究表明，在大鼠、豚鼠和猫等动物，输精管管壁内有丰富的神经分布，而在人输精管神经分布异常稀疏。研究神经肽的发生可以帮助了解肽类的发生规律，有利于选择和建立实验动物模型。个体发育，不但指胚胎发育，也指动物出生后发育以至衰老的规律，神经系统的任何一个部分都可以从发育的角度去研究。在肠道，Epstein 等在鸡小肠壁内神经丛的研究表明，在鸡胚发育的第 7 日出现胆碱能神经成分，5～7 天出现 5—Ht 神经细胞，NA 神经终末出现于第 12～16 日，神经肽出现在这些递质之后。在小鼠、豚鼠和兔小肠壁内神经从发育规律的研究报告和鸡相似。神经肽的出现较晚，而神经对肌肉发育的作用更晚，如在豚鼠小肠，虽然在胚胎第 25 日出现了胆碱能神经细胞，但肌肉对神经的反应性出现在胚胎的第 48 日。各种神经肽的含量和含肽类神经细胞的数目都随发育、成长、衰老而产生规律性变化，如大鼠全脑或脑各分区中 NSE 的含量随发育而增高，在第 13 天胚胎时 NSE 含量为 50ng/mg 蛋白质，到成体（第 40 日）时为 11000ng/mg 蛋白质，而定位于神经胶质的非神经无烯醇酶（No-neuronal enolase, NNE），在第 11 日的胚胎为 8500ng/mg 蛋白质，出生后下降至 5000ng/mg 蛋白质，到成体（第 60 日）时为 11000ng/mg 蛋白质。以上结果表明，随着神经细胞的产生，NSE 增加，而 NSE/NNE 比例显著增高，说明在大鼠脑神经元的分化过程中可能存在着由 NNE 转变为 NSE 的生物化学分子变化。杨恬、蔡文琴等（1994）报告了六种肽能神经在人胚胎期的发育规律，AChE 神经出现最早，其它肽能神经出现时间不一，分别在第 11～16 周。同一个体不同器官肽能神经并非同时发生，如膀胱肽能神经出现较小肠为晚。总之，神经系统种族发育和个体发育这个领域的研究还有待于进一步发掘。

八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究神经组织培养是从机体中取出组织或细胞，在模拟机体内生理条件下进行体外培养。免疫细胞化学技术可用于培养的单个细胞或组织片染色，单个细胞可直接固定或冰冻后进行免疫染色，而组织片在固定或冰冻后常需进行切片后染色。由于体外神经组织培养技术能使复杂的神经系统简单化，换而言之，能在神经系统的结构与功能的研究方面提供一个简单的模型，近年来，随着培养技术的发展和与其它科学的相互结合，在神经生物学这一研究领域中提供了不少的新资料，如利用免疫细胞化学技术可对原代分离培养的神经细胞和神经胶质细胞进行细胞的特异抗原标记（可以是细胞表面或细胞质内成分），从而区别其细胞类型，如用 GFAP 标记星形胶质细胞、半乳糖脑苷脂、髓磷脂碱基蛋白（myelin basic protein, MBP）标记少突胶质细胞、NSE 标记神经细胞、Ran- α 标记胶质细胞表面的抗原等，这些特异的标记在神经生物学和临床科研中有很大潜能，细胞表面标记能够区别活细胞，精确地研究细胞间特性和相互作用，细胞内标记能有助于对神经细胞结构、功能及相互作用的研究。Mirsky 及其同事们利用半乳糖脑苷脂（GC）、硫脂（Sulphatide, S）和 MBP 对培养的雪旺氏神经胶质细胞和少突胶质细胞的研究表明，雪旺氏神经胶质细胞在与其所依附的轴突分离后不超过 5～6 天，GC、S 和 MBP 的免疫染色均为阴性，表明雪旺氏细胞需要持续性地从相应的轴索获得信息 (Signal) 才能制造出可为免疫染色所检测出的髓鞘特异性糖脂和蛋白，而少突胶质细胞则否，在没有神经细胞存在的情况下培养数周，仍保持 GC、S 和 MBP 免疫反应阳性。本实验结果成功地证明少突胶质细胞和雪旺氏神经胶质细胞产生髓鞘的方式是不同的。Abney 等利用培养的胚胎和新生大鼠的脑细胞混悬液进行特异性免疫标记染色，证实了不同类型细胞在脑内的发育顺序：破伤风毒素阳性神经细胞出现在第 10 天的胚鼠脑（测试的最早时间），GFAP 阳性星状胶质细胞出现在 15～16 天的胚脑，而 GC 阳性少突胶质细胞直至出生后 2～3 天方才出现。利用 18 天胚鼠的小肠壁内神经丛培养后进行各种神经肽的免疫染色，Schultzberg 等发现在这时的小肠壁内神经丛已具有内源性的 VIP、SP、ENK 和 SOM 免疫反应性神经元。

九、应用于受体的研究由于免疫细胞化学所应用的各种标记物如铁蛋白、胶体金和荧光素等都能无例外地与配体（即与受体呈特异结合的物质）相结合，因此可应用于细胞表面（包括神经细胞和神经胶质细胞）表面受体的定位。Philips 和 Bennet（1987）应用抗肌球蛋白和荧光素标记的 α - 眼镜蛇毒素成功地显示了乙酰胆碱受体（Acetycholine receptor clusters）在鸟肌上的发育规律。近年来，应用免疫细胞化学技术进行受体再循环的免疫电镜观察，取得了令人瞩目的进展。Geueze 利用胶体金 - 蛋白 A - 抗唾液酸糖蛋白的受体抗体在免疫电镜下观察证明，配体与细胞表面的相应受体结合后，由受体介导入肠作用而进入胞内，在入胞早期，唾液腺糖蛋白及其受体均存在于有覆衣囊泡中，并与囊泡内表面密切结合。在人胞囊泡内，则见配体游离于囊泡腔中，内移的受体可再循环回细胞表面加以利用。本实验结果为细胞膜受体的再循环提供了有力的证据。

十、神经系统的机能研究免疫细胞化学在神经科学的应用已由单纯的形态学研究逐步向与机能研究、应用研究和临床实践相结合。如研究脑啡肽与镇痛的关系，SP 与转导伤害性刺激的关系以及在各种生理和病理条件下神经肽的变化与病理生理作用机制的关系等。在研究方法上也不断改进，如免疫组化的定量研究由简单的积分法逐步走向与放射免疫测定相结合、与图像分析相结合，测定单位面积内和 / 或每个神经细胞内免疫反应物含量的变化。

第十二章 肿瘤免疫细胞化学第一节 神经肿瘤免疫细胞化学在神经系统肿瘤中，以胶质瘤最多见，次为脑膜瘤、神经鞘膜瘤和垂体腺瘤，再次为孤立性神经纤维瘤、神经纤维瘤病、丛状神经纤维瘤、节 细胞瘤、节 细胞神经母细胞瘤、神经母细胞瘤以及转移瘤等，其余各类肿瘤均属少见。这些肿瘤，一般情况下，应用 H·E 染色，在光镜下便可作出病理诊断。但是，有时对其细胞起源、细胞学类型、分化程度，特别是各肿瘤间的鉴别，诊断相当困难。近 10 多年以来，免疫细胞化学的兴起，尤其是 PAP、ABC、ABPAP、免疫金银等灵敏性高的染色法，加上特异性很强的单克隆抗体的问世，使得常规石蜡切片可以被用作免疫细胞化学染色，从而开辟了免疫细胞化学在神经肿瘤领域里广泛应用的新途径，往日的一些难题有些已获得解决，有些正在深入研究并积累了经验。

肿瘤组织可产生多种多样的抗原，通过这些抗原成分可以识别各种肿瘤，迄今在石蜡切片上具有诊断价值的抗原已经有 100 多种，在神经肿瘤诊断和研究中具有重要价值的，有下述几种，它们可作为标记物供检测和研究应用。

一、细胞骨架中的中间丝蛋白在细胞骨架中有三种结构，即微管（microtubules,MT）、微丝（microfilaments,MF）和直径介于上二者之间的中间丝（intermediate Filaments, IF）。各种细胞的 IF 都具有相同的结构和不溶于水的特性，但可根据其组织学分布、生物化学和免疫学特性，将其分为五种类型，即细胞角蛋白细丝（cytokeratin filaments, Ckfilaments）、波形细丝（Vimentin filaments）、结蛋白细丝（desmin fila-ments）、胶质细丝（glial filaments, GF）、神经细丝（neurofilaments NF），它们分别由细胞角蛋白（CK）、波形细丝蛋白、结蛋白、胶质细丝酸性蛋白和神经细丝蛋白构成。上述五型 IF 蛋白在组织学分布上具有一定的特性。这种特异性是各种组织在胚胎发育过程中获得并一直维持下来的，即使在肿瘤中瘤细胞仍能基本保持其起源细胞的 IF 类型，故 IF 蛋白的免疫组化定位有助于确定肿瘤组织的起源。对神经肿瘤具有诊断和鉴别诊断价值的主要有以下二种：

（一）神经细丝酸性蛋白神经细丝酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）可从正常人脑及病人脑中分离获得，含有丰富的天门冬氨酸和谷氨酸，分子量 47000 道尔顿。早期，Emg 与 Bigbee 报道，GFAP 抗体在星形神经胶质细胞及其肿瘤内呈特异性地定位，其它胶质成分、神经元及其肿瘤均不着色。后来，人们发现，GFAP 不仅在星形神经胶质细胞及其肿瘤中存在，还见于各类型的星形细胞、混合性胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、室管膜瘤、室管膜下巨细胞性星形细胞瘤、含胶质成分的髓母细胞瘤和神经鞘瘤等肿瘤中。目前，人们认为，GFAP 在神经肿瘤诊断和研究中的价值在于：①GFAP 能确定肿瘤的胶质性质，特别是星形胶质细胞的起源，能清楚显示在 H·E 染色下难以辨认的混合性胶质瘤中的星形胶质成分，确定原始神经肿瘤的胶质分化，以及与转移瘤、脑膜瘤的鉴别。②GFAP 与星形细胞瘤的分化程度相关，可根据免疫组化着色的程度评价肿瘤的恶性程度和细胞分化程度，为临床提供治疗和预后的参考。

GFAP 在星形细胞瘤显示两种染色类型，一种是泡浆和细胞突起的弥漫性着色，主要见于分化好的星形细胞瘤，例如，纤维性星形细胞瘤和肥胖细胞性星形细胞瘤；另一种是胶质网的着色，在分化好的和间变性星形细胞瘤以及多形性胶质母细胞瘤中都可见到。在分化好的星形细胞瘤，阳性细胞多且免疫组化染色深；在间变性星形细胞瘤，阳性细胞少且染色浅；在肥胖细胞性星形细胞中，胞浆丰富的大瘤细胞阳性，小瘤细胞阴性。

GFAP 在少枝胶质细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、松果体实质细胞瘤、脑膜瘤和脑膜肉瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤及黑色素瘤等为阴性。在室管膜瘤的报道中，各家说法不一，有阳性也有阴性的报道。这种情况可能与室管膜上皮的类型不同有关。一种室管膜上皮是立方形，数量多，胞浆中有 8～10nm 的中间丝，与星形细胞的不同，GFAP 阴性；另一种室管膜上皮是伸张状细胞，数量少，散在于立方形细胞之间，GFAP 阳性染色。上述二种上皮可各自形成室管膜瘤，GFAP 染色各异。

（二）神经细丝神经细丝（neurofilaments, NF）分布于神经原细胞体和轴突、树突，副交感神经节，肾上腺内外嗜铬组织等，因此，节 神经瘤、肾上腺内或外神经母细胞瘤、小脑神经母细胞瘤、副节 神经瘤均呈 NF 阳性反应，并且，分化较好的肿瘤的 NF 阳性瘤细胞数量要比分化差的多，在儿童的未分化神经母细胞瘤常呈弱阳性反应。NF 免疫细胞化学染色有助于神经系统肿瘤的鉴别诊断和预后估计，特别在骨转移性神经母细胞瘤与原发性淋巴瘤及尤文氏瘤鉴别诊断中，前者阳性而后二者均为阴性，甚有作用。

二、神经特异性烯醇化酶烯醇化酶是糖酵解过程中催化 2—磷酸甘油酸与磷酸烯醇式丙酮酸互相转化的水解酶。已知烯醇化酶有多个同工酶，它们是三个基因位点的产物，由 α、β 和 γ 三种免疫学上不同的亚单位所组成的二聚体，αα、ββ 和 γγ 三种为纯合的烯醇化酶，还有 αγ 和 αβ 二种杂合的烯醇化酶。神经烯酶化醇主要是 γγ 型，其次是 αγ 型。以前认为只存在于神经元，故命名为神经元特异性烯醇酶（neuron-specific enolase, NSE），出已证明，除神经元外，它们亦存在于神经纤维和神经内分泌细胞（APUD 细胞），表现为细胞浆阳性染色。在星形胶质细胞瘤、脑室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤、脑膜瘤和雪旺氏细胞瘤中，NSE 染色为阴性。

对 NSE 的保存，福尔马林固定的组织免疫组化反应较弱，而苦味酸、多聚甲醛溶液反应良好。

三、S—100 蛋白1965 年，Moor 从牛脑浸液中分离出一种高度酸性钙结合蛋白，富含苯丙氨酸，分子量 21kD，它在中性饱和硫酸铵溶液中 100% 溶解而命名为 S—100 蛋白（S—100protein）。早期，人们认为 S—100 蛋白是一种神经系统特异性蛋白，存在于胶质细胞和雪旺氏细胞以及它们的肿瘤中，后来的研究工作证明 S—100 蛋白也存在于一些非神经源性的正常细胞和肿瘤中。在福尔马林固定、石蜡包埋组织中，S—100 蛋白保存良好，可用兔抗牛 S—100 蛋白抗血清进行染色，阳性细胞表现为胞浆或同时伴有细胞核弥漫性着色。S—100 蛋白染色强度与瘤细胞的分化程度关系不大。

在中枢神经系统，S—100 蛋白广泛分布于星形细胞、少枝胶质细胞、室管膜细胞及其起源的肿瘤中。连锦英等对 122 例颅内肿瘤作了 S—100 蛋白和 GFAP 分布的研究，发现 S—100 蛋白在各类型星形细胞瘤、混合性胶质瘤全部阳性，大多数少枝胶质细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤和室管膜瘤阳性，绝大多数髓母细胞瘤中可见少量 S—100 蛋白阳性细胞。在部分脑膜瘤、颅咽管瘤、听神经瘤、血管母细胞瘤等亦可见 S—100 蛋白阳性。S—100 蛋白有助于脉络从乳头状癌与转移性乳头状癌的区别，前者 S—100 蛋白阳性，后者为阴性。

在周围神经系统，S—100 蛋白广泛分布于神经嵴起源的雪旺氏细胞及其肿瘤中。在神经鞘肿瘤和各种神经纤维瘤中，良性神经鞘瘤 S—100 蛋白含量最高，阳性细胞多，染色也强，An-toni A 区的瘤细胞中 S—100 蛋白呈均匀地分布于胞浆和核内，而 Antoni B 区的瘤细胞排列疏松，S—100 蛋白染色不规则，纤维化区缺乏 S—100 蛋白；神经纤维瘤中可见 S—100 蛋白阳性和阴性两种细胞，显示它们的来源可能不同，前者可能是雪旺氏细胞，后者可能是来源于神经周膜和神经内膜细胞。大部分神经源性肉瘤含有 S—100 蛋白，显示来自于雪旺氏细胞。这些肿瘤对 S—100 蛋白的反应一般比良性者弱，而且，在高度间变的肿瘤，由于瘤细胞的反向分化，常丧失合成 S—100 蛋白的能力。

在神经肿瘤诊断和研究中，除上述三种常用标记物外，还有一些标记物可供选择或配合应用：①谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS），其组织中分布与 GFAP 相同；②髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP），用于少枝胶质细胞、雪旺氏细胞及其肿瘤检测，特别对恶性神经鞘瘤诊断有意义；③髓鞘相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein,MAG），可用于少枝胶质细胞、雪旺氏细胞及其肿瘤检测，但与多种肿瘤出现交叉反应；④少枝胶质细胞表面抗原，共有 4 个亚型，O1和 O 2出现在少枝胶质细胞及其肿瘤不成熟或分化低时，O3和 O 4出现于成熟或分化高时，等。

对某种类型的肿瘤来说，不是所有的这种肿瘤都表达相同的抗原；同样，对某一个肿瘤来说，也不是所有的肿瘤都有一样的抗原，因此，在神经肿瘤诊断上，二种以上标记物的联合应用比用单一标记物更为可靠。

第二节 神经内分泌肿瘤免疫细胞化学人体存在两种形式分布的内分泌细胞，一种是内分泌细胞群集形成内分泌器官，如垂体等，另一种是内分泌细胞单个散在于其它组织细胞之间，形成弥散的内分泌系统（diffuse en-docrine system）。通过免疫细胞化学方法及超威结构观察，人们对内分泌细胞的分布形态与功能等不断有新的发现。1968 年，Pearse 观察到体内一些分泌肽类物质的细胞具有共的细胞化学特性，即具有摄取胺前体、脱去其羧基变为活性胺的能力（amine precursior uptake and decar-boxylation）而命名为 APUD 细胞，把这些细胞归属为 APUD 系统。现在，这上概念已扩展为体内分泌肽类和 / 或胺类活性物质的内分泌细胞的总称，所分泌的活性物质作为激素、神经递质而发挥作用；已知 APUD 系统的细胞有 40 多种，已确定的肽类产物有 30 多种。近年的研究表明，APUD 细胞与下丘脑的一些神经内分泌细胞很相似，因此，提出弥散内分泌细胞、APUD 细胞、神经内分泌细胞实际上同一类细胞，弥散分布、具有带膜的胞浆分泌颗粒以及分泌胺类和 / 或肽类激素是它们的共同特点。有人提出，一切摄取胺前体脱羧细胞都是神经外胚叶起源，但也有人对此持不同意见。事实上，若干肽类激素如生长激素抑制素即可在胃肠和胰腺内生成，也可在中枢神经系统内生成；而神经元的标志酶，即神经元特异性烯醇化酶（NSE），也可在肽激素生成性 APUD 细胞浆内检出，这些共性使人们将 APUD 系统归入神经内分泌系统的概念内。

APUD 细胞或神经内分泌细胞发生的肿瘤称为 APUD 肿瘤（apudoma）或神经内分泌肿瘤，此类肿瘤包括肠胃道类癌、胰腺内分泌肿瘤、支气管类癌和一些肺小细胞未分化癌、甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤以及垂体腺瘤，最近还不断提出一些新的肿瘤，如食管、宫颈、前列腺等部位的“小细胞”嗜银癌、子宫内膜“小细胞未分化型 APUD 瘤”、喉部“神经内分泌癌”、皮肤“神经内分泌癌”（Meckel 细胞癌）等。这一类肿瘤在功能和形态上，有以下共同特点：①具有内分泌功能，患者血中可出现肿瘤分泌产物，如胃泌素、嗜铬粒蛋白（chromogranin）等，临床上也可表现相关症状；②肿瘤组织可提取相应的激素类物质，免疫细胞化学染色呈特异性阳性反应；③肿瘤细胞在电镜下可见其有被膜的神经分泌颗粒。以上这些特点可作为诊断神经内分泌肿瘤（A-PUD 肿瘤）的依据。

神经内分泌肿瘤中，有的不伴有内分泌症状，此称无功能性肿瘤，但也有可能是这种肿瘤分泌产物量很少，不足以产生临床表现的内分泌症状；有的则伴有内分泌症状，临床表现取决于激素的性质。这些肿瘤中有的肿瘤分泌所在器官正常产生的激素，称为正内分泌瘤，如胰腺的胰岛素瘤；有的肿瘤则分泌非所在器官正常产生的激素，称为异内分泌瘤，如胰腺的胃泌素瘤。此外，尚有一种肿瘤内可含几种不同的细胞、分泌多种激素以及几个内分泌肿瘤可以在不同器官内同时存在等情况。

应用免疫细胞化学方法研究神经内分泌肿瘤，将进一步更新我们对这些肿瘤的经典概念，使我们能够从组织学角度准确地判断肿瘤细胞的分化程度及生物学行为。例如，过去应用常规组织学方法很难判断未发生转移的胰腺内分泌瘤的生物学行为，而今已证实，恶性功能性胰岛素瘤都含有与糖蛋白激素共同的 α 链，可应用免疫细胞化学方法加以检测，证实其良、恶性质。下面，我们介绍几种常见的神经内分泌肿瘤，及其免疫细胞化学和电镜的特点。

一、生体腺瘤应用免疫细胞化学方法，按照肿瘤细胞内定位的垂体激素种类，垂体腺瘤可分为以下几种：

（一）生长激素腺瘤

可分为颗粒密集型及颗粒疏松型两种。

1．颗粒密集型临床上这类肿瘤伴有肢端肥大症。免疫细胞化学染色可见胞浆中有生长激素阳性反应物质。电镜下，这类瘤细胞胞浆内分泌颗粒数量多，球形，外周有界膜，直径 300～500nm。

2．颗粒疏松型临床上也伴有肢端肥大症。免疫细胞化学染色可见胞浆中有斑点状的生长激素阳性反应物质。电镜下，瘤细胞胞浆内可见分泌颗粒，但数量少，直径大多约 100～250nm。

（二）催乳激素腺瘤

也有两型。

1．颗粒密集型电镜下，分泌颗粒数量较多，体积大，直径可达 1200nm。免疫细胞化学染色可见催乳激素在瘤细胞胞浆中呈明显阳性反应。

2．颗粒疏松型免疫细胞化学染色可能出现两种情况，一是在瘤细胞胞浆内发现催乳激素呈阳性反应，二是呈阴性反应。出现阴性反应的原因，可能是激素产生后不经过储存即直接排出细胞外。电镜下，分泌颗粒数量少，体积小，平均直径 250nm。

（三）促甲状腺激素瘤

甚为少见，约占 1%，常发生于长期甲状腺功能低下的病人，由于缺乏甲状腺素，通过负反馈作用刺激其细胞增生。光镜下常为嫌色性细胞腺瘤，胞浆含少量 PAS 阳性物质。电镜下分泌颗粒稀疏。

（四）促肾上腺皮质激素腺瘤

此瘤能合成促肾上腺皮质激素（ACTH）和其它肽类如内啡肽等，可引起 Cushing 病。免疫细胞化学染色可证明瘤细胞胞浆中含有 ACTH 等。电镜下除见分泌颗粒（大小约为 250～270nm）外，ACTH 瘤细胞中往往可观察到平行排列的微纤维束，用免疫细胞化学染色可证实其属于细胞角蛋白，而与 ACTH 无关。

（五）促性腺激素腺瘤

多见于老年人。腺瘤合成卵泡刺激素或卵泡刺激素及黄体生成素，很少单纯合成黄体生成素。免疫细胞化学显示卵泡刺激素或 / 和黄体生成素阳性反应。

（六）多种激素性腺瘤

此瘤可合成一种以上的激素，如生长激素和促甲状腺激素、催乳激素和促甲状腺激素、生长激素、催乳激素和促甲状腺激素等，免疫细胞化学观察可见各相关阳性细胞。

（七）无功能活性腺瘤

多见于中老年人，一般不伴有特殊症状。免疫细胞化学显示多数细胞激素为阴性，少数腺瘤细胞可含有卵泡刺激素、生长激素及 ACTH 等。电镜下，分泌颗粒稀疏，大小为 100～200nm。

随着垂体腺瘤研究工人的广泛和深入，按激素归类，大致可有单激素腺瘤、多激素腺瘤和无功能腺瘤三大类。近年研究发现，多激素腺瘤越趋增多，有报道可占 30%～40%，提示垂体多激素腺瘤的研究可能促进垂体腺的细胞生理学和细胞病理学的发展，可能对垂体肿瘤临床诊治产生重要影响。

二、胰岛细胞瘤胰岛细胞瘤是胰腺内分泌肿瘤。电镜下，在各类型肿瘤细胞浆内均可见带膜的分泌颗粒。应用免疫细胞化学方法，以多种内分泌激素抗体标记，可区分以下类型胰岛细胞瘤：

1．胰岛素瘤 由胰岛 B 细胞组成。患者血浆胰岛素水平升高，有低血糖症。免疫细胞化学染色可见大部分瘤细胞胞浆呈胰岛素阳性反应。有些肿瘤患者不伴有明显的临床症状。但血液生化测定可发现轻度血糖降低，免疫细胞化学染色多呈阴性反应或数量不等的散在阳性细胞。此瘤少数（约 5%）可为恶性，常规染色难以根据细胞形态判断其生物学行为，而是根据其有无转移。近年证明恶性胰岛素瘤分泌与糖蛋白激素共同的 α 链物质，可以免疫细胞化学方法检出。

2．胰高血糖素瘤 由胰岛 A 细胞组成。临床上常伴有胰高血糖素综合征。大多数胰高血糖素瘤为恶性。免疫细胞化学染色可显示瘤细胞胞浆有胰高血糖素反应阳性物质。

3．生长抑素瘤 由胰岛 D 细胞组成，约半数为恶性。免疫细胞化学染色可见瘤细胞胞浆有生长抑素反应阳性物质。

4．胰腺胃泌素瘤 由胰岛 G 细胞组成。电镜下证明瘤细胞胞浆颗粒与胃窦部 G 细胞颗粒非常相似。免疫细胞化学染色可见瘤细胞胞浆有胃泌素阳性物质。

5．胰舒血管肠肽瘤 亦称胰腹泻瘤，由胰腺舒血管肠肽（VIP）细胞（D1细胞）组成。此瘤约半数为恶性，常见肝脏转移。免疫细胞化学染色可见肿瘤细胞胞浆有 VIP 阳性物质。

6．胰多肽瘤 由胰岛 PP 细胞组成。免疫细胞化学染色可见瘤细胞有 PP 阳性物质。

近年来，应用免疫细胞化学方法研究发现，有一些胰岛细胞瘤含有二种或二种以上的内分泌细胞，往往是以一种内分泌细胞为主，其它类型的内分泌细胞混杂其间。

三、甲状腺髓样癌由甲状腺滤泡旁细胞（C 细胞）产生的恶性肿瘤。此瘤在光镜下与甲状腺非典型腺瘤、未分化癌及转移癌有时难以鉴别。免疫细胞化学染色可见瘤细胞降钙素阳性反应，降钙素免疫反应物常聚积于瘤细胞核周胞浆中，此项检查具有诊断意义。电镜下，瘤细胞中可见二种分泌颗粒，I 型颗粒直径约 280nm，含有等电子密度的基质，紧邻界膜：II 型颗粒直径约 130nm，有致密核，由空晕与界膜相隔。免疫细胞化学染色证明二种颗粒内都含降钙素。

甲状腺髓样癌中除见降钙素阳性细胞外，常混有 5—HT 免疫阳性细胞，有的混有其它肽类激素阳性细胞，如 ACTH 阳性细胞等。

四、肺支气管类癌及肺小细胞癌在肺癌中有一类来自神经内分泌细胞的癌，即支气管类癌及小细胞癌，它们都具有共同的超威结构特征，即癌细胞内含神经内分泌颗粒，可异位分泌多种激素，例如，支气管类癌可产生 5—羟色胺，出现类癌综合征，小细胞肺癌可分泌 ACTH，临床上出现 Cushing’s 综合征，等。近年研究发现，光镜下的小细胞癌并非都具有神经内分泌颗粒，因此，在诊断中常将光镜、电镜及免疫细胞化学等方法结合进行，但也有不同报道，例如，刘鸿瑞等对 16 例肺原发性小细胞癌手术切除标本，进行光镜、电镜及免疫细胞化学观察，其中燕麦状细胞细胞癌 8 例，中间型小细胞癌 7 例，复合小细胞癌 1 例。超微结构观察，全部瘤细胞内找到神经内分泌颗粒，但量较少。12 例（12/15）神经特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色阳性。据报道，NSE 对此类小细胞癌是一项特异、灵敏的标志。

五、食管燕麦细胞癌1926 年，Barnard 提出苝麦细胞癌一词，当时仅是肺未分化癌的同义词。后来，这种形态的肿瘤不仅见于肺，也见于肺外部位，如鼻腔、喉、乳腺、胸腺、前列腺、宫颈等均有过燕麦麦细胞癌的报道。食管燕麦细胞癌很少见，自 1952 年 Mckeown 首次报道 2 例以来，文献中仅有零星病例报道。我国冼美生等报道 7 例，它们组织学表现相同，无论从组织结构、细胞形态均酷似肺燕麦细胞癌。3 例经过 Grimelius 嗜银染色，证明瘤细胞胞浆内有嗜银颗粒，Fontana-Masson 亲银染色阴性，电镜下见特征性神经内分泌颗粒。免疫细胞化学染色可见神经特异性烯醇化酶（NSE）阳性细胞。此瘤生长迅速，恶性程度甚高，70% 死于 6 个月内。

六、皮肤神经内分泌癌（Merkel 细胞瘤）此瘤是近几年来确认的一种少见的高度恶性肿瘤，后来，Tan 等（1978 年）又通过电镜观察证实了这类肿瘤细胞含有神经内分泌颗粒，从而明确了此瘤的神经内分泌属性，同时，还提出它在组织发生学上可能与正常分布于表皮基底层且与触觉神经有关的 Merkel 细胞有一定联系。免疫细胞化学染色，在目前已知的阳性反应物中包括：NSE、NF、血管活性肠肽（Vasoactive in-testinal polypeptide）、胰多肽（pancreatic polypeptide）、ACTH、生长抑素（Somatostatin）、降钙素（Calci-tonin）及物质 P（Substance P），除 NSE 是唯一的对大多数瘤细胞呈强阳性反应之外，其它的在现在文献中尚无任何一种能充分地在大多数瘤细胞中表达，因此，NSE 免疫细胞化学染色技术在此瘤的诊断与鉴别诊断中有重要意义。当然，皮肤某些其它原发或转移性肿瘤也可能显示 NSE 阳性反应，如恶性黑色素瘤等，故应强调临床、形态、免疫细胞化学及电镜等的多指标综合分析，最后作出准确诊断。

第三节 软组织与骨肿瘤细胞化学软组织亦称间叶组织，它的广义包括结缔组织、脂肪组织、肌肉、血管、滑膜、周围神经以及骨组织等。本节 研究的对象为来源于这些组织的肿瘤，与一些与之相关但组织发生尚不太明了的肿瘤的免疫细胞化学标记。软组织恶性肿瘤虽然只占人体全部恶性肿瘤的 1% 左右。但由于这类肿瘤形态很相似。在常规切片下确定其组织发生，常是临床病理诊断中的难题之一，为病理工作者所关注。由于免疫细胞化学的发展，研制成许多标记抗体，提供了确定软组织肿瘤的组织发生的和鉴别诊断应用的标记抗体。但是有的抗体特异性不够，存在交叉反应以及肿瘤细胞的异质性、多向分化潜能等问题，致该项技术仅为临床诊断解决了部分问题，尚有许多问题有待进一步解决。

一、常用标记抗体用于软组织肿瘤可在石蜡切片表达的抗体已有多种，请参见表 12-1。

表 12-1 软组织细胞可用的标记抗体

抗原名称标记细胞（1）角蛋白（Keratin）上皮与肌上皮细胞（2）波纹蛋（Vimentin）间叶分化细胞、内皮细胞（3）结蛋白（Desmin）肌组织分化细胞（4）肌动蛋白（Actin）肌细胞，肌上皮细胞，肌纤维（5）肌浆球蛋白（Myosin）肌母细胞，部分内皮细胞及肌细胞（6）层粘蛋白（Laminin）平滑肌与雪旺氏细胞，基底膜（7）纤维连接蛋白（Fibronectin）间叶细胞，纤维—组织细胞及滑膜细胞，间皮细胞（8）第 VII 因子（Factor VII rag）血管内皮细胞（9）肌球蛋白（Myoglobin）骨骼肌细胞（10）S—100 蛋白（S—100protein）周围神经，朗格罕氏细胞，黑色素细胞、单核 / 巨噬细胞，淋巴结内的小结树突细胞。（11）髓鞘基质蛋白（Myelin basic protein）周围神经细胞（12）a—1 抗胰蛋白酶（α—Antitrypsin）组织细胞（13）a—1 抗糜蛋白酶（α—1Antichymotrypsin组织细胞（14）溶菌酶（Lysizyme）组织细胞、粒细胞、软骨细胞（15）酸性磷酸酶（Acid phosphatose）骨与软骨细胞（16）碱性碗酸酶（Alkaline phosphatase）骨与软骨细胞上述各种抗原抗体标记效果一般与其被标记细胞含抗原量呈正相关。一般良性瘤与正常细胞的反应相一致。而恶性肿瘤由于分化差，标记反应与分化程度呈平行关系，分化很低者则可呈弱或阴性反应。例如 Lysozyme 与 myosin 在恶性肿瘤可不表达。要注意中间丝抗体在各种间叶细胞之间有交叉反应。尤其是波纹蛋白抗体更为广泛。赖日权等报告（1990 年）发现 128 例上皮性肿瘤中有 45 例（35.1%）有波纹蛋白表达。因此告诫我们最好应用几种同功效抗体一起标记，并结合组织学改变综合分析，评价标记效果更为准确。

二、软组织肿瘤免疫组织化学（一）纤维组织与纤维组织细胞性肿瘤免疫细胞化学标记

纤维组织肿瘤缺少专一性抗体标记。特别分化较低的纤维肉瘤，一般应用 Masson 或 Van Gieson 染色，再用肌源性抗体等排除法来确诊，对双向分化的恶性纤维组织细胞瘤，应采用纤维与组织细胞两种标记抗体。即可应用 Vimentin 和抗胰蛋白酶或抗糜蛋白酶抗体标记取得满意的结果，如果是多形性恶性纤维组织细胞瘤常与多形性脂肪肉瘤及多形性横纹肌肉瘤相混，鉴别困难时，则应辅以肌球蛋白等抗体进行区别。

（二）肌源性肿瘤的免疫细胞化学标记

1．平滑肌肿瘤平滑肌肿瘤在 HE 染色组织学改变可与纤维性，神经纤维性及纤维组织细胞肿瘤相混淆。目前缺乏对平滑肌的专一性抗体，只有采用间接排除法。肌动蛋白，肌浆球蛋白及结蛋白对平滑肌肿瘤标记强阳性，而组织细胞阴性。加上肌球蛋白和 S—100 蛋白表达阴性则排除了纤维组织细胞瘤和神经源以及横纹肌肿瘤。层粘蛋白可在平滑肌和雪旺氏细胞肿瘤阳性表达，可用此区别纤维性肿瘤。

2．骨骼肌肿瘤多形性横纹肌肉瘤如果能找到有横纹的带状肌母细胞，比较易于确诊，但有时找不到带状肌母细胞，易与多形性恶性纤维组织细胞瘤混淆。小细胞性胚胎性横纹肌肉瘤则与软组织恶性淋巴瘤，尤文氏肉瘤，周围性神经母细胞瘤难于鉴别。应用比较特异的肌球蛋白抗体就可识别。肌浆球蛋白和结蛋白抗体亦可作阳性标记，因为平滑肌肿瘤不可能是小细胞性，另外加用白细胞共同抗原（LCA）和 S—100 抗体则能排除淋巴瘤和神经母细胞瘤。在实际工作中要引起我们注意的是有时一些小细胞肉瘤浸润人横纹肌组织，在瘤细胞中混杂一些萎缩状横纹肌细胞，出现肌球蛋白抗体阳性，而不是横纹肌肉瘤。另外子宫内膜混合性 Mulleriam 肉瘤，Wilm’s 瘤及恶性蝾螈瘤中出现横纹肌源瘤细胞，肌球蛋白抗体标记阳性，这对预后估计有帮助。Eusebi 强调侵入骨骼肌的恶性上皮性细胞也可呈现肌球蛋白阳性表达，应特别注意。

（三）血管源肿瘤免疫细胞化学标记

1．血管内皮瘤与肉瘤第Ⅷ因子抗体对血管内皮细胞是很有用的标记物，尤其是良性血管瘤或血管内皮瘤。而在血管内皮肉瘤，肿瘤性内皮细胞分化低者可为弱阳性或阴性。最近有文献报道，波纹蛋白对内皮细胞也有良好的标记作用。阳性内皮细胞位于网状纤维包围之中也是血管肉瘤的一个形态学特点。

2．血管周边细胞肿瘤血管周边细胞是包被在血管基底膜之外，是一种多能干细胞。它可能产生的肿瘤有血管周边瘤或肉瘤，血管球瘤及 Kaposi’s 肉瘤。分述如下：

（1）血管周边细胞瘤或肉瘤：瘤细胞包绕在裂隙状血管之外周，周边细胞第Ⅷ因子阴性而瘤细胞之间富于纤维连接蛋白。但这些抗体是非特异性的，最好用多种抗体来排除其他肿瘤的可能性。

（2）血管球瘤：目前认为其增生的瘤细胞也可能来自血管周边细胞，在瘤细胞内外均显丰富的肌动蛋白和肌浆球蛋白。诊断时要注意发生部位及组织学特点。

（3）Kaposi’s 肉瘤：至今该瘤的组织发生尚有争论。多数认为是血管内皮细胞发生，但其临床表现与发展过程有别于血管肉瘤。其由恶性短梭形细胞组成，间以许多间隙，内有红细胞，新近 Guarda 等报道梭形细胞第Ⅷ因子阳性，但也有阴性。有的作者认为该肿瘤来源于淋巴管内皮的可能性大于血管内皮。Barsky 指出，应用抗基底膜抗体可以区别血管与淋巴管，后者缺乏。

（四）双向分化的软组织肿瘤免疫细胞化学标记

这里的双向分化是指有纤维性与上皮性两种瘤细胞为主构成的肿瘤。电镜观察证明肿瘤细胞包括未分化间叶细胞，上皮性细胞以及介于两者之间的中间细胞，这里讨论的双向分化肿瘤包括滑膜肉瘤，间皮肉瘤、上皮样肉瘤脑膜瘤或肉瘤的免疫细胞化学标记，现分述如下：

1．滑膜肉瘤滑膜肉瘤是由纤维型与上皮型两种细胞组成的双向分化肿瘤。分化高者上皮细胞呈腺样或裂隙排列，与纤维型瘤细胞分界清楚。而分化低者两型瘤细胞混染组成，分界不清。也有以某一成分占优势的单相滑膜肉瘤。应用纤维连接蛋白纤维型瘤细胞浆内阳性。有别于其他肉瘤细胞在细胞外阳性。波纹蛋白亦可阳性。上皮型成分细胞角蛋白阳性。组织细胞标记抗体阴性。纤维细胞型单相滑膜肉瘤应与纤维肉瘤及纤维母细胞性恶性纤维组织细胞鉴别，可用纤维连接蛋白来区别。另外再加用组织细胞与上皮性标记来辅助区别。

2．上皮样肉瘤该肿瘤的组织发生尚未完全肯定。但认为与滑膜肉瘤有相关性。在电镜上得到支持。它亦有纤维型和趋上皮分化倾向。瘤细胞呈结节 状排列，中央易见到坏死。免疫组化显示细胞内纤维连接蛋白、肌动蛋白及波纹蛋白阳性表达。

3．间皮瘤或肉瘤按 WHO 分类分为上皮型，纤维型及混合型。一般波纹蛋白对梭形细胞及部分上皮型细胞阳性表达。而细胞角蛋白对上皮型及部分梭形细胞阳性。

4．脑膜瘤与肉瘤良性脑膜瘤一般易于诊断，但恶性（间变型）脑膜瘤常规切片确诊比较困难、组织学类型有纤维肉瘤样型，血管肉瘤样型，巨细胞肉瘤样型等。电镜证实由未分化原始间叶细胞、中间型细胞、梭形细胞、巨细胞、上皮样细胞组成，具有双向分化的特点。潘传敬等对 18 例间变型脑膜瘤做多种抗体标记显示：一般良性脑膜瘤不同型瘤细胞对波纹蛋白、EMA、角蛋白及 S—100 蛋白均呈阳性反应。而在恶性脑膜瘤则未分化细胞全阴性。而中间型细胞则除 S—100 以外其余抗体可均阳性。梭形细胞波纹蛋白与 S—100 阳性。巨细胞与上皮细胞与中间型细胞反应相同。

（五）脂肪源肿瘤免疫细胞化学标记

脂肪肉瘤由脂母细胞和前母细胞组成，有高分化型，粘液型，圆细胞及多形细胞型，后两型与未分化肉瘤与多形性横纹肌肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤很难区别。如果仅凭有无脂母细胞来确诊是不行的。因为“恶性纤维组织细胞”亦有脂肪染色阳性细胞。但脂肪肉瘤缺乏特异性免疫组化标记抗体。S—100 蛋白对成熟脂细胞阳性，但脂肪肉瘤阴性。目前只有采用系列性抗体来排除多形性横纹肉瘤与恶性纤维组织细胞而确诊。

（六）外周神经肿瘤免疫细胞化学标记

恶性神经鞘瘤常与纤维肉瘤、低分化滑膜肉瘤相混淆。但应用 S—100、NSE、髓鞘基质蛋白均为阳性标记物。外周神经母细胞瘤与软组织淋巴瘤、Ewing 肉瘤等难于区别。但应用 S—100 蛋白标记可阳性。

（七）组织发生未定的软组织肿瘤

至今组织发生尚未完全肯定的软组织肿瘤有颗粒细胞瘤，腺泡状软组织肉瘤，尤文氏肉瘤，粘液样软骨肉瘤，腱鞘透明细胞肉瘤等。现分述如下：

1．颗粒细胞瘤其形态学比较明确、HE 亦易于确诊。但其组织发生未定。过去认为它是肌源性的。但肌球蛋白阴性。而 S—100、NSE 为阳性表达。表明其可能是神经源性、Fisher 用电镜也证明了这点。

2．腺泡状软组织肉瘤本肿瘤形态特点也较明确。当初有人认为来源于雪旺氏细胞。但 S—100 阴性。Fisher 等认为是肌源性发生，因为电镜发现瘤细胞中有中间丝结蛋白与波纹蛋白。而 Mukai 持反对意见。认为这是非特异性的。免疫组化，肌球蛋白阴性。有人认为是非嗜铬性副节 瘤。

3．软组织尤文氏肉瘤本瘤由小细胞肉瘤细胞组成。它与腺泡状横纹肌肉瘤。神经母细胞瘤及转移性小细胞癌很相似。它缺乏特异性标记抗体。波纹蛋白阳性，表明它来源于间叶细胞。应用肌球蛋白，S—100 及 NSE 标记阴性而其他三种肿瘤分别阳性。再加作糖元染色，瘤细胞胞浆阳性而确定诊断。

4．腱鞘透明细胞肉瘤该肿瘤与腱鞘关系密切，成团的胞浆透明的瘤细胞。由于瘤细胞中含有一些色素。因此认为可能来源于滑膜或黑色素细胞。新近 Chung 和 Enziger 研究发现，至少有 2 / 3 的病例，S—100 蛋白与 melamin 标记阳性。故来源于黑色素细胞的可能性大于滑膜。EM 下瘤细胞中可见到发育不良的黑色素小体。

5．骨外粘液样软骨瘤（脊索样肉瘤）这是一种十分罕见的病变。常见于下肢深部。组织学特点是成索与旋涡状排列的小圆形瘤细胞。衬有粘液样基质，可相似于恶性脊索瘤。免疫组化显示溶菌酶阳性，但 S—100 蛋白阴性。而真正的脊索瘤相反。其他标记全为阴性。

三、骨及软骨肿瘤免疫细胞化学标记骨肿瘤种类繁多，大体上分为生骨性，软骨性，纤维性，纤维组织细胞性，破骨细胞性以及各种软组织、骨髓细胞、胚胎残余细胞产生的肿瘤等等。看来复杂，实际上骨组织是由成骨（骨软骨）性组织与一般间叶性细胞构成。后者与前述软组织肿瘤相一致。总体上看骨肿瘤是在间叶组织基础上的特殊性肿瘤。现重点将成骨，成软骨及破骨性肿瘤的免疫细胞化学标记予以讨论。

1．良性骨与软骨肿瘤它们存在诊断上的困难是低分化的骨与软骨肉瘤与间叶性血管外皮瘤，巨细胞瘤，“恶纤组”等不易区别。尤其是骨肉瘤有骨母细胞性，软骨母细胞性，成纤维细胞性，毛细血管扩张性及小细胞性，则免疫组化标记将发生重要作用。成骨肉瘤中有无骨样组织是与其他类似肉瘤鉴别的关键。目前骨样组织较特异的标记抗体有碱性或酸性磷酸酶、骨生长骨白（bone growth protein, BGP）、骨形成蛋白（bonemorphogenetic protein, BMP）等抗体。骨肉瘤中胃样组织阳性、其他软组织肉瘤阴性。Iwasaki 等报告 MGP 标记 33/35 例骨肉瘤，12/15 例软骨肉瘤阳性表达。其中软骨肉瘤 BGP 阳性例数与病理性分级呈正相关。而“恶纤组”与巨细胞瘤中的多核巨细胞为阴性。而骨肉瘤中的瘤巨细胞（12/25）与骨样组织阳性。高奉浔等报告 BMP、波纹蛋白、肌动蛋白表达阳性对骨母细胞型骨肉瘤有诊断意义。BMP、Vimentin Actiu 及 UEA-1（荆豆凝集素）受体表达阳性对纤维母细胞型骨肉瘤有诊断价值。BMP、Vi-mentin、Actin、UEA-1Ⅳ型胶原表达阳性对纤维母细胞型骨肉瘤有诊断价值。其中 BMP 对骨肿瘤有共同的特异性，而其他软组织肉瘤为阴性。软骨肉瘤基质 S—100 表达阳性。

2．骨巨细胞瘤目前研究认为破骨性多核巨细胞系由血源性单核细胞到骨组织内演变而成。因此它具有组织单核细胞的相同标记。而 BMP 与 BGP 表达阴性。其纤维型瘤细胞可有 Vimentin、Actin 阳性表达。

第四节 免疫活性细胞及其肿瘤的免疫细胞学免疫活性细胞组成人体免疫系统组织、器官，是维持人体内外环境稳定，消除体内外抗原性物质之危害，起着免疫监视作用，是当代重视和研究地十分深入的领域。免疫活性细胞主要包括淋巴细胞、单核 / 巨噬细胞及网状细胞等。它们产生的肿瘤—恶性淋巴瘤，是预后差的一类肿瘤，其形态与分型十分复杂。由于淋巴网状组织学及功能的特殊性等因各种抗原性刺激而引起的淋巴网状组织反应性增生（Reactive Hyperplasia, RH）、改变复杂，其与恶性淋巴瘤在组织学方面鉴别很困难，误诊率可达 10%～30%，是临床病理诊断中的难题。由于免疫细胞化学，分子生物学的发展，已有可能利用单克隆抗体（McAb）或多克隆抗体（PcAb）和 IgH,TCR（T 细胞受体）基因重排检测技术，将免疫活性细胞及其肿瘤细胞的细胞系及分化期、亚型、淋巴瘤良、恶性进行鉴别诊断。免疫细胞化学技术简单易行，具有一定的特异性。且可在组织原位标记。并可用于印片或细胞悬液，配合流式细胞仪，提供更为精细的信息。目前市场供应的 McAb 与 PcAb 可已有百种。国际统一称之为 CD 系列。已往还有 OKT 系列和 Leu 系列。但仍有不足的一面，所有抗体在特异性，表达率均有不足。而且在良、恶性的鉴别作用更是有限。

一、免疫活性细胞的免疫细胞化学（一）B 淋巴细胞 B 淋巴细胞从骨髓干细胞到分化成熟称为非抗原依赖期。成熟 B 小淋巴细胞受到抗原刺激后可产生增殖衍化，演变成浆细胞合成分泌 Ig。B 淋巴细胞存在细胞表面 Ig(SIg)及细胞内 Ig(CIg)。人们利用 SIg 与 CIg 作为抗原制成许多标记抗体。SIg 标记只存在于次成熟的转化淋巴细胞。且多数为 IgM·G，而幼稚的前 B 淋巴细胞与浆细胞缺乏 SIg 标记。目前较常用的 SIg 标记 McAb 有 CD19，CD20，CD22，需冰冻切处新鲜组织，而 L 26则可用于石蜡切片。后又增加 LN—1，LN-2，LN-3，MB-1，MB- 2 及 4KB5等石蜡切片标记抗体。称它们为全 B 抗体。

Cig 可分 Ig 重链包括 IgM、Igg IgA、IgD、IgE5 种，轻链 λ、k 两种，CIg 标记抗体表达在愈成熟的 B 淋巴细胞，幼稚者则阴性。在不同部位组织其表达也不一致。如淋巴结生发中心 B 细胞表达 IgD，而肠粘膜淋巴组织中的生发中心 B 淋巴细胞则表达 IgA。上述 IgH、L 抗体在一些因素的影响下，真正表达率只有 75% 左右，而且如巨噬组织、R- S 细胞等可以吸收血浆中的 Ig 而出现假阳性。

表 12-2 介绍了淋巴细胞分化各阶段的部位、免疫表型和相关肿瘤，请参阅。

表 12-2B 淋巴细胞分化各阶段细胞的部位、免疫表型和相关肿瘤

（二）T 淋巴细胞由于 T 细胞表面存在羊红细胞受体（E-R），人们利用 T 细胞受体作抗原制成多种 McAb，如 CD2，T11，OKT11，Leu5等。发育不同阶段的 T 细胞 ER 数量及亲和力不同。未分化 T 细胞与前 T 细胞缺乏 ER，但它可用 TdT 抗体标记。T 淋巴细胞又分辅助 T / 诱导（TH/T1）志抑制 T / 毒性 T（TS/TK）两大亚型。TH标记抗体有 CD4等，TS标记抗体有 CD8。上述几种抗体要新鲜组织冰冻切片。一般难于广泛使用。最近制出 UCHL-1，MT-1Leu22(L60)等石蜡切片全 T 性标记抗体，其中 UCHL- 1 已被广泛采用。新近又推出 A 6，MCA6，比 UCHL- 1 效果要好。OPD4可用于石蜡切片 T H标记。CD5，CD6等 McAb 特异性不足，可以标记少数 B 淋巴细胞，粒细胞等。

表 12-3 介绍了 T 淋巴细胞分布及各阶段细胞的部位、免疫表型和相关肿瘤，请参阅。

表 12-3 T 淋巴细胞分化各阶段细胞的部位、免疫表型和相关肿瘤

表 12-2、12- 3 引自全国第六届淋巴瘤学术会议论文汇编，恶性淋巴溜和白血病的免疫组织化学（综述）上海肿瘤医院，朱雄增。

（三）NK 细胞 / K 细胞目前认为 NK 细胞是一种自然杀伤细胞，它杀伤特异性细胞，事先无需致敏，亦无 MHC 限制的淋巴细胞。K 细胞是指能介导 ADCC（抗体依赖性毒性淋巴细胞）。过去曾认为 NK 细胞是胞浆中含有粗大溶酶体的颗粒性大细胞。现已证明它在分化成熟后才有这一特征。它的表面有高亲和力的 IL- 2 受体，在 IL- 2 刺激下可以增殖和表达细胞毒性。活性后的 NK 细胞还可表达 HLA-DR 抗原。NK 细胞的标记特点是 CD56，CD2ER，Igg FcR/C3 R 均阳性表达，而 CD3，CD7，CD19阴性表达。后发现 CD57，CD56也是较特异性 McAb。对 K 细胞与 NK 细胞之间的关系尚有不同意见，但多数认为二者系由同一细胞介导。

（四）单核 / 巨噬细胞与网状细胞单核 / 巨噬细胞不仅参与抗原的提呈和免疫调节，而且是具有特异和非特异吞噬异物功能的免疫活性细胞。单核细胞起源于骨髓干细胞，进入血流，当它到达组织则称组织细胞。在出现吞噬时则称巨噬细胞。它分布于不同组织，如枯否氏细胞，肺泡巨噬细胞，腹腔巨噬细胞，脑小胶质细胞，甚至破骨细胞等，这类细胞统称为单核 / 巨噬细胞系统。不同组织的巨噬细胞其生物学特性亦有差异。应用的标记抗体有抗溶菌酶（lys），抗 α 1- 胰蛋白酶（AAT），抗 α 1- 糜蛋白酶（ACT）抗体均可用于石蜡切片标记。其中 lys 抗体反应较弱，敏感度不足。新近又推出 Mac387,KP1 标记抗体、效果十分满意。另外还有 CD116，CD64，CD32等 FCR 抗体，需冰冻切片。

网状细胞，过去认为它是组织细胞同类细胞。但已证明它是固定于淋巴网状组织的一类无吞噬功能，但可传递抗原信息、调节 免疫功能。其细胞发生尚有争议。其中包括生发中心树突网状细胞（DRC），指突状网状细胞（IRC），在髓质淋巴窦附近的纤维母细胞网状细胞以及主要分布在皮肤表皮的朗格罕氏细胞（Langerhan’s cell）等。这类细胞均有类似巨噬细胞的 HLA-DR 抗原表达，但较弱。它们可对 S—100 蛋白阳性表达，是与巨噬细胞不同之点。

二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记恶性淋巴瘤总的可分为非何杰金淋巴瘤（NHL）与何杰金氏病两大部分。NHL 的免疫功能分类繁多。总体上各类型的瘤细胞的免疫细胞化学标记与相应的正常细胞标记相一致。但是由于瘤细胞的基因有变异，分化不正常，其抗原性也发生变化。因此瘤细胞比相应正常细胞的表达要弱或丧失。在此不分型描述，而从应用角度分为下列三方面进行讨论：

（一）恶性淋巴瘤与淋巴网状组织反应性增生的鉴别诊断组织学鉴别，在早期滤泡内型滤泡型淋巴瘤与淋巴滤泡瘤样增生、高分化的 NHL 与 RH 及假阳性淋巴瘤鉴别方面存在相当的困难。必需借于其他有效技术方法。但免疫细胞化学标记有一定限制性。其中 B 淋巴瘤与 RH 鉴别中可以应用 IgH 和或 Igl 标记，及有 75% 左右的恶性淋巴瘤为 IgH 和 / 或 IgL 单项阳性，即为单克隆性增生，相反如为 2 项以上阳性为多克隆性 RH，但有时少数淋巴瘤可出现双克隆性，这方面应严格排除其他因素引起的假阳性和假阴性，故仍需紧密结合组织学改变。T 淋巴瘤则缺乏单克隆性标记抗体，在应用全 T 性抗体标记出现单一性或高度优势标记，再结合组织学改变可以辅助识别良、恶性。新近报告富于 T 细胞的 B 淋巴瘤或富于 B 细胞的 T 淋巴瘤（在瘤细胞间伴有大量反应性成熟 T 或 B 淋巴细胞），这与良性反应性增生更为困难。若瘤细胞体积增大，出现 T 或 B 单一性标记，而反应性淋巴细胞呈现 T、B 及组织细胞混杂标记，则有助于良恶性炎鉴别，另外可加用 PCNA（增殖细胞核抗原）或 Ki—67 标记，则瘤细胞一般为阳性。

（二）恶性淋巴瘤与非淋巴瘤网状组织肿瘤的鉴别目前有较多的报告淋巴结外组织未分小细胞癌或网瘤，常规切片很难与恶性淋巴瘤区别，小细胞肉瘤有胚胎性横纹肌肉瘤、外周性神经母细胞瘤，Ewing’s 肉瘤，Merkel 细胞癌以及无色素性恶性黑色素瘤。应用免疫组化有较好的鉴别作用。首先应根据 HE 组织学改变，一般特殊组织化学染色初步确定某一类肿瘤的可能。再从总体上先作 LCA（白细胞共同抗原）与 EMA（上皮膜抗原）免疫细胞化学标记。确定是淋巴瘤还是未分瘤。如果两者均阴性则应加作其他淋巴瘤抗体标记。因为 LCA 抗体在浆细胞瘤，T 淋巴母细胞淋巴瘤及何杰金氏病 R—R 细胞不表达。上述标记全阴性，则应作 Vimentin 标记，如为阳性，则为间叶组织源。再用肌球蛋白标记阳性为胚胎性横纹肌肉瘤。作糖元染色阳性为 Ewing 肉瘤，NSE 阳性为 Merkel 细胞或肺小细胞癌，S—100 阳性为神经母细胞瘤。

（三）恶性淋巴瘤的免疫细胞分型淋巴瘤分型对病人预后的估计，临床治疗有指导性意义。但这不如良恶性鉴别重要。在日常外检中进行淋巴瘤分型，应挑选针对性强、特异性高、使用方便的标记抗体。如有条件的单位以新鲜组织冰冻切片标记、阳性率高。一般单位病理科则选用石蜡切片标记抗体。目前比较常用而效果稳定的石蜡切片标记抗体有 L 26（全 B，除浆细胞瘤）UCL1（全 T）KP1 或 Mac387 组织细胞标记。T 淋巴瘤应用 CD4与 CD8标记区别辅助 T 或抑制 T。

以上为 NHL 标记分型。关于 HD 的 R - S 细胞标记。R—s 细胞的发生组织细胞至今尚未完全肯定、R—S 细胞标记抗体最先应用 LeuM1(CD15)抗体，它对 HD—LPL—H 型 R—S 细胞不标记。且对粒细胞、T 细胞、单核 / 巨噬细胞，甚至上皮细胞也阳性。最近由体外培养的 R—S 细胞提取抗原制成的 Ki-1McAb、对所有类型的 R—S 细胞均为阳性表达。但对活化的 T 或 B 淋巴细胞亦阳性。且需作冰冻切片染色。而可在石蜡切片表达的 Ber—H2抗体问世，就解决了困难问题。

（四）在恶性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事项为了正确应用免疫细胞化学标记手段在恶性淋巴瘤诊断，分型等方面发挥更大的作用应注意下列问题：①免疫细胞化学在恶性淋巴瘤分析中应紧密结合组织学改变，有目的地选用高效、广谱的抗体，淋巴瘤常用标记抗体见表 12-4。因为免疫细胞化学的结果受到多种因素的影响，可以出现假阳性或假阴性；②为了避免因抗体标记的局限性而造成漏诊，有条件的单位最好一次用同功能的几种抗体，这样可以起来抗体间的反应互补性，往往比单项抗体的标记率高；③标本固定要及时，应用中性福尔马林液或 B 5固定液，则抗原保存要好一些。尽可能应用低压，低温（60℃以下）浸蜡，减少抗原的破坏丢失；④抗体的浓度要适当，消除背景染色。加用二甲砷酸钠可除去背景着色。特别膜标记阳性时与背景着色很难区分。前者包绕细胞呈环状；⑤每次染色应有阳性对照和阴性对照；⑥目前淋巴瘤的基因重排检测技术已经建立。特别是多聚酶链反应（PCR）扩增技术的应用，提供了特异（无假阳性），敏感（可检测出 1 /100 万瘤细胞）快速（当天可出报告）的淋巴瘤检测手段。作者科室已建立了该项技术。虽然其设备条件要求比较高。可作为疑难、早期、化疗后残留病灶病例的确诊。

表 12-4 淋巴瘤常用标记抗体

CD常用名称抗原分子量（kD）反应细胞CD1T6，OKT6，Leu645胸腺细胞 /Langerhans 细胞CD2T11，OKT11，Leu550全 T（E 花结受体）CD3T3，OKT3，Leu419～29全 T（T 受体相关）CD4T4，OKT4，Leu355 T 辅助（NHc II 类）CD5T1，OKT4，Leu167全 T，偶 B CD6T12，TU33120全 T，偶 B CD7CDLeu9，TU14，EA1※41全 T CD8T8，OKT8，Leu232 T 抑制（TMHc I 类）CD9J2，BA224T，B，髓细胞CD10J5，BA3，ViLA1100前，B 前，生发中心（CALLA）CD11MO1,E11,MY894～155髓细胞，单核细胞CD13MY7(MCS—2)160髓细胞，单核细胞CD14Mo2,MY4,UCHM155髓细胞，单核细胞CD15LeuM1※,,anti X-Hapten–粒细胞，单核细胞，R- S 细胞，上皮细胞CD19B495全 B（不包括浆细胞）CD20B135全 B（不包括浆细胞）CD21B2145生发中心，套区和周围血 B 滤泡树突细胞CD22Leu14(To15),SHCL1135全 B CD23TU1,Blast245套区，？生发中心 B，不包括周围血CD24BA145，55，65全 B，粒细胞，浆细胞CD25TAC55活化 T 和 B（IL2受体）CD30Ki—190～110R- S 细胞，活化 T 和 B CD33MX967髓细胞，单核细胞CD34MY10,3C5115成髓细胞CD45LCA※,T29/33, PD7/26220白血细胞共同抗原（T，B，M）CD45RUCHL1※全 T X4KB5※全 B –TdT※–前 B 和前 T，皮质胸腺细胞–L26※全 B –HLA—DR (Ia-Like)–全 B（不包括浆细胞）活化 T（MHc II 类）※可用石蜡切片标记的 McAb

第五节 上皮组织肿瘤免疫细胞化学上皮组织来源的肿瘤是人类最常见的肿瘤。病理组织学上具有上皮特征的高分化肿瘤，一般不需要免疫标记即可明确其上皮性质。但对本质上为上皮组织来源而病理组织学上为低分化的肿瘤，仅靠病理组织学特征有时难以明确其起源，此时即有必要进行免疫标记。这一问题的解决包括以下三方面的含义：一是明确一个低分化肿瘤（不论原发生或转移性）究竟是否上皮组织来源；二是如果是上此组织来源的肿瘤，空间是来自什么器官，尤其是对转移性者；三是有些肿瘤虽然不是上皮组织来源，但由于它们能表达上皮性肿瘤的某些标记物，因此在鉴别诊断中有重要意义，本节 也作扼要介绍。

为了达到上述目的，得到具有良好特异性的上皮组织肿瘤标记物是关键的环。简言之，这种良好的特异性应当体现在下述两个方面：一是有的标记物能够成功地区分上皮组织（肿瘤）与其它组织，换言之，它们具有上皮组织特异性这一共性作用；二是有的标记物能成功地识别某一器官的上皮组织，构成了器官特异性免疫标记物。目前，对明确上皮组织起源这一目的而言，角蛋白仍是最可靠的标记物，较其它中间丝更具有诊断价值。因此，出于在肿瘤病理学诊断中实际应用的目的，本节 将重点介绍角蛋白在上皮组织肿瘤免疫细胞化学诊断中的有关问题，对某些器官特异性标记物和近年报道的新的上皮组织肿瘤标记物也作扼要介绍。

一、角蛋白关于角蛋白（Keratin）的分子生物学特性本节 不作详述。考虑到临床病理工作的实际需要，只作扼要介绍。角蛋白是位于细胞内的多基因编码的非水溶性纤维性多肽，它存在于每种上皮细胞之中。到目前，已知人类上皮组织含有 19（或更多）角蛋白分子，其中角蛋白I与最轻者（67kD）相对应。而角蛋白 19 与最轻者（40KD）相对应。其中亚型 2～10 被任何上皮所表达，但取决于细胞类型、胚胎发育阶段、细胞分化程度等因素。而最小分子的角蛋白（40kD）是单层上皮的特征，并且是在胚胎时期首先出现的，在肿瘤性上皮细胞中则常常出现。大分子量角蛋白可能是从简单的低分子量角蛋白进化而来。根据角蛋白的等电点、酸碱性及分子量大小，又可分为 A（acidic）和 B(basic)两大亚族。

（一）角蛋白抗体及其在肿瘤病理学中的应用

针对角蛋白家族不同成员的多克隆抗血清的敏感性和特异性存在着广泛的差异，很多商品化的抗血清对大分子角蛋白尤为敏感，因此在外科病理学中的诊断价值受到限制。相反，角蛋白的单克隆抗体较多克隆者，在敏感性和特异性方面都有许多优点，并且现在已可获得商品化的单一或混合抗体。角蛋白的单克隆抗体大体上可分为两组：一是广反应组（broadly reac-tive group），它能识别角蛋白家族中许多成员所共有的表位；另一是选择组，它仅识别少数角蛋白成员甚至某一种角蛋白。其中，识别小分子量角蛋白 18 和 19 的单克隆抗体在病理诊断中最为有用。

1．广特异性角蛋白单克隆抗体这组单克隆抗体对识别上皮细胞尤其是肿瘤细胞具有高的敏感和特异性。这些抗体包括 AE1，AE3，CAM—5.235BHll，UCD/PR10.11c 以及 KA4。这些单克隆抗体可以优先识别存在于 A 和 B 亚族中的小分子量角蛋白的表位。其中，AE1在不同的固定和染色条件下对角蛋白显示了很高的敏感性和广泛的特异性。因此，特别适合用于区分分化差的癌和非上皮性肿瘤。而 CAM-5.2 对识别神经内分泌癌优于 AE1，这是因为 CAM—5.2，UCD/PR10.11 和 35BH11 以其各自理想浓度混合即可。另外，目前已有针对小分子量角蛋白的商品化的单克隆抗体混合物可供选择（MAK—6 和 AE1/AE3）。这些试剂对鉴别上皮组织肿瘤具有广特异性和很高的敏感性。①广特异性角蛋白单克隆抗体在正常组织的染色。用上述抗体在多数正常的上皮细胞可以获得很强的染色效果，但也存在一些差异。AE1和 KA4对皮肤和附件上皮、非角化性复层上皮、单层上皮（如胃肠道等）、泌尿系上皮、分泌性腺体的管道、间皮、乳腺和胸腺上皮可以有很强的染色，但不染正常的肝细胞、唾液腺和胰腺腺泡细胞以及肾小管上皮细胞。这些细胞优先表达角蛋白 18，不能被 AE1和 KA4所识别。相反，CAM—5.2 则能识别角蛋白 18，可染肝细胞，腺泡细胞和肾小管上皮细胞，但不能染正常的表皮细胞。而 AE3单抗不论在冰冻切片，还是在酒精固定、石蜡包埋的切片上，都可以染所有正常的上皮细胞，但在福尔马林固定的组织阳性比例下降。因此，AE3可望成为识别所有角蛋白作为上皮组织起源的通用探针。②广特异性角蛋白单克隆抗体对肿瘤的染色。如前所述，虽然 AE1和 KA4对正常肝细胞和肾小管上皮细胞呈阴性染色结果，但很多肝细胞肝癌和肾癌却可微弱或局灶性表达它们识别的表位，这可能是肿瘤转化过程中抗原改变所致。角蛋白类型的变异表达在非肿瘤性病变的肝细胞中亦可出现。已经证明，Mallory 小体即是由在正常肝细胞所不能测出的角蛋白所组成，AE1和 KA4对可将其染为阳性。

应当指出的是，广反应性角蛋白单克隆抗体与上皮组织肿瘤不起反应，但在上皮样肉瘤和滑膜肉瘤例外。另一个中胚层来源的肿瘤即间皮瘤，仅约有 1% 的病例可表达上皮特征。

2．广特异性角蛋白单克隆抗体在诊断中的应用

（1）未分化癌。使用上述抗体可以成功区分未分化癌与大细胞淋巴瘤和无黑色素性黑色素瘤。此时，最好同时使用黑色素瘤和白细胞标记物以避免阴性结果。同时，为了达到对未分化肿瘤精确诊断的目的，最好使用一组单克隆抗体，包括波形蛋白、白细胞共同抗原（LCA）、S—100 以及黑色素瘤特异性抗原 HMB—45 的单克隆或多克隆抗体。值得指出的是，约有 10% 的大细胞淋巴瘤会因福尔马林固定而不能染出 LCA，尤其是固定时间过长时，这在应用免疫细胞化学鉴别诊断时应当考虑。

（2）腺癌。所有腺癌，不论其细胞起源如何，均可表达用广反应性角蛋白单克隆抗体易于测出角蛋白。因此，上述抗体甚至可作为识别某些腺癌微转移灶，在正常时不含角蛋白的器官或组织，如淋巴结和骨髓中，甚至易于识别出单个转移性肿瘤细胞。

（3）胸腺瘤。当活检标本很小时，鉴别发生于纵膈的胸腺瘤和淋巴瘤有时相当困难。这种情况下，使用广反应性角蛋白单克隆抗体可以明确肿瘤细胞的上皮性质。在胸腺瘤，即便是淋巴细胞为主型，免疫细胞化学染色亦可揭示均匀分布于肿瘤之中的大量含有角蛋白的细胞。相反，累及胸腺的淋巴瘤为阴性结果，但偶可发现残存的胸腺组织灶。

（4）生殖细胞肿瘤。所有生殖细胞肿瘤，除精原细胞瘤外，均表达角蛋白。因此，在病理工作中遇到难以鉴别的间变性精原细胞瘤胚胎性癌时，使用广反应角蛋白单克隆抗体是有帮助的。因在胚胎性癌，总会有些肿瘤细胞表达角蛋白。在典型的精原细胞瘤，有时虽然可看到含有角蛋白的滋养层型细胞，但这种机会是很偶然的。

（5）梭形细胞癌。梭形细胞癌常见于皮肤，但在很多其它上皮组织器官亦可见到。梭形细胞癌组织像与梭形细胞黑色素瘤或非典型纤维黄色瘤等有时是难以区分的，是皮肤活检鉴别诊断中常常碰到的问题。使用广反应性角蛋白单隆抗体能够解决这一问题，特别联合使用其它抗体，如 S100 等，更为可靠。当然，由于上皮细胞向间叶样细胞表型的转移可能伴随角蛋白表达的下降或消失、致使某些梭形细胞癌仅可局灶性表达角蛋白，甚至有时用免疫细胞化学方法不能检测出来。因此，遇到难以诊断的皮下梭形细胞肿瘤时，当角蛋白阴性、S100 与波形蛋白阳性时，宜诊断为黑色素瘤；而只有角蛋白阳性时，才可诊断为梭形细胞癌；当角蛋白和 S100 均阴性、而波形蛋白阳性时，诊断为非典型纤维黄色瘤。

（6）滑膜肉瘤和上皮样肉瘤。一般认为，这两种肿瘤乃起源于间叶组织的肿瘤，但能表达角蛋白。这一特征在与具有相似形态的其它肿瘤鉴别诊断中很有帮助。单相性滑膜肉瘤常需与纤维肉瘤、恶性神经鞘瘤及其它一些梭形细胞肿瘤鉴别，而单相性滑膜肉瘤时常有广反应性角蛋白的局灶性阳性表达，其它肿瘤则为阴性表达。上皮样肉瘤有时可误诊为透明细胞肉瘤、横纹肌肉瘤、甚至炎性肉芽肿。上皮样肉瘤表达角蛋白的特征，具有鉴别诊断价值，由于后三者并不表达角蛋白。

（7）脊索瘤。在某些情况下，难以区分脊索瘤与高度恶性的软骨肉瘤。由于前者表达角蛋白而后者不表达，这一问题即可得以解决。

（8）神经内分泌癌。神经内分泌癌包括雀麦细胞癌，可表达低分子角蛋白，但在雀麦细胞癌的表达可为局灶性的。因此，如果没有足够标本，则难以得到证实。皮肤的 Merkel 细胞癌有时与淋巴瘤难以区分，但 Merkel 细胞癌强表达角蛋白，并且其表达方式常常具有一定的特征性，即角蛋白分布呈包涵体样阳性，这种特性阳性表达形式在其它神经内分泌肿瘤亦常可见到，但在未分化小细胞癌则难见到。

（9）间皮瘤。文献报道，所有的间皮瘤包括上皮样型，混合型和肉瘤型都可广反应性角蛋白单克隆抗体有强反应。由于间皮瘤与多数腺癌对角蛋白的表达强度与在胞浆中的分布相似，因此，上述抗体对区分两者没有帮助。但是，使用不同表型角蛋白的抗体，可能对区分两者有一定价值。当然，通过使用针对其它非中间丝抗体在上述鉴别诊断中也会有所帮助。

3．有限特异性的角蛋白单克隆抗体本组抗体能通过对富含细胞骨架标本的凝胶电泳免疫反应，识别非共有的角蛋白表位，但并不一定说明这些单克隆抗体能通过组织学方法成功测定角蛋白的免疫表型。因而还不能肯定这些单克隆抗体对上皮组织肿瘤的进一步分类具有价值，这里不作一一介绍。但是，对已明确知道其免疫反应类型的某些抗体，则可予以使用。比如，对不能识别角蛋白 18 的单克隆抗体，如 AE1特别适合在富含角蛋白 18 的组织（如肝脏）中弄清是否存在肿瘤性上皮细胞，因为只有肿瘤细胞才能被染色。又如 CAM—5.2 能够识别绝大多数腺癌。但不能染正常表皮，因此对佩吉特氏病（Paget’s）具有诊断价值。

（二）有关方法学应注意的问题

1．抗体的选择实践证明，角蛋白单克隆抗体较异源性抗血清有更多优点。但应该注意，有些单克隆抗体对大分子角蛋白具有特异性，然而组织固定能破坏其表位。大多数针对小分子角蛋白的单克隆抗体比异源性抗血清显示了高敏感性和特异性。

关于对照问题，参见有关章 节，这里只作扼要介绍。如同每个免疫细胞化学试验一样，角蛋白的免疫细胞化学研究也必须设计适宜的组织对照和抗体对照。组织对照包含以下三方面内容：一是应当应用明确不表达角蛋白的组织作为理想的阴性对照，如纤维母细胞、血管和淋巴细胞。这一目的在同一组织切片上即可达到，并且不会受到因重取标本时固定或处理过程不同等因素的影响；二是在某些标本中，残存的正常上皮组织可能作为阳性对照。此外，可以设计含有多种肿瘤或正常组织的石蜡包埋的组织块，亦可达到一举多得的目的。抗体对照时，一般应当采用与第一抗体同免疫球蛋白、同浓度的无关单克隆抗体作替代试验。

2．交叉反应问题由于中间丝有很多分子同源现象的共有区域，因此有些抗血清甚至单克隆抗体表现了对其它中间丝的反应性，但仍以异源性抗血清多见。在与角蛋白有关的交叉反应中，已经注意到有些上皮性肿瘤可以同时表达角蛋白和波形蛋白。但未分化癌的这种表达却十分罕见，即使见到，广反应性角蛋白的阳性反应远比波形蛋白强得多。此外，尚有个别角蛋白单克隆抗体，如 KA4, 偶可与神经胶质原纤维酸性蛋白（glialfibrillary acidic protein, GFAP）有交叉反应。由于肿瘤恶性转化中某些无关抗原的异常合成，也要予以考虑。总之，避免交叉反应所致的错误，诊断或鉴别时最好使用一组有关抗体，而不是仅用一个抗体。

3．显示角蛋白固定剂的选择与蛋白酶消化福尔马林固定有时可以破坏或遮蔽角蛋白的抗原决定簇。实践证明，酒精固定对保存角蛋白的抗原性优于甲醛固定，且不必消化。用蛋白酶消化以暴露其抗原决定簇，能提高免疫细胞化学的敏感性，但对某些肿瘤却有增加与其它中间丝的交叉反应的可能性。与消化有关的其它具体方法问题请见有关章 节。

二、器官特异性及其它瘤标记物如前所述，若我们把角蛋白视为上皮性肿瘤的共性免疫标记物，则对不同器官的上皮性肿瘤具有特别或优先识别作用的标记物，可看作为器官特异性或相对特异性标记物。经过长期实践的检验，一些上皮器官特异性标记物已为人们所接受。此外，也发出了一些效果较肯定、特异性较好、诊断作用较明确的新的标记物。现将其生物化学本质、肿瘤表达情况及诊断应用附表如下（表 12-5），并将其在上皮组织肿瘤病理诊断中的作用分别予以扼要介绍。此外，考虑到对某些肿瘤标记物的生物化学性质及叙述的方便，对少数具有上皮广谱性的标记物也在此介绍。

表 12-5 其它常用的上皮性肿瘤标记物

生物化学组成标记物名称相关肿瘤糖蛋白CEA结肠癌，乳腺癌等AFP肝细胞癌，生殖细胞肿瘤EMA上皮性肿瘤等PSA前列腺癌粘蛋白CA15-3乳腺癌CA125卵巢癌CA19-9胰腺癌等CA50酶PAP前列腺癌NSE神经内分泌癌激素及有关物质TG甲状腺腺癌降钙素甲状腺髓样癌※：标记物名称英文缩写及中文全名参见本节 有关部分。

（一）上皮膜抗原上皮膜抗原（epithelial membrane antigen,EMA）是从人乳脂小球膜（human milkfat globules）上分离的糖蛋白的总称。针对此种抗原的抗体除了包括 EMA 抗体外，HMFC–2 和 CA15–3 也属于该家族之中。EMA 免疫细胞化学定位主要在细胞膜上，故得此名。EMA 在 Zenker、Bouin 或 B5 等固定液中保存良好，在 10% 缓冲中性福尔马林溶液、石蜡包埋的组织中也能很好地被检出。常规福尔马林溶液固定的标本，经消化后也可满意检出。

EMA 广泛分布于各种类型的正常上皮。虽然发生肿瘤时 EMA 的含量增加，其分布与正常上皮的分布也有所不同，但因在炎性或良性增生性病变时的含量也增加，因而借此不能或难以达到区分良恶性肿瘤的目的。但因 EMA 常存在于分化差的和未分化的肿瘤，一般不见于间叶组织肿瘤，所以它可作为上皮性分化的可靠标记物。应该说，也是一种上皮组织的共性标记物。因此，除腺癌，鳞状细胞癌及移行细胞癌均可表达 MEA 外，其它具有上皮分化的肿瘤，如滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、间皮瘤及上皮型脑膜瘤等亦 EMA 表达。此外，在某些特殊类型的恶性淋巴瘤，也可有 EMA 表达，在鉴别诊断时应特别注意。至于 HMFG- 2 和 CA15-3，一般认为前者可做为乳腺癌的良好标记物，后者则不能，因在其它肿瘤也有表达，故不具有诊断价值，但对判断乳腺癌预后可能有所帮助。

（二）桥粒蛋白最初，桥粒蛋白（Desmoplakins）是从牛鼻表皮细胞分离出的大分子蛋白质。目前主要有 6 种大分子蛋白成份与桥粒有关，其中，两种分子量分别为 250000 和 215000 者，称作 Desmo-plakinⅠ、Ⅱ，尚有多肽带 5（polypeptide band 5）和三种糖基化多肽（多肽带 3 和 4a、4b），前三者定位于桥粒区。DesmoplakinⅠ和多肽带 5 存在于所有形成桥的上皮，Desmoplakin Ⅱ仅存在于复层上皮。目前已有商品化抗体可供使用。

与角蛋白抗体相比，桥粒蛋白抗体有一定优越性。一是因为它们表现出分布于细胞外周的特殊免疫染色类型，尤其在显示角蛋白等胞浆蛋白成份的信号较弱时，易于与其它反应背景相区别；二是 desmoplakins 在脊椎动物进化中具有相似的高度稳定性，而不像细胞角蛋白是一个多基因调控的大家族，对不同上皮、不同类型癌有着不同的表达。所以，Desmoplakins 对确定上皮本质是可靠的标记物。在肿瘤鉴别诊断中除绝大多数癌阳性表达外，各类型脑膜瘤及卵巢颗粒细胞瘤等也可表达桥粒蛋白。在正常组织的表达此外不作介绍。

（三）癌胚抗原癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是人们熟悉的肿瘤标记物之一。最早是从结肠癌中分离的一种糖蛋白，分子量为 180～200lkD，存在于细胞膜上，故易于脱入人体液之中。因此，临床上常常测定血清中的 CEA 水平帮助建立肠癌的诊断。但应该指出的是，随着大量资料的积累，已发现很多非恶性病亦可有血浆 CEA 水平的升高，包括肝脏、消化道、乳腺、肺及肾脏等器官的良性疾病，甚至吸烟亦可引起 CEA 的升高。因此，对于建立恶性肿瘤的诊断，只在参考价值。并且，在已明确的恶性肿瘤之中，CEA 的升高也不仅限于结肠直肠癌，在很多其它肿瘤，如肺癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、甲状腺癌、宫颈癌及乳腺癌等都有 CEA 的升高。总的来说，CEA 可以做为上皮性肿瘤的标记物，而不是某一种癌瘤的特异性标记物。

(四)甲胎蛋白甲胎蛋白 (Alpha-fetoprotein, AFP) 是含有一条多肽链、分子量为 70kD 的糖蛋白。因在早期脐带血中被检出而得名。如 CEA 一样，AFP 也是研究得最为充分的肿瘤标记物之一，在筛选高危肝细胞癌患者中已经得到了成功的应用。然而，AFP 的升高并不只是原发性肝细胞癌所特有，也可见于生殖细胞肿瘤，以卵黄囊恶性肿瘤和睾丸胚胎性癌最多见。同时还应指出，在 10～35% 的非恶性肝脏疾病中，如肝硬变和肝炎，也可有轻到中度 AFP 升高。免疫细胞化学研究发现，AFP 是一种胞浆抗原，在细胞内的分布可表现为胞浆、包膜型、核周型或局限型，主要存在于中等分化的肝细胞肝癌。在肝母细胞瘤中也经常出现，但在胆管细胞癌中未能检出 AFP。因此，对区别肝细胞癌和胆管细胞癌有重要作用。

（五）前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酯酶前列腺特异性抗原（Prostate-specificantigen,PSA）是由前列腺腺泡和导管上皮细胞产生的、分子量为 33～34kD 的一种糖蛋白，对正常、良性病变和前列腺癌组织均具有特异性。前列腺酸性磷酸酯酶（Prostateacid phosphatase, PAP）是前列腺分泌的正常成份，具有水解酶的功能。PAP 的升高与前列腺癌的分期有关。它不仅出现于前列腺癌，在其它组织也可出现，因此，PAP 作为前列腺癌的肿瘤标记物的作用是有限的。PSA 的免疫细胞化学研究表明，PSA 抗体可以成功应用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织中。阳性反应位于上皮细胞的胞浆内，且在核周较强。但阳性反应的强度可随细胞与细胞、区域与区域以及原发性与转移性前列腺癌而不同。文献报道，对较多原发性和继发性前列腺癌病例以及非前列腺癌的研究发现，前两者都明确表达 PSA，而后者无 1 例 PSA 阳性。鉴于此，PSA 不仅能用于前列腺低分化腺癌的诊断而且对明确其它器官或部位的转移性前列腺癌也具有十分重要的作用。此外，鉴于前列腺和膀胱在解剖学上的密切关系，PSA 对区分波及两个器官的肿瘤来源也和很有帮助。鉴于此上理由，PSA 是比 PAP 更为优越的前列腺器官特异性肿瘤标记物也是目前公认的肿瘤特特性标记物之一。

（六）CA19- 9 及 CA50CA19- 9 是由结肠癌细胞株免疫小鼠所获的单克隆抗体的识别抗原。此种抗原是表达于癌细胞膜和胚胎性胃肠道上皮组织的糖脂和粘液成份。与 CA-19- 9 有关的另一粘蛋白是 CA50，其抗原表达谱与 CA19- 9 相似。血清中 CA19- 9 的升高可见于多种肿瘤，如胆道癌、胃、结肠与直肠癌，但升高幅度最大、机率最多的是胰腺癌。然而遗憾的是，在急慢性胰腺炎及其它良性病变也可有明显升高。

（七）CA125CA125 是从卵巢浆液性囊腺癌细胞株所获的抗原。分子量约 500kD，表达于胚胎性体腔上皮组织。免疫细胞化学研究表明，CA125 抗体能与 80% 以上的卵巢上皮性肿瘤起反应，但在非妇科肿瘤甚至某些正常组织，如胰腺，也能反应。血清 CA125 不仅在其它恶性肿瘤，如子宫癌、乳腺癌、肝癌、肺癌及胰腺癌等可以升高，而且在消化道、妇科的良性疾病也有升高。因此，CA125 不能作为满意的肿瘤筛选工具。但是，CA125 对判断卵巢癌的分期、进展或消退有较大的指导作用。

（八）神经元特异性烯醇化酶烯醇化酶催化 2 - 磷酸甘油酸与磷酸烯醇式丙酮酸转化的糖酵解酶。它有三种同工酶形式。其中 α 和 β 分别于脑和肌肉细胞。而 γ 烯醇化酶，即 NSE，主要在神经元，与恶性肿瘤有关。在上皮恶性肿瘤中，血清 NSE 的升高主要见于小细胞肺癌、胰岛细胞癌，并与部分小细胞肺癌的进展有关。此外，NSE 在其它上皮性神经内分泌肿瘤，如皮肤 Merkel 细胞癌、甲状腺髓样癌、类癌等也呈阳性表达。

（九）甲状腺球蛋白和降钙素甲状腺球蛋白（Thyroglobulin, TG）是由甲状腺滤泡上皮细胞产生的大分子糖蛋白。甲状腺的良恶性疾病，包括结节 性甲状腺肿，突眼性甲状腺肿、亚急性甲状腺炎、甲状腺腺瘤和甲状腺癌都可引起血清 TG 升高。因此，对区分甲状腺的良恶性结节 没有价值。在某些其它恶性肿瘤，如乳腺癌和肺癌，血清 TG 可以升高，但一般不会超过 100ng/100ml 水平。TG 的免疫细胞化学表明，不论原发性或转移性甲状腺癌的类型为何（滤泡或乳头状腺癌），都为 TG 阳性表达，只是随分化程度不同而表达强度不同，髓样癌则为阴性反应。由此可见，TG 对鉴别上述两种肿瘤具有肯定价值，是较好的器官特异性肿瘤标记物。

降钙素（calcitonin）是甲状腺 C 细胞产生的调节 血清钙的肽类激素。虽然在非恶性疾病和其它恶性肿瘤也有升高，但在甲状腺髓样癌患者血清中常有显著升高，因而降钙素仍不失为甲状腺髓样癌的良好标记物。

（十）血型抗原血型抗原（Blood group antigen, BGA）是一组存在于细胞表面的糖脂。目前已检出的有 A、B、H、Leb、Lea、M、N、P 等十余种，其中以 A、B、H 系统的抗原为最强。血型抗原除未在神经组织、结缔组织及肌肉组织发现外，几乎分布于机体所有正常细胞膜，只是在不同器官含量不同。

随着细胞的恶性转化，BGA 的异常表达表现在下述两个方面：一是某种 BGA 的明显丢失或丢失；二是出现正常时不能测出的抗原。这种抗原表达的异常是由于肿瘤细胞不能完全合成低聚糖链等因素所致，在研究恶性肿瘤中具有很重要的价值。长期以来，人们对消化道腺癌、泌尿系移行细胞癌等做了大量研究。以移行细胞癌为例，上述异常表达表现 BGA 的丢失主要涉及 ABH 系统，而抗原出现表现为 T 抗原的表达。概括起来，BGA 的异常表达在肿瘤发生与诊治的研究中具有以下四方面的作用：

（1）有助于判断肿瘤的良恶性。一般而言，良性增生细胞大多保留其 BGA，而恶性肿瘤细胞常表现为不同的 BGA 的减少或消失或出现异常表达。但最近研究发现，在良性病变中，偶可发生 BGA 丢失。如多形性腺瘤常发生 H、A 丢失及 Le（Y）表达减少。在肝脏疾病的研究中出发现，Le(X)抗原不仅可以出现在肝细胞肝癌和胆管细胞癌，在不同类型的肝硬变也为阳性表达，而正常肝细胞为阴性。

（2）有助于判断肿瘤的浸润与转移能力。BGA 消失的肿瘤易于发生浸润与转移。

（3）肿瘤 BGA 保留与否，可以判断患者的预后，保留者预后好，否则预后不良。

（4）可以预见癌前病变的发展趋势。如在食道癌的癌前病变研究中发现，增生的基底细胞及不典型增生的上皮细胞常有 Le（Y）的持续阳性表达。BGA 与肿瘤病理生物学关系的研究，已经历了很长时间，并取得了大量有实用价值的结果，预计今后仍然会获得新的发现。

总之，在上皮性肿瘤标记物的研究中，共性标记物已经得到了广泛而成功的应用，满意的器官特异性免疫标记物为数却很少，其中以 PSA 较为理想。为了解决临床病理工作中常常遇到的难以明确转移性低分化肿瘤原发部位的问题，这方面仍需不断深入研究。同时应该指出，在上皮组织肿瘤的鉴别诊断中，除使用上皮性标记物外，常应同时使用 LCA、NSE 等标记物，以从不同角度取得证据，具体内容参见本章 有关部分。此外，涉及上皮组织肿瘤的标记物也不止本节 所介绍的内容，新的标记物不断出现。对文献报道不多、正在研究的与上皮组织肿瘤有关的标记物，如组织多肽抗原（Tissue polypeptide antigen）等本节 暂时不介绍。

（黄高升）

参考文献1．Trojanowski JQ,et al. An immunohistochemical study of human central and peripheral nervoussystem tumors, using monoclonal antibodies against neurofilaments and glialfilaments. Human Pathol. 1984;15:248

2. 罗欣鸣，等. 星形细胞瘤的免疫组织化学研究. 中华病理学杂志,1993;22(2）:95

3. 连锦英胡瑞德李瑛. 胶质纤维酸性蛋白和 S—100 蛋白在脑膜中的分布及其在诊断中的作用. 中华病理杂志.1987;16(1):11

4.Osbor11M, et al.Tumor diagnosis by intermediate filament typing, a novel tool for surgicalpathology. Lab lnvest. 1983,48:372

5. 刘开凤. 免疫组织化学在外科病理学中的应用. 中华病理学杂志,1990,19(2):148

6.Erlandson RD. Diagnosticimmunohistochemistry of human tumours. Am J Surg Pathol. 1984, 8:615

7.Gatter K, et al. Whichantibodies for diagnostic patnology. Histopathol.1987,11:661

8.Kahns HJ, et al. Role ofantibody to S-100 protein in diagnostic pathology.Am clin Patnol. 1983, 79:341

9. Loeffel SL, et al. Celluarimmunolocalization of S-100 Protein within fixed tissue section by monoclonalantibodies. Arch pathol Lab Med. 1985,190:117

10. 谭郁彬. 弥漫内分泌系统病理研究进展. 中华病理学杂志,1990,10(2):81

11.Delellis RA. Multidirectionaldifferentiafion in neuronedocrine neoplasms.J Histochem Cytochem, 1984, 32:899

12. 张福林. 等. 垂体腺瘤的功能分类研究. 中华病理学杂志,1990,19(2):97

13. 张晓军, 等. 垂体 ACTH 细胞腺瘤的免疫电镜研究. 中华病理学杂志,1990,19(2):100

14. 刘冬弋, 等. 垂体多激素腺瘤的免疫电镜研究. 中华医学杂志,1993,73(4):223

15. 李维华, 等. 肺癌超微结构分类的研究. 中华病理学杂志,1992,21(5):262

16. 冼美生段惠军. 七例食道燕麦细胞癌的临床病理分析及超微结构观察. 中华病理学杂志,1988,17(4):292

17. 刘鸿瑞, 等. 肺原发性小细胞癌超微结构及免疫细胞化学的研究. 中华结核和呼吸杂志,1988,11(5):285

18. 吕宁, 等. 皮肤神经内分泌癌 (Merkel) 细胞瘤. 中华肿瘤学杂志,1992,14(6):452

19.Silva EG, et al.Immunohistochemical studies in endocrine carcinoma of the skin. Am J Clinpathol, 1984,81:558

20.sibley RK, Dahl D. Primaryneuroendocrine carcinoma of the skin:An immunocytochemical study of 21 cases.Am surg pathol, 1985,9:109

21. Gould VE. et al.Neuroendocrine (Merkel) cells of the skin: hyperplasia,dysplasia, andneaplasms. 1985,52(4):334

22. 蔡文琴王伯沄, 主编. 实用免疫细胞化学. 成都: 四川科学技术出版社,1988

23. 刘彦仿主编. 免疫组织化学. 北京: 人民卫生出版社,1990

24. Boulag CHE,DU,Immunohistochemistry of soft tissue tumors:A review. J of Pathol,1985;146:77～94

25. Corson JM, et al .Intracellular myoglobulin: A specific marker for skeletal muscledifferentiation in softtissues sarcomas. Am J Pntlol,1981,103:384

26. Tosokos MD.Immunohistochemical study of alueolar and embryonal rhabdomyosarcoma. LabInvestigation, 1983; 48:148

27. Leong AS-Y, et al. Expressionof cytonecatin and vineutin intermediate filaments in epithelial neooplasms: acorrelalion of immunocytochemical and ultrastructural findings. Proc th Asia –pacific confecence and workshop on eletcon microscopy. Bangkok, 1988:711

28. 赖日权罗祝和安建成, 等. 恶性上皮性肿瘤角蛋白和波形蛋白的表达. 中华病理学杂志,1990;19:119

29. 张建中.S-100 蛋白在神经嵴起源组织及其肿瘤中的分布. 实用肿瘤杂志,1988;2:109～112

30. 赖日权安建成彭保, 等. 横纹肌肉瘤病理形态及免疫组化观察. 中华肿瘤杂志,1989;11:184

31. 潘传敬汪感贤陈志远, 等. 间变型脑膜瘤的超微结构及免疫组织化学观察. 中华病理学杂志 1992;21:224～226

32. 高奉浔李增鹏苏红. 骨肉瘤组织学特点和免疫组织化学的研究. 第三军医大学学报,1993;15(3):223～227

33.Tubbs RR. Sheibani K.Immunohistology of lympho – proliferative disorders.Seminrs in diagnosticpathol. 1984, 1:272～284

34. Aisnberg Ac. Current eonceptsin immunology, Cell surface markers in lymphoproliferative disease. N Eng JMed, 1979,301:512～518

35.Bo – Yec Ngan et al.Immunophenotypic diagnosis of non- Hodgkin’s lymphoma in paraffin sections (L60(Leu22)andL26antigen expnes-sion). Am JClin Pathol. 1989,91:579

36. Hsu SM, Ho ys, Hsu plLymphomas of lace hisliocylic origin. Am J Pathol.1991,138:1389～1404

37.Boulag CEH, DuImmunohistochemistry of soft tissues tumors: J of Pathol,1985;146:77～94

38. von Kleist S. What’s New inTumor Markers and their Measurements? Path Res Pract, 1988;183:95～99

39. Jacobs EL and Haskell CM.Clinial use of tumor markers in oncology.Current Problems in Cancer Mosby- Yearbook, Inc. 1991: pp301～360

40.Delellis RA. Advances inImmunohistochemistry. First ed. Raven Press New York, 1988;pp191～221

41. Javadpour N. Tumor Markers.First ed. Praeger New York Westport,Connecticut, London. 1987

42. Herberman RB and Mercer DW.Immunodiagnosis of Cancer. Second ED. Marcel dekker. Inc. New York, Basel HongKong. 1990

43. Fenoglio – Preiser CM,Weinstein RS and Kaufan N. New Concept in neoplasia as applied to diagnosticpathology. William & Wilkins Baltimore,London, Los Angeles, Sydney. FirstEd. 1986:pp225 ～241

44.Moll R, cowin P, Kapprell HP,et al: Desmosomal protein: New markers for identification and classification oftumours. Lab Invest, 1986;54：4～25

第十三章 消化器官免疫细胞化学自 1966 年 Crabbe 首次应用免疫荧光技术进行胃粘膜抗体产生细胞研究以来, 随着临床上纤维和电子内窥镜普遍应用, 能通过活检取得新鲜组织标本, 取材方便, 材源丰富, 为深入开展免疫细胞化学和组织化学技术对消化道疾病的研究起了重大的推动作用。消化道直接与各种口服抗原接触，是局部粘膜免疫反应场所和中枢器官，也是炎症、溃疡、感染和肿瘤等病变的好发部位。用免疫细胞化学和组织化学对分泌性 IgA（SIgA）和各种抗体分泌细胞、T 淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞等免疫细胞和组织相关抗原等的研究，观察胃肠道疾病与局部免疫反应的关系，对进一步探讨某些疾病的病因、诊断和治疗有重要价值。胃肠道分泌的各种酶对食物的消化和吸收起重要作用。用免疫细胞化学研究胃蛋白酶、乳糖酶、溶菌酶等酶类的分布和定位对探讨消化性溃疡、腹泻和消化吸收不良综合症等疾病有重要临床价值。免疫细胞化学技术还能对消化道内分泌激素细胞和肽能神经准确定位，也能确定 CEA，CA125和 AFP 等消化道肿瘤相关抗原和肝炎病毒等致病性抗原的产生和分布。随着单克隆抗体技术的应用和免疫细胞化学技术特异性和敏感性的提高，必将加速消化道疾病的病因和诊治研究的迅速发展。

第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点胃肠道与外界相通，其粘膜表面附着各种细菌和病毒。粘膜含有各种组织溶解酶，而且胃粘膜呈酸性，肠粘膜偏碱性，因此在进行免疫细胞化学染色过程中，必须注意以下几个环节：

一、抗原的稳定性免疫细胞化学和组织化学就是检查、鉴定、定位和示踪组织中各种抗原成分。在组织加工过程中，必须保持抗原的形态、结构、抗原性和在组织中的位置保持不变，不引起组织产生自发荧光及其它非特异性着色。原则上越新鲜的组织越适于进行免疫细胞化学和免疫组织化学研究。

1．组织切片标本经胃镜、小肠镜和大肠镜等内窥镜取材可以在直视下根据研究的内容在不同部位进行取材，即准确又方便。一般组织块直径多在 0.5～1.0mm 左右，适合进行各种抗原的研究。

（1）取材方法：将取材部位调整到内窥镜视野中央，使活检钳与粘膜面垂直，然后钳取。活检钳应尽量下压深取达粘膜全层。取出活检钳并打开活检器时要轻，防止粘膜撕裂。立即将活检组织轻轻在粘在滤纸上，并尽量使粘膜面与滤纸平行。

（2）组织固定：根据所查抗原的种类采取相应的固定方法。我们的体会是：对某些蛋白类抗原，如免疫球蛋白、SC、CEA 等一般用 95% 冷酒精固定较好。95% 乙醇不但能固定蛋白抗原，而且保持与抗体的免疫反应能力，同样可以进行 HE 染色。除组织有部分收缩外，组织成分和抗原位置没有大的改变，组织块可以在冰箱内长期保存。我们对保存 26 个月的冷酒精固定组织进行 CEA 和 SC 的研究，效果仍很好。对多肽类激素的研究可以用 4% 多聚甲醛缓冲淮，Bouin 缓冲液或福尔马林缓冲液进行固定，或直接液氮固定后冷冻切片。冷酒精固定的组织不宜进行多肽类激素的研究。对陈旧性福尔马林的固定的组织可以在抗原表面形成蛋白衣，直接影响抗原抗体反应。有人用胰酶消化后暴露抗原部位，进行胃泌素细胞的免疫细胞化学染色，也获得较好结果。要进行胃肠道多肽类神经的免疫组化研究，可用含 Triton 的固定液和冰冻切片。对小白鼠等动物可向血管内注射多聚甲醛等固定剂，然后处死取材。进行细胞膜抗原的单克隆抗体研究时最好用 Cryostat 冰冻切片，然后丙酮或乙醇固定 10min 左右。

（3）组织加工：温度对抗原抗体均有影响。一般在 4 ℃进行脱水和透明。包埋选用低熔点蜡（52℃～56℃），浸蜡时间以 20min 左右为宜（因组织块较小）。脱蜡和脱二甲苯也应在低温下进行。

（4）组织保存及切片：石蜡包埋或其它方法加工后最好立即进行切片和免疫细胞化学染色。根据不同的抗原也可以在低温下保存一段时间后再染色。组织切片的免疫细胞化学染色实际上使切面的抗原暴露后直接与抗体相结合，一般组织切片厚度以 5～7μm 为宜。如果观察神经纤维则以 10～20μm 为好。太厚则透射光不易通过，影响观察，易出现自发荧光。如果进行免疫电镜观察，最好超薄切片。

2．涂片或印片标本拉网和内窥镜下获得的胃肠道分泌物等可直接涂片，空气干燥，再用乙醇固定后进行免疫细胞化学染色。涂片和印片缺乏明确的组织结构，标本中常常混有不同形态的组织细胞和其它蛋白等无定形成份，很容易造成假阳性，观察时应当特别注意。

3．组织分离细胞将手术或活检组织块用机械研磨或胶原酶消化等方面可分离出细胞，加入培养基，在试管内进行活细胞免疫荧光或免疫酶等免疫细胞化学染色。流式细胞仪进行定量和定性分析。此法对细胞膜抗原的研究有较大价值。我们在试管内用免疫荧光技术对周围血分离的单核样细胞进行 T 淋巴细胞亚群和 B 淋巴细胞的研究中，发现 OKT3、OKT4、OKT8和 Ia 的荧光均分布于细胞膜，随着细胞的滚动，犹如火球，非常清晰。

二、抗体的特异性示踪抗原的抗体必须具有高度特异性，尽量减少非特异性染色和干扰。因此染色前必须测定抗体的工作效价，并用严格的阳性对照。组织切片应当有连续切片的 HE 染色作对照。

三、染色技术的选择性应当根据设备条件，具备的抗体和示踪抗原的特点进行选择。我们的经验是：因胞浆性抗原含量较多，可以用简便和廉价的间接法甚至直接法免疫细胞化学染色；对膜抗原及其它一些微量抗原应当选用 PAP 或 ABC 法，如果同时进行两种以上抗原的检查，最好进行双标记和多标记免疫细胞化学染色；为了显示较弱的抗原，可以用对比染色技术，背景为另一种颜色，使阳性抗原着色更突出。

四、结果的可比性1．如研究胃粘膜中抗体产生细胞应当掌握在 HE 染色时的车轮状核位于胞浆一侧，胞浆特别丰富，染色时仅胞浆着色而核不着色等特点。同时应了解所研究的抗原在组织中的大致定位及分布规律。如分泌 5 - 羟色胺的内分泌细胞多位于固有层间质内，VIP 和 SP 分布在固有层神经末梢及粘膜下层的神经元，胃泌素细胞分布胃肠腺体细胞之间。CEA 多分布在腺癌细胞，如果在固有层内出现阳性细胞，要谨慎对待，必须排除污染、内源酶或自发荧光，同时与连续切片的 HE 染色切片对比观察才能作出判断。

2．阳性结果的定量分析免疫细胞化学和免疫组织化学染色受到的影响因素较多，最好在相同组织加工方面、统一批号抗血清和标记抗体、统一染色技术和结果判定方法，同时对病态和正常组织进行对照观察才能增加可比性。用免疫组织化学进行抗原定量分析时，可根据着色程度，选用某一基点为标准进行半定量计数，但容易受主观因素的影响。近年来，数字减影技术的应用，大大提高了定量研究的准确性。对阳性细胞的计数，多采取以下几种方法：

（1）直接计数法：以 10～20 个随意选择的高倍视野直接进行阳性细胞计数，或计算 100～200 个总细胞中阳性细胞的数量。由于阳性细胞分布的不均匀性，可能存在一定误差。

（2）体积计数法：测定单位面积内的细胞数，再算出每立方毫米体积内阳性细胞总数。一般组织切片只有 5～7μm 厚，与 1mm 厚度组织切片的细胞密度不可能完全一致。

（3）细胞密度计数法：即计算单位粘膜面积的阳性细胞数。有人提出以 0.5mm 宽，粘膜切面会层（约 0.6mm）作为一个单位。因内窥镜取材时，组织块不规则，显微镜下要具体选择有一定困难，。我们用改良的 Dellesses 公式进行计算比较方便。原公式 NV=N（P∑r2）×109，NV 代表每立方毫米体积细胞数；N 代表细胞总数，r 为测微器小方格边长（μm）；∑为切片厚度（μm）；P 为小方格数。我们只计算每平方毫米面积细胞数，即 D =N/（P∑r2）（r 单位为 mm）。方和边长为 0.5mm 的测微器放在目镜下，物镜放大 4 倍，即用测微器去量放大 4 倍的物体，测出的边长必须缩小 4 倍才是物体的真正面积，已知 r 为 0.5mm，将上述数据代入公式，得 D =N（r/4）2=16N/(Pr2)=16N/(P(0.5)2)=64N/P。只要计算整个组织切片的细胞数和所占小方格数，即可得出阳性细胞密度（细胞数 /mm2）。组织分离细胞可通过流式细胞仪进行计数。

第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞一、抗体产生细胞的特点抗体产生细胞（Antibody – producing cell）即光镜下所见浆细胞。有的呈圆形，核居中（称之为淋巴样浆细胞、幼浆细胞或过渡型浆细胞），也有的呈椭圆形，核偏于一边（称为典型浆细胞）。它们都具有丰富胞浆（HE 染色呈红色），能产生和分泌各种抗体。一个成熟浆细胞只能分泌一种抗体。胃肠道粘膜中的各种抗体多由局部抗体产生细胞所分泌。一般认为骨髓的多潜能干细胞转化成细胞表面具有 IgM 和 IgD 标记的成熟 B 淋巴细胞后进入粘膜层或粘膜下层的散在淋巴滤泡或 Peyer 斑的生发中心。胃肠腔内抗原通过其靠腔面的 M 细胞进入粘膜固有层，通过巨噬细胞和树突状细胞将抗原加工后传递至生发中心，在转化生长因子 β(β-trans-forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN 和抗原刺激下 B 淋巴细胞增殖并转移化成细胞表面含 IgG、IgA、IgE 等特异性 B 淋巴母细胞，一部分直接分散在固有层，大部分经淋巴细胞再循环返回胃肠道粘膜，在 IL- 2 和 IL- 6 刺激下转化成抗体产生细胞，分泌特异抗体，发挥体液免疫反应。因此测定粘膜中抗体产生细胞的分布对进一步认识局部体液免疫反应与胃肠道疾病的关系有重要意义。

二、双标记免疫荧光染色抗体产生细胞胞浆内含有相对多的抗原，故采用直接或间接法免疫细胞化学技术可简化步骤，节 省时间，降低成本。为了清除组织间弥散的免疫球蛋白，我们在固定前用 PBS 浸洗，取得良好的效果。用双标记免疫荧光技术可以在同一张切片上显示出两种不同的抗体产生细胞。

1．组织加工根据研究目的的内窥镜直视下钳取胃、小肠或结肠粘膜。将取得的组织立即放入含 4 ℃，pH7.2、0.01mol/l PBS 烧杯内搅拌 10～18h 后直接放入 4℃、96% 乙醇中固定。在 4℃环境下继续脱水和透明，56℃浸蜡和包埋，石蜡块冰箱保存。组织切片后，37℃温水展平，载片后干燥，装干燥盒置于冰箱，可以保存 1 周左右。4℃脱蜡和脱二甲苯，PBS 洗涤后蒸馏水清洗，风干待染。

2．荧光素标记抗体 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate, FITC）标记抗体的具体步骤详见第三章。在标记络丹明 B200（lissamine rhodamin B200,RB200）时应注意：

（1）PCI5极易吸收水份放出烟雾样刺激气体，RB200 和丙酮混合后搅拌时也放出有毒的 SO2Cl 刺激性气体，故操作时最好在通风橱内进行。在室外操作时应戴口罩。

（2）丙酮极易挥发，一定要在密闭容器（如带盖的青霉素瓶）内搅拌。吸取丙酮时也要动作迅速。

（3）在标记过程中，RB200 能产生 HCl，容易使蛋白变性，必须用较多碱性缓冲液中和。具体步骤是：

①按 50mg 蛋白需 10mg RB200 和 20mg PCI5的比例分别准确称取 PCl5和 RB200，放入青霉瓶内。经橡皮塞穿入玻棒拌混合 5min。

②用吸管吸取 0.5ml 左右丙酮迅速注入瓶内，继续搅拌 5min 形成紫褐色溶液（A 液）。

③1 份抗血清（含蛋白 10～20mg/ml）用等量或 2 份 0.5mol/l p9.5 碳酸缓冲液稀释后在 4 ℃冰箱内用磁力搅拌器边搅边加入 A 液，并用混合液反复冲洗青霉素瓶内的 A 液，直至干净为止，然后继续搅拌 30～60min。

④称取相当于蛋白半量的活性碳加入混合液内继续搅拌 60min 后，以 4000r/min 离心 30min 除去活性碳。

⑤用 30%～50% 饱和硫酸铵盐析 1 次，去上清液，沉淀物用少量 PBS 溶解，过 G -25 层析柱去除硫酸铵即得 RB200 标记的抗体。

⑥RB200 的最大吸收光谱为 570。用分光光度计分别测定 570nm（RB200）和 280nm（蛋白）的读数，根据 Wells 表算出 F / P 克分子比值。

⑦效价高的标记抗体加 0.1% NaN3或硫柳汞（0.1%）数滴防腐，分装放置 20℃以下可长期保存，4℃～10℃能保存半年左右。

3．染色步骤染色前进行对照试验、吸收试验和抑制试验，测定抗体的纯度和特异性，同时以琼脂扩散和染色效果确定工作效价。在连续切片中，用 RB200 标记的 IgG 稀释液分别与 FITC 标记的 IgA 和 IgM 混合（根据染色效价，分别以对方为稀释液）进行染色。在 37℃温盒内孵育 45min，PBS 清洗，过一次蒸馏水后风干，50% 缓冲甘油封片，在冰箱中可保存 10 天左右。

4．阳性结果观察及细胞计数用 Olympus 荧光显微镜观察。选择 BG12激发滤板和 0515 抑制滤板可同时观察两种荧光。胞浆丰富、明显绿色荧光、核不着色的细胞为 IgA 或 IgM 产生细胞；胞浆红色荧光者为 IgG 产生细胞。少数胞浆黄色荧光的细胞核呈圆形，位于细胞中央，可能这些 B 淋巴母细胞能产生两种抗体，也可能是具有共同的轻链而引起的交叉反应。如果用 α、β、γ、μ、δ 等重链单抗进行研究，可以进行鉴别。在荧光显微镜下数出组织切片中阳性细胞总数（N），测微器放在目镜下测出组织切片所占小方格数（P）。测微器小方格边长为 0.5mm, 根据物镜放大倍数（4 倍）用公式 D =64N/ P 计算出每平方毫米组织切片中所含细胞数。

三、临床意义抗体产生细胞主要分布在粘膜固有层。IgA 产生细胞多沿上皮层分布，IgG 和 IgM 产生细胞分布全固有层。小肠粘膜含抗体产生细胞增多，胃和结肠其次，食管最少。小肠粘膜中 IgA、IgM、IgG 产生细胞比例为 81.9:15.7:2.5,IgA 产生细胞最多，IgG 产生细胞最少。结肠粘膜中抗体产生细胞分布与小肠相似，但 IgM 和 IgG 产生细胞数增加。对于胃粘膜各家报道不一。多数认为 IgA 产生细胞最多，IgG 产生细胞其次，IgM 产生细胞最少，胃体和胃窦无显着差异。我们的结果与国外报道一致。正常胃肠粘膜中 IgD 产生细胞极少，IgE 产生细胞仅占 2%，胃粘膜中多于结肠粘膜。这些抗体产生细胞分泌的抗体在粘膜局部免疫起着极其重要的作用。某些消化道疾病与抗体产生细胞数量、分布和比例的异常密切相关。

1．抗体产生细胞与胃部疾病 70 年代国外就重视慢性胃炎和胃溃疡组织中抗体产生细胞研究。多数报道认为表浅性胃炎以 IgA 和 IgM 产生细胞增加为主，轻度萎缩性胃炎以 IgA 产生细胞增多，可能与细菌或病毒等感染有关。中度以上萎缩性胃炎和恶性贫血病人胃粘膜中 IgG 产生细胞显著增加。部分病人有壁细胞、胃泌素细胞、内因子或胃组织其它成分的自身抗体。IgG 产生细胞增加可能与特异性免疫反应有关。有人将壁细胞抗体阳性病人胃粘膜中分离出 IgG 与壁细胞共同培养，能直接破坏壁细胞。我们的结果还发现，中度以工萎缩性胃炎患者胃粘膜中 T 淋巴细胞和 IgG 产生细胞均增加，提示胃粘膜的萎缩不能排除抗体依赖的细胞毒（ADCC）作用的结果。部位原发性变异性低丙种球蛋白血症患者整个胃粘膜萎缩，粘膜中缺乏抗体产生细胞。对于胃溃疡，有人认为 IgA、IgM 和 IgG 产生细胞均增加，它们之间的比例是相对正常的，但 IgE 产生细胞明显增加（是正常人的 10 倍）。用放射免疫法测定也发现胃溃疡病人血清和胃液中 IgE 浓度也增高。推测 IgE 作用于肥大细胞后释放组织胺类物质在溃疡的病因中起重要作用。

2．抗体产生细胞与胃肠道恶性肿瘤 1977 年日本奥田晃三首次用免疫荧光法对 89 例进展期胃癌的抗体产生细胞进行测定，发现 IgA、IgG 和 IgM 产生细胞均明显减少，且与胃癌的分型和组织分类无关。我们对 48 例胃癌组织用双标记免疫荧光研究发现癌组织中 IgA 产生细胞显著减少，但 IgG 产生细胞显著增加，并有聚集现象；癌旁组织中抗体产生细胞增加更显著，其中 IgG 产生细胞增加 6.2 倍，肠型胃癌中 IgG 产生细胞显著多于胃型胃癌，肿块越大则 IgG 产生细胞越少。Jonder 证实人类肿瘤细胞膜上有 IgG 的 FC 受体。有人将小白鼠肿瘤组织中的 IgG 提取证实为 IgG2，在细胞培养中对癌细胞有杀伤作用。提示 IgG 产生细胞与抗胃癌免疫反应密切相关。我们还发现胃癌组织中 IgA 产生细胞只占 28.5%，癌旁占 40.2%，显著低于正常（55.1%）。IgA 产生细胞减少可导致 SIgA 合成减少，引起粘膜免疫屏障功能失调。也有人认为肿瘤细胞产生某种抑制因子阻碍 IgA 产生细胞进入癌组织内。其确切机理仍在深入研究中。近年来，对肠癌组织中抗体产生细胞研究也有报道。发现癌组织中 IgA 产生细胞也显著减少，癌旁组织中 IgG 产生细胞增加 13 倍。认为与结肠癌特异性抗原或 IgG 的细胞毒作用密切相关。今后的研究在于从组织中分离出抗体的特异性部分在体外或体内直接作用于肿瘤细胞，筛选出能破坏癌细胞的抗体及其基因组，用分子生物学技术扩增，用于肿瘤的治疗。

3．抗体产生细胞与炎症性肠病慢性溃疡性结肠炎（CUC）和克隆氏病是病因未明的肠道感染性疾病。近年来有人发现炎症性肠病与肠道局部免疫反应有关。Golzayd 等发现 9 例 CUC 肠粘膜中 6 例有大量 IgA 产生细胞浸润，认为可能与细菌或病毒感染有关。也有人发现以 IgG 产生细胞或 IgE 产生细胞浸润为主。Persson 等报道克隆氏病的回盲部 IgA 产生细胞减少，IgG 和 IgM 产生细胞增加，有人发现感染严重部位 IgG 产生细胞增加，粘膜完整部位 IgM 产生细胞最多。因此有人提出 IgG 和 IgM 能调节 局部 T 淋巴细胞免疫反应造成粘膜损伤，溃疡是 IgE 调节 的组织胺类物质释放过多和继发感染引起。也有人提出炎症性肠病虽然肠粘膜中抗体产生细胞增加，但细胞比例没有改变。因此炎症性肠病与体液免疫反应的关系仍需要进一步深入研究。

4．抗体产生细胞与慢性腹泻慢性腹泻是消化道常见病，粘膜免疫功能缺陷是重要原因之一。目前认为，不论体液免疫和细胞免疫缺陷，均可引起腹泻同时伴有肠道鞭毛虫、念球菌和霉菌等继发感染，这些病人胃肠道粘膜缺乏抗体产生细胞。虽然部分病人仍有 IgGT 和 IgM 产生细胞分布，但 IgA 产生细胞显著减少或缺如。可见 IgA 产生细胞在胃肠粘膜中起重要保护作用。也有人发现病人胃肠粘膜有不典型抗体产生细胞，产生的抗体很少，可能与缺乏辅助性 T 淋巴细胞有关。对这类病人除给予必要的抗菌素控制继发感染外，定期补充免疫球蛋白制剂或适当使用左旋咪唑和转移因子等 T 淋巴细胞激活剂可能使症状得到缓解。已经有人从乳汁中提取分泌性 IgA 治疗顽固性小儿腹泻获得成功。α- 重链病患者小肠粘膜固有层大量抗体产生细胞浸润，分泌 α - 重链，引起肠粘膜萎缩，也能导致吸收不良和腹泻等症状。

第三节 消化道分泌生 IgA胃肠道产生的分泌性 IgA（SIgA）在其粘膜表面形成重要的免疫保护层能防止抗原性物质进入粘膜，对局部炎症和肿瘤的发生发展起重要作用，也是近年来研究局部粘膜免疫反应的重要课题。

一、S IgA 合成及其功能人体内主要含有两种形式 IgA。一种为 s IgA 单体，主要存在血清中，多来自脾脏、骨髓和肠系膜淋巴细胞的浆细胞。另一种是与分泌成分（secretory component, SC）结合的二聚体，即 SIgA，沉降系数为 11S，主要存在唾液、初乳及胃肠道等分泌液中。成人肠道每天能分泌 3gSIgA。目前多认为胃肠道是 s IgA 的中枢器官。SIgA 由 SC、J 链和二个 IgA 单体组成，形成过程包括：SC 的合成、J 链和 IgA 合成、IgA 与 SC 结合和 SIgA 分泌。SC 是分子量为 83000dalton 左右的糖蛋白，由 549～558 个氨基酸和 20% 糖组成，其转录基因在上皮细胞的第 1 对染色体上。我们用免疫细胞化学染色证实 SC 主要分布在分泌性腺上皮细胞基底侧膜及游离腔面的胞浆内。杯状细胞含 SC 很少。SC 作为免疫球蛋白的受体在 SIgA 的合成中起重要作用。目前已经证实 SC 与胃肠道固有层 IgA 产生细胞分泌的二聚体和 J 链形成二硫键。虽然 40%IgG 和 IgD 产生细胞也含有 J 链，但很快被溶解，故 SC 不能与 IgG 与 IgD 相结合。SC 能与 IgM 五聚体结合，但结构不稳定，易被消化酶破坏。SC 与 IgA 结合及 SIgA 分泌过程是近年来研究的重点课题。SC 作为特异性受体位于上皮细胞膜上，其膜外部分（最外层 100 个氨基酸残基，即 SC1）非共价键与 J 链和 IgA 的 α 链可变区（Cα3）结合，SC 紧靠细胞膜部分（SC5）与 IgA 二聚体的另一条链 α 链（Cα2）形成二硫键。结合的 SIgA 通过细胞吞饮作用（pinocytosis）进入胞浆，在上皮细胞腔面释放，近年的研究表明，小白鼠的肝细胞和人胆管上皮细胞也能合成 SC。人胆汁中含有 IgA 单体多来自血液，少部分来自门脉区及胆管内皮细胞下浆细胞。有趣的是有人发现慢性肝硬化患者周围血 B 淋巴细胞也能产生 IgA 二聚体，其机理还不清楚。

SIgA 分布在粘膜表面，能封闭细菌和病毒等抗原表面及其受体结合部位或与之凝集成团状，阻止病毒和细菌和粘附。SIgA 与相应抗原结合还可激活补体的替代途径，造成抗原溶解，近年来也有人发出 IgA 也能通过 ADCC 发挥细胞毒作用。有人发现先天性缺乏 SIgA 的病人恶性肿瘤的发病率比正常人高 20～50 倍。小肠之所以很少发生恶性肿瘤，粘膜中含 85% 以上的 IgA 产生细胞是重要因素之一。因此，深入研究 SIgA 与消化道炎症，感染和肿瘤发生发展的关系有临床实用价值。

二、对比免疫荧光染色1．染色特点

（1）要进行 SC 和 IgA 组织定位，必须有相应特异抗血清。SC 抗血清国内没有生产。国内商品 IgA 抗血清的抗原多来自人乳中的 SIgA，具有双重抗原性（SC 和 IgA），不能特异进行 IgA 组织定位，最好采用抗人 α - 重链抗血清。

（2）SC 是糖蛋白，IgA 是免疫球蛋白。在组织处理上虽然有人提出用冷冻切片或福尔马林固定胰酶消化的方法，我们的体会用冷酒精直接固定法既简单又方便。

（3）SC 和 IgA 除一部分在细胞内，也可以分布于间质和粘膜表面。为了提高特异性，除了染色前用琼脂扩散、对照试验、吸收试验和抑制试验等方法检验抗体的特异性和敏感性外，可采用伊文氏蓝作对比染色。伊文氏蓝肉眼下是蓝色，在荧光镜下是红色，混合染色后能衬托 FITC 的绿色荧光，同时抑制非特异性荧光，不影响抗原抗体结合。如果特异性染色后再加伊文氏蓝，比较费时间，效果不一定最佳。先用伊文氏蓝染组织切片，再进行特异性抗体染色能抑制抗原抗体结合，不宜使用。

2．染色步骤

（1）组织加工、固定及切片与抗体产生细胞研究（不需 PBS 浸洗）相同。先做 HE 染色，选纵向连续切片，脱蜡后在 4℃PBS 中浸洗 3～5min，过一次蒸馏水后风干待染。

（2）用伊文氏蓝 PBS 稀释 FITC 标记的 SC 和 IgA 抗体，加在连续组织切片上，放入湿盒，37℃温箱放置 45min。

（3）取出切片，用 BPS 浸洗 3 次，每次 5～10min。

（4）过一次蒸馏水后风干，50% 甘油封片，荧光显微镜观察。

3．结果判断和分析荧光镜下组织切片底色为红色荧光，SC 和 IgA 呈绿色荧光。IgA 和 SC 主要分布在分泌性腺体腔面、上皮细胞侧膜及基底部，IgA 还分布在间质及固有层 IgA 产生细胞浆内。可根据荧光强度进行 SC 和 IgA 半定量分析，也可以用荧光光度计或数字减影技术进行准确定量。

三、临床意义1．胃十二指肠疾病 我们用免疫荧光技术对胃和十二指肠疾病研究结果与 Isaonacs 相似，发现正常胃粘膜中胃体腺没有 IgA 和 SC 分泌，仅上皮层有少量 IgA 和 SC 荧光。胃窦腺体细胞的腔面及侧膜均有 SC 和 IgA，间质有 IgA 荧光，但没有 SC 荧光，上皮层 SC 和 IgA 荧光较胃体强，证实 SC 为粘液分泌性腺体细胞所产生，在细胞侧膜与 IgA 结合。正常十二指肠上皮细胞层 SC 和 lgA 特别丰富。粘膜下层十二指肠体腔面也有 SC 和 lgA 分布，但较因有层腺体细胞的分泌能力低。杯状细胞缺乏分泌 SC 的能力。这可能与 HLA-DR 组织相关抗原有关。上皮层的 SIgA 可能是分泌后的功能定位。正常胃体能分泌盐酸和胃蛋白酶，细菌或病毒感染机会少。胃窦特别是十二指肠粘膜多偏碱性环境，细菌和病毒等停留机会较多，SIgA 增多可代偿性增加粘膜免疫保护功能。

慢性浅表性胃炎时，腺体和上皮层 SC 及 IgA 荧光明显增强。HE 染色发现部分胃体腺转化成粘液分泌性腺体（固有腺或幽门腺）即具备分泌 SC 和结合 IgA 的能力。间质出现较多 IgA 产生细胞。这些病人可能正常粘膜屏障功能被破坏以 SIgA 免疫屏障功能代偿。

在萎缩性胃炎中，正常腺体分泌 SC 功能增强，但肠上皮化生腺体及不典型增生腺体的 SC 荧光明显减弱。从免疫学角度支持肠上皮化生与胃癌的发生有较密切关系。

胃癌的发生和发展与 SC 和 IgA 的关系日益受到重视。在我们的研究中，发现部分癌细胞能分泌 SC，与肿瘤的分化程度和组织分类无明显关系。临床上可以用 SC 鉴别其它部位转移肿瘤是否来自胃肠道，但也有人持不同的看法。肿瘤组织中 IgA 来源及 s IgA 在癌组织中的功能尚待进一步研究。

2．肠道疾病 溃疡性结肠炎上皮细胞具有分泌 SC 的功能，但固有层 IgA2产生细胞和 J 链的合成明显减少，IgA1产生细胞增加。IgA2能对抗 IgA 溶解酶的在破坏，有较强的免疫保护功能。故虽然 SIgA 的总量没有降低，但其免疫保护功能明显减弱，导致细菌或病毒感染，引起糜烂和溃疡。也有人发现炎症性反应性不典型增生的腺体分泌 SC 能力明显增强，具有癌变前期的不典型增生腺体明显减弱，而且随不典型增生程度加重，分泌 SC 和结合 IgA 能力减弱越明显，说明 SC 的免疫组织化学染色对鉴别良恶性不典型增生有一定价值。有人认为吸烟可能抑制 SIgA 合成，降低结肠粘膜免疫屏障功能，引起结肠癌。多数的报道认为结肠癌细胞分泌 SC 能力与肿瘤分化程度有关。分化程度越低，分泌 SC 的功能越差。双倍染色体癌细胞分泌 SC 的能力明显高于多倍体癌细胞。但 SC 与肿瘤之间的关系及其机理都在研究中。

3．其它疾病 选择性免疫球蛋白 A 缺乏症患者虽然肠粘膜中 IgA 产生细胞显著增加（90%），因缺乏 SIgA，不能中和和或制止过敏原的吸收，易发生哮喘和食物过敏；抗原抗体复合物进入体内易诱发红斑狼疮、类风湿性关节 炎和甲状腺炎等；易引起乳糜泻及梨形鞭毛虫感染；致癌病毒或致癌物质吸收增加。有人报道 9 例缺乏 IgA 患者 5 例发生消化道肿瘤。爱滋病患者是 HIV 感染所致。有人报道病人小肠末端 IgA 产生细胞减少和 IgM 产生细胞增加，明显 IgA 缺乏，但在直肠没有明显改变。最近曾报道 SC 缺乏的患者发生肠道白色念珠菌感染。这种患者血清 IgA 含量正常，粘膜固有层 IgA 产生细胞数量不减少，但肠分泌物中 SIgA 缺乏。可能这些 IgA 产生细胞不分泌 IgA 或上皮细胞的 SC 合成障碍。

SIgA 是胃肠道粘膜第一道免疫屏障，影响因素较多。上皮细胞感染和维生素 A 缺乏可引起继发性 SC 合成减少和 SIgA 转化障碍。营养不良可选择性减少 IgA 产生细胞数量。吸烟、双苯丙酰脲等药物、精神郁抑和剧烈运动均可能影响 IgA 合成。因此 s IgA 与疾病的内在联系及其机理还需进一步深入研究。

第四节 胃肠道粘膜 T 淋巴细胞一、T 淋巴细胞分布及其特点胃肠道 T 淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类 T 细胞亚群单克隆抗体的制备成功，为进一步研究不同部位 T 淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。

1．上皮内 T 淋巴细胞 上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte, IEL）是指位于上皮层基底部的 T 淋巴细胞。近年来，对 IEL 对邻近上皮细胞有压迹，位于两个上皮细胞交界处，并未进入上皮细胞内。近年来，对 IEL 研究非常深入。已经证实 75% 以上成人小肠 IEL 是 TCRγαβ 阳性细胞，说明它们来源于胸腺，接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性 T 淋巴细胞（CD8或 OKT8阳性），10% 左右为 CD7阳性和 CD3阴性的 IEL，类似 NK 细胞，有细胞毒作用，但无 NK 细胞标记，对 NK 的靶细胞无破坏作用。10%～20% 左右为 TCRδ 阳性 IEL，不受胸腺的影响，其中 70%CD4和 CD8均阴性，为 T 淋巴细胞前体。说明人的部分 IEL 通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子（鼠为 MHL-II，人为 HLA-DR、HLA-DP 和 HAL-DR）相结合后，将抗原分子传递到 CD3阳性 T 淋巴细胞受体（t lymphocyte receptor, TCR）中的 α 和 β 亚单位可变区进行结合，在 CD8分子作用下导致 IEL 增殖和分泌大量 γ - 干扰素（γ-INF），α- 肿瘤坏死因子（α-TNF），和少量的白介素 -2（IL-2），发挥细胞毒性作用，调节 上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。

2．固有层 T 淋巴细胞 固有层 T 淋巴细胞（lamina propria lyphocyte, LPL）分散在固有层，约占固有层免疫细胞总数 10% 左右。其中 CD4阳性细胞（CD4LPL）显著多于 CD8阳性细胞（CD8LPL）。40%CD4LPL 表达 CD45RO 抗原，能产生大量 IL-2、IL- 4 和 γ -INF，为记忆性 T 淋巴细胞，能辅助 B 细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD4LPL 表达 CD45RA 和 CD8抗原，能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节 抗体分泌中起着重要作用。CD8LPL 也可以分两种：一种表达 CD28抗原的 LPL，能通过 ADCC 或直接溶解靶细胞。另一种表达 CD16抗原，具有自然杀伤功能。LPL 能被 IL- 2 激活，激活的 LPL 能释放大量 IL-2、IL-4、γ-INF 和 IL-5、IL- 2 又能激活 LPL，起着自身分泌作用。IL- 5 能促进抗体产生细胞分泌抗体。

3．胃肠道相关淋巴组织 T 淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织（gut – associated lymphoid tissue,GALT）主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT 淋巴细胞多们于生发中心的外周部位，约占 40%。其中 CD8 和 CD4阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明，肠系膜淋巴结内的 CD4阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现 GALTT 淋巴细胞含有 IL- 4 和 IL- 5 基因，激活后产生大量 IL- 4 和 IL-5，能特异性增加 B 和 T 淋巴细胞增殖。抑制 B 淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为 CD45RA 和 leu8(CD8)，证明是幼稚 T 淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低，对刀豆素 A 等有丝分裂促进剂的增殖反应高，产生 IL- 2 和 γ -INF 低，辅助作用弱。GALTT 淋巴细胞如何调节 B 淋巴细胞转化成 IgA 产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待进一步研究。

近年研究发现，除 M 细胞和巨噬细胞外，胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状 MHc II 类抗原，人小肠为 HLA-DR 糖蛋白，能识别、加工和传递抗原使粘膜内 T 淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR 表达受 γ -IFN 诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与 IEL 和 LPL 淋巴细胞互相进行调节。

二、研究方法1．组织切片中 T 淋巴细胞 80 年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中 T 淋巴细胞研究，特异性较差。近年来多用 OKT，Leu 或 CD 等系列 T 淋巴细胞单克隆抗体进行研究，特异性高，可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面：

（1）抗体的选择：根据不同目的选择相应的抗体，如要对人胃肠道组织进行研究，可选用 OKT 系统单抗；对鼠类等进行研究可选用 Leu 或 Thy 系列。如要研究辅助性 T 淋巴细胞可用 OKT4或 CD4；研究抑制性 T 淋巴细胞可用 OKT8或 CD8等单克隆抗体。

（2）组织加工方法选择：目前所研究的特异性 T 淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上，用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏，应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是：手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻，或用 OCT 复合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat 冰冻切片后室温下风干，用 4 ℃纯乙醇或丙酮固定 10min，PBS 冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

（3）染色方法的选择：因抗原较微量，而且位于细胞膜，应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性 T 淋巴细胞，我们推荐最好采用 PAP 或 ABC 染色技术。具体方法参阅第三，四章。

2．粘膜分离液中 T 淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的 T 淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究 IEL 的大致过程：

（1）将手术取得的肠管纵形剪开，将上皮层与固有层分离。

（2）上皮层放在无镁离子、含 100U 青霉素和链霉素及 0.2% 叠氮纳的 PB 中清洗，无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎，用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

（3）匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛（只允许淋巴细胞滤过，除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块）或金属网（200 目）获得淋巴细胞悬液。

（4）将硅化玻璃球高压消毒，冲洗和平衡后将悬浮液过柱，得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取，用台盼蓝测定其活性，并加 10%FCS-RPMI 细胞培养液，淋巴细胞数应达 5×106/ml。

（5）试管内加 0.1ml 细胞液后加 OKT 系列单抗 0.1ml，同时用另一试管加 0.1mlPBS 作对照。混合液在 4℃放置 30～60min（也可以在冰箱过夜）后，PBS（含 RPMI）冲洗 3 次，离心后细胞沉淀物再加 PBS 至 0.1ml。

（6）加 0.1mlFITC 标记的抗鼠 IgG（根据工作效价），4℃放置 20～30min，PBS 洗 3 次，离心后加在红细胞计数板上，荧光显微镜观察。

（7）阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光，有的呈颗粒样，随细胞滚动。荧光镜下可计算 200 个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率，或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。

三、临床意义1．IEL 在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用 正常成人空肠 100 个上皮细胞有 20 个 IEL，回肠有 13 个，结肠只有 5 个，这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一。我们发现胃粘膜也有 IEL。在胃部炎症和溃疡时，上皮及腺体隐窝细胞间的 IEL 明显增加。IEL 不但参与免疫反应，而且通过伪足与上皮细胞接触，加速上皮细胞再生。电镜下胃粘膜也发现这种现象。IEL 与乳糜泻（coeliac disease, CD）关系最密切。近期研究表明，第 12 型腺病毒与麦胶蛋白有同源性。CD 病人肠道感染这种病毒后，服用麦胶数小时粘膜中 IEL 显著增加。在上皮细胞 HLAII 抗原糖蛋白分子作用下与 TCR 结合，激活 TCRαβlEL，发挥细胞毒作用，导致肠粘膜萎缩，引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状。增加的 TCRγδIEL 调节 TCRαβ 的杀伤作用。停服含麦胶食物后，TCRαβIEL 明显减少，上皮细胞再生恢复，临床症状消失。CD 病人出现疣状胃炎也是 IEL 参与的免疫反应结果。CD 病人的肠道淋巴瘤也是来自 IEL 增殖。器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些自身免疫性疾病均有 IEL 增加。也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠 IEL 细胞毒性作用明显减弱。当然，IEL 增加是继发或是原发，是否 IEL 是这些疾病的病因，临床治疗和诊断价值如何，还不清楚。而且 IEL 受年龄、抗原、免疫调节 剂（考的松对 IEL 无影响，环磷酰胺显著降低 IEL 数量）等因素影响，因此需要深入进行研究。

2．粘膜固有层 T 淋巴细胞在局部体液免疫中起重要调节 作用在 GALT 中有开关性 T 淋巴细胞使生发中心的淋巴母细胞转化成 IgA 产生细胞。这些细胞减少或功能缺乏可导致免疫球蛋白 A 缺乏。有人分离出克隆氏病和溃疡性结肠炎病人固有层 T 淋巴细胞进行研究，发现辅助性 T 淋巴细胞减少，抑制性 T 淋巴细胞显著增加，可能导致局部免疫失调，引起细胞毒性或迟发性过敏反应等，致使炎症和溃疡发生。

3．胃肠道肿瘤细胞中 T 淋巴细胞研究倍受重视 我们及国内外一些报道均证明胃癌组织中 T 淋巴细胞显著增加，且其细胞毒性大于非癌组织。胃癌病人周围血 T 淋巴细胞毒性低于粘膜 T 淋巴细胞。但有人发现胃癌组织中 T 淋巴细胞的 ADCC 作用较弱。提示粘膜 T 淋巴细胞可能直接通过细胞毒作用或通过释放淋巴因子对癌细胞有杀伤作用。近年来有人将癌组织中提取和分离出具有细胞毒作用 T 淋巴细胞，体外加入 IL-2，促其增殖，再注入病人体内进行治疗，取得明显疗效。

4．上皮细胞的 MHC 表达也与临床疾病密切相关 有人发现克隆病、溃疡性结肠炎、放射性和感染性结肠炎和结节 病性肠炎患者小肠和结肠 HLA-DR 明显增加，而且不成熟的腺体隐窝细胞也有表达。CD 急性期和复发时 HLA-DR 表达明显增加，缓解期明显减少或恢复正常，说明 MHC 的固有性和变易性所导致的免疫反应的复杂性，在消化道疾病的发生和发展中起着重要调节 作用。

第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学一、癌胚抗原的特点癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是分子量约 20 万的糖蛋白，具有二级以上结构。不同肿瘤中提取的 CEA 虽然抗原性相似，但所含唾液酸及其它糖组分的含量不一定相同，故有多个抗原决定簇，能与非特异性反应抗原 NCA、NCA- 2 和正常胎儿粪抗原等发生交叉反应。NCA 存在于正常肺、胰腺、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内，也存在于正常肠粘膜、胃粘膜肠化生腺体细胞及胆汁内。临床血清学检查 CEA 对结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的诊断有较大价值。免疫细胞化学研究可以明确 CEA 的定位和分布，也可以通过组织切片和分泌物涂片进行临床诊断和鉴别诊断。

二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色1．组织加工 有人提出用冰冻切片进行 CEA 免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件，有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看，福尔马林固定后的切片 CEA 的部分抗原决定簇被遮盖，阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片，CEA 的阳性率明显升高，而且结果仍很清晰。goldenbery 等同时进行 CEA 酶标记组织，而福尔马林固定的组织切片中 CEA 检出范围为 3.0～7.0ng/ g 组织，酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感 2～3 倍。有趣的是我们用酒精固定 26 个月的切片进行染色，效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显，但不影响组织结构及形态，而且可以进行多种抗原的定位研究，操作简单，是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。

2．染色方法的选择 根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP 和 ABC 技术可以采用，但试剂价格较昂贵，步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下：

（1）冷酒精固定的组织石蜡包埋，组织切片，常规脱蜡后在 PBS 中放置 5min，过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干，加含 3%H2O2甲醇一滴在切片上，放置 20min 后再 PBS 冲洗 3 次，过蒸馏水后风干。

（2）加稀释好的兔抗 CEA 血清（稀释度根据染色工作效价）在 37℃湿盒内放置 45min。

（3）PBS 清洗 3 次后风干，再加 HRP 标记物的羊抗兔 IgG（稀释度也要根据染色工作效价），37℃湿盒内放置 45min。

（4）PBS 清洗 3 次后加新鲜配制的含 3%H2O2pH7.6Tris 缓冲液（10ml 溶液中含二氨基联苯胺 5mg）中暗处反应 5～8min（边反应边在显微镜下观察），自来水冲洗，用 1% 甲基绿复染 2～5min，再次自来水冲洗，常规脱水、透明和封片，在光镜下观察。

3．阳性结果判断及计数检查 前应当对 CEA 的分布有一定理性认识，而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA 以三种形式出现在胃肠道组织切片中：①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的 CEA 分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中，CEA 多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有 CEA 着色。

4．腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别 良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取 200～300ml 腹水，离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是：在腹水涂片上加兔抗 CEA 抗血清（1：25 稀释，稀释液为 BPS 缓冲液），在 37℃湿盒内放置 45min 后 BPS 冲洗，共 10min，再加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG（1：20 稀释，稀释液为 0.1% 伊文氏蓝缓冲液），在 37℃湿盒内放置 45min 后，PBS 冲洗 3 次，共 10min，用 50% 甘油封片，荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行 HE 染色，做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色（方法同 T 淋巴细胞染色）。我们发现，不论采用哪种方法，都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚，如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色，可明显减少非特异性荧光，而且淋巴细胞较小，腺癌细胞较大，有利于进行鉴别诊断。

三、临床意义免疫细胞化学技术可以确定 CEA 的组织发生部位，根据阳性特点可以判断癌细胞的位置。我们的研究发现正常结肠组织 CEA 为弱阳性，多非常清晰分布在腔面。但结肠癌组织中 CEA 着色带较宽，多为强阳性，而且不规整。对胃粘膜的研究发现正常胃腺体均为阴性，肠化生腺体细胞弱阳性。胃腺瘤细胞也含有 CEA。70% 以上胃癌细胞 CEA 强阳性，特别是粘液细胞癌，光镜下癌细胞分散浸润，无法确定其转移及浸润范围。用免疫荧光或免疫酶技术进行染色，根据阳性细胞分布可作出正确判断。在肝脏或其它部位转移癌有时因细胞分化不良，无法确定其组织来源。如果用免疫细胞化学染色，发现 CEA 阳性细胞说明来源于腺上皮的癌肿，可能来自胃肠道或卵巢等组织。用胸腹水进行免疫细胞化学染色对临床诊断有实用价值。Walts 对 26 例肿瘤病人渗出液和抽吸液离心后做免疫酶染色，发现 13 例有 CEA 阳性细胞。11 例常规细胞学检查阴性的肿瘤病人发现 8 例胸腹水中有 CEA 阳性细胞。如果胆高 CEA 抗体的特异性，改进组织加工方法，排除非特异性着色，可望提高诊断价值。已经有人在血清学监测 CEA 诊断胃肠道肿瘤的基础上，将 CEA 标记125 I 进行放射扫描定位诊断和用 CEA 标记131 I 或抗癌药物进行肿瘤治疗的报道。

第六节 胃肠道溶菌酶一、溶菌酶在胃肠道的分布消化道含有大量酶类，这些酶多由胃肠道粘膜中的相应细胞产生和分泌。用免疫细胞化学研究酶的分布及含量改变对某些消化道疾病的病因和诊断有较大价值。近年来，对溶菌酶的研究较多。以往的研究认为溶菌酶是粒性白细胞所分泌。现在发现巨噬细胞、单核细胞和血清中含有溶菌酶。用免疫细胞化学染色发现胃肠道某些腺体细胞也能分泌，且在不同病变中出现不同分泌特点。

二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点1．组织固定和加工 用冰冻组织切片可直接进行溶菌酶免疫细胞化学研究。用冷酒精固定，4% 福尔马林缓冲液或 1.5% 戊二醛固定均能进行免疫细胞化学染色。但浸蜡时温度不能超过 60℃，载玻片应涂薄层明胶以防组织切片脱落。载片后，组织切片应放在 50～56℃的烤箱中干燥但不能放在底层，因烤箱底层温度不均匀。组织切片应避免接触含油类的手和容器。组织块应放在 4℃密闭容器内干燥保存。脱蜡一定要完全。

2．染色方法的选择 根据具备的抗体和标记抗体，免疫荧光和免疫酶技术均可采用。间接法、PAP 法和 ABC 等方法均可以选择。大部分报道多采用冷冻切片和 ABC 染色方法。ABC 方法特异性强，敏感性高，非特异性染色少。目前国内已有 ABC 试剂盒生产。普遍认为国外 Vectastain 实验室生产的 Vectastain Elite ABC kit 试剂盒较好，其敏感性比 Vectastain ABC peroxidase kit 高 5 倍。如果加大第一个抗体的浓度，可进行快速染色，整个染色过程只需 30min。如果要进行双标记染色，可在 DAB 显色液作用后组织切片再进行另一种抗体染色，最后在 DAB 显色液中加氯化镍，使阳性部位显示紫色。与 DAB 显示红棕色比较，反差明显。

3．ABC 染色步骤 叠氮钠能抑制过氧化酶活性，不宜用以稀释 ABC 试剂盒中的试剂。第一抗体应用 0.1% 结晶状的牛血清白蛋白溶液稀释。所用缓冲液最好新鲜配制，ABC 试剂用玻璃瓶装的蒸馏水稀释，去离子水可能含过氧化酶抑制剂，能降低敏感性，不宜采用。具体步骤是：①新鲜组织冰冻切片后空气干燥或风干 10min。②切片用丙酮或 95% 酒精固定 10min 后 PBS 冲洗 3 次，共 10min。（也可先固定，后切片，再清洗）。③在 0.3%H2O2甲醇中放置 20min 后 PBS 冲洗 3 次，每次 5min。④用正常兔血清稀释孵育 20min 后，用滤纸吸取过多的血清，并擦干载片中组织周围的液体，但不能使组织干燥，并用彩色笔在组织周围圈画以防抗体液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀释抗血清，在室温下放置 30min 或在 4 ℃过夜后 BPS 洗 10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀释液，在室温下放置 30min 后 PBS 洗 20min。⑦加稀释好的 Vec-tastain Elite ABC 试剂盒中的 AB 混合液（在使用前 30min 配好），再孵育 30min，PBS 洗 10min。⑧组织切片在含 0.1%DAB（1mg/ml）和 0.02%H2O2的 0.1mol/l pH7.6 Tris 缓冲液中反应 2～7min，自来水冲洗 5min（在显微镜下观察结果，决定反应时间）后甲基绿或苏木精对比染色，脱水和封片，显微镜观察。

4．结果判断 溶菌酶主要分布在腺体细胞胞浆内，其中以潘氏细胞和杯状细胞中最明显，也可以分布在腔面或粘液中。炎性组织中粒性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润较多，也有明显着色。但是这些细胞多位于固有层内，即使个别细胞位于上皮层，其形态与腺体细胞不同，容易鉴别。当然，这些阳性细胞需与内源酶引起的着色相鉴别。

三、溶菌酶的研究的临床意义溶菌酶的主要功能是能溶解细菌表面的糖蛋白，具有抗感染的作用。也有人认为能增加吞噬细胞作用，能与各种阴离子分子形成复合物。高浓度溶菌酶能改善细胞膜的功能。溶菌酶的研究包括组织中的分布和血清中含量测定。有人对不同病态胃粘膜进行研究，发现除正常幽门腺细胞能合成溶菌酶外，其它胃腺体细胞均无此功能。表浅性胃炎时，胃体胃窦的颈粘液细胞开始具有分泌溶菌酶的功能。肠化生腺体中的潘氏细胞、杯状细胞、不典型增生的腺体细胞也能产生溶菌酶。作者推测可能慢性胃炎时细菌等感染机会增多，是机体局部产生的对感染的调节 反应。有趣的是在胃癌细胞中也发现溶菌酶而且分化程度越高，分泌溶菌酶功能越强。转移性胃癌细胞和胃腺瘤细胞增色能分泌溶菌酶。其机理还不清楚。

有人对肠道进行研究，发现正常小肠粘膜杯状细胞和潘氏细胞能分泌溶菌酶，但含量较低。间质内粒性白细胞和巨噬细胞也有溶菌酶。但是，正常结肠和直肠上皮细胞表面和粘液腺体隐窝细胞中没有溶菌酶，固有层有溶菌酶阳性粒性白细胞。在 15 例溃疡性结肠炎病人中 7 例在结肠的直肠上皮细胞胞浆出现溶菌酶，8 例克隆氏病人中只有 1 例阳性。作者认为用免疫细胞化学方法进行溶菌酶的定位研究有助于克隆氏病和溃疡性结肠炎病人的鉴别诊断。也有人对结肠癌进行研究，认为溶菌酶的分布与胃癌相反，结肠癌分化越高，分泌功能越低、其机理尚不清楚。

血清溶菌酶浓度的测定也曾作为无并发症的溃疡性结肠炎和活动性克隆氏病的鉴别诊断指标之一。由于 80% 以上血清溶菌酶多来源于粒性白细胞，不论溃疡性结肠炎或克隆氏病都可能引起周围血管局部粒性白细胞、单核细胞和巨噬细胞增多，因此，血清溶菌酶含量受到影响的因素较多，特异性不高，诊断价值有待进一步研究。

第七节 消化管壁内神经丛的免疫细胞化学胃肠道（包括胆囊及肝外胆道）的植物性神经分布有二个来源：①外源性神经（extrinsic nerve），指神经来自胃肠道以外的其它部位。②内源性神经（intrinsic nerve），指神经来自胃肠及胆道壁内的神经丛。要应用免疫细胞化学技术对消化道内源性神经进行研究，必须先了解消化管壁内神经丛的结构。

一、内源性神经的结构内源性神经系指消化道的壁内神经丛。在胃肠道的壁内神经丛包括两个主要的神经丛：肌间神经丛（Auerbach 丛）和粘膜下丛（Meissner 丛）。有的作者建议将粘膜下丛分为：最近肠粘膜肌面的 Meissner 丛，最近环肌内表面的称 Henel 丛。现较普遍采取的 Furnes 和 Costa 的建议，将壁内神经丛分为粘膜丛、粘膜下丛、肌深丛、肌间神经丛和浆膜下丛（图 13-1）。神经节 主要位于肌间神经丛和粘膜下丛。神经丛由神经节 和节 间连接来组成，节 间连接束连接散在分布、形状不规则的神经节，组成图案样的网状结构。这些神经丛自食管下端的平滑肌部起，一直延伸到肛门的括约肌部，并与胆囊及肝外胆道的壁内神经丛相互连接，形成一个局部的神经系统。因此，早在 19 世界初期，Langley 就建议将胃肠道这个局部的神经系统命名为肠道神经系统（enteric nervous sys-tem），并建议作为植物性神经系统中的，与交感和副交感神经系统并列的第三个部分。随着近代组织学技术的发展，大量实验资料证明，肠道神经系统的独特性，组织连接的复杂性和神经细胞类型的多样性，确实不同于其它两部分植物神经系统。

图 13-1 肠道神经丛分布模式图

（一）神经丛的模式

在胃肠道及胆道的分层铺片，用镀银、甲基蓝、乙酰胆碱脂酶（Ache）和菸碱腺嘌呤双核苷酸黄递酶（Nicotinamide adenine dinucleotidediaphorase , NADH）染色法，可以见到壁内神经丛的全貌。由于胃肠道各段神经节 的大小、形态不同，节 间连接束的粗细和长短的不同，神经丛的模式因胃肠道的不同部位、动物的种属不同而异。甚至在同一肠段，如结肠近腹膜附着方向，神经丛的分布远离腹膜附着的方向密集。胃小弯部神经丛的分布密集，神经节 较大，而胃大亦部神经的分布极少或无，胃肠道的粘膜下丛的神经节 小，分布较较稀疏，与胆道的神经丛相似。

（二）神经元的数目和大小

胃肠道各段的神经细胞密度（每平方厘米胃肠道壁所含的神经细胞数）也有不同，虽因染色方法和肠道扩张度的不同，各家报告数字略有不同。一般神经细胞的密度似与胃肠道肌层厚度有关。肌层愈厚，神经细胞密度愈高。在哺乳类动物，结肠的神经细胞密度较小肠高。动物愈大，神经节 分布愈稀疏，单位面积内的神经细胞也愈低。在出生后的发育过程中，肌间神经丛内的神经细胞逐渐增加。新生大鼠小肠神经细胞总数为 420000，至成年时增为 1850000。而在小肠的单位面积内的神经元数，在新生小鼠为 64345 个 /cm2，在成年仅为 9405 个 /cm2。换而言之，神经细胞数的增长远远落后于肠道肌层的发育。至于出生后神经丛内新生神经细胞的来源，是通过神经细胞的分裂或其它细胞的分化还是一个有待探索的问题。

与其它植物性神经节 相比，壁内神经丛内神经细胞大小的变异较为明显。肌间神经丛内神经细胞大小的变异较粘膜下丛更为明显，如在大鼠盲肠的神经丛内，神经细胞的表面积为 100～200μm2。小肠肌间神经丛内的小神经细胞明显多于大神经细胞，而在胃肠道其它各段，则以大神经细胞居多。神经细胞大小的变异是否代表不同功能的神经细胞亚群，尚不清楚。

（三）神经细胞的类型

依形态学分类：Dogiel 建议将肠道神经元分为三种类型：

1、I 型具有许多短的、不规则的树突和一根细而长的轴突。

2、II 型有一个短而局限于节 内轴突和许多长的延伸到神经节 外的树突。

3、III 型具有中等长短的树突，终止于同一或邻近的神经节。

Dogiel 认为 I 型属运动神经元，II 型属感觉神经元。肠道神经节 内存在 dogiel I 型和 II 型细胞，还存在其它的中间型细胞，如在猫的粘膜下神经丛中，单极和双极的神经细胞占 83%，多极的神经细胞占 17%。这说明肠道神经细胞形态的多样性。然而对于其形态与功能的相关性，是否 I 型与 II 型分别代表感觉及运动神经元，多数学者持怀疑态度。

依所含化学物质分类：可分为含乙酰胆碱神经细胞、含胺神经细胞、含嘌呤核苷酸神经细胞和含多肽神经细胞。免疫细胞化学技术是显示含多肽神经细胞的有力工具。现已知在消化管壁内神经丛内含有血管活性肠肽、生长抑素、物质 P 和脑啡肽等多肽。用双重免疫染色法可证明一种以上的多肽共存于神经细胞内。

二、消化道全层铺片技术用消化道切片结合免疫细胞化学染色固然能显示壁内神经丛的神经细胞及纤维。但由于壁内神经丛为扁平的网状结构，欲窥其全貌，则以消化道全层铺片技术进行免疫细胞化学染色效果最佳。消化道全层铺片在英文文献中通常称为 whole mount stretch preparation，即整装撕片。即根据消化管壁内神经丛的结构特点，分纵层肌、环层肌、粘膜下层等分层撕开铺片，以暴露不同的壁内神经丛。以肠道为例，简述消化道的分层铺片技术。

动物麻醉后，用 Zamboin’s 液行主动脉灌注固定，剖腹取任何一段肠管放入上述固定液中 4 ℃下 3h，然后移至 4% 多聚甲醛液固定 3h，再移至 20% 蔗糖 4 ℃过夜，于次日行全层铺片。选择一大小适宜的吸管或玻棒穿入肠管，使其被动扩张，然后用钟表镊在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用镊尖沿划痕轻轻剥离分离纵肌层，将剥离的纵肌层放在载玻片上（浆膜面向下）。在解剖显微镜下，用镊尖轻挑去附于神经丛上的环层肌，即得纵、环肌之间的肌间神经丛。再将肠管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上，用镊子或手术刀反复刮去表面的上皮层，即可获固有层表面的粘膜丛，重刮时刮去表面的粘膜层，即可暴露粘膜下层的粘膜下神经丛。

撕片放入 0.1mmol/ L 的 PBS 溶液中，等待进行免疫染色。其步骤与切片染色同，只是由于撕片较厚，为增强抗体的穿透性，常于染色前在系列酒精中反复脱水后，再进行免疫染色。一般撕片进行免疫染色地漂浮法为佳，可增加壁内神经丛与抗血清的接触。如撕片数量少，为节 约抗血清也可用载片法，此时载玻片上需涂抹一层粘附剂如铬矾明胶或多聚赖氨酸，以免撕片在染色过程中脱落。

第八节 肝脏疾病免疫细胞化学一、乙型肝炎免疫细胞化学乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的传染病。乙型肝炎的发病是乙型肝炎病毒与机体之间相互作用的结果。目前研究证明，乙型肝炎病毒并非直接引起肝细胞的损伤，而是由于人体感染乙型肝炎病毒后，引起细胞免疫和体液免疫的应答。因此，人们认为机体免疫应答是引起肝细胞损害的重要原因。乙型肝炎病毒侵入机体后，在肝细胞内进行复制繁殖。乙型肝炎病毒基因组 DNA 在肝细胞核内进行复制，转录，在合成核心颗粒后，被转运到肝细胞浆内，在通过内质网和细胞膜时合成其外壳部分，并以发芽的形式释放出肝细胞。Dane 颗粒的核心部分含有核心抗原（HBcAg），细胞核内较多，尤其是免疫抑制者更明显。在血清中，HbcAg 总是与核心抗体（抗 -HBc）形成复合物。故在循环血液中不存在游离的核心颗粒。Dane 颗粒的外壳部分含有表面抗原（HBsAg），在释出肝细胞过程中装配上有肝细胞成分。HBcAg 和 HBsAg 都能引起细胞免疫及体液免疫反应，特别是 HBsAg 诱发的免疫反应可以引起肝细胞的损害，以细胞免疫反应起主要作用。近年来，对乙型肝炎病毒分子生物学研究证明，HBV 基因组有 4 个可被转录的区域（或 4 个开放读框）, 称 S，C，P 和 X 区。S 区又进一步分为前 S 1（pre-S1）前 S 2（pre-S2）和 S 基因区，主要为组成病毒外壳的三种不同的蛋白编码。前 S 1和前 S 2区肽段被认为和病毒对肝细胞的附着有关。目前已明确，HBV 有 5 种抗原表达即 HBsAg 前 S 1，前 S 2，HBcAg（包括 HBeAg）和 HBxAg。它们在体内均可产生相应的抗体，发生免疫反应。

（一）乙型肝炎的免疫反应发病机理

人体感染乙型肝炎病毒后，可引起细胞免疫及体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节 功能紊乱，致使病变的肝细胞产生或释放大量正常或异常的蛋白质，进一步促使免疫损害加重，使病情不断发展。

1．体液免疫反应在乙型肝炎发病中的作用体内发生 HBV 感染后，可以产生各种抗原，这些抗原激发机体免疫系统而产生相应的抗体，如抗 -HBs, 抗 -HBc，抗 -HBe，抗 -HBs1，抗 -HBs2和抗 -HBx 等。这些抗体能对血中的乙型肝炎病毒进行反应加以杀灭。乙型肝炎病毒抗原大多位于胞浆内（HBcAg 主要位于核内），部分亦位于胞膜上及核内。因此在抗原抗体发生免疫反应过程中，受病毒感染过的肝细胞亦遭到攻击，使肝细胞受到损害。近来有人报道在肝细胞膜上存在着两种不同的受体：一种受体是能直接和前 S 1抗原结合，另一种受体是通过多聚人血清白蛋白（PHSA）与前 S 2抗原结合。前 S 1或 S 2抗体出现于 HBV 感染的早期血清内，具有中和病毒及阻断抗原和肝细胞结合的作用，在抗原抗体发生免疫反应过程中引起肝细胞的损伤。抗原和抗体之间量的不平衡程度决定了乙型青炎病变的程度。当抗原抗体过多时，则出现大量的抗原抗体复合物，可导致暴发型肝炎；当抗原量少，体内产生的抗体可以逐渐清除抗原，则表现为普遍型肝炎；当体内产生的抗体不足以清除抗原时出现抗原过剩，则表现为慢性肝炎；当 HBV 进入机体后，机体不产生的抗体，无临床症状，则为健康带毒者。目前研究认为，无球蛋白血症的患者（基本上无体液免疫反应），不仅可以发生慢性肝炎，亦可以发生急性肝炎；有些乙型肝炎患者血清中抗原抗体复合物的含量与肝细胞损害的程度不一致，因此，乙型肝炎病毒对肝细胞的损害并非完全通过体液免疫反应。

2．细胞免疫反应在乙型肝炎发病中的作用目前研究认为，细胞免疫反应是乙型肝炎病毒感染后引起肝细胞损害的主要机理。细胞免疫反应是通过杀伤性 T 细胞（K 细胞），自然杀伤细胞（NK 细胞）及抗体依赖细胞毒作用而发生。近来研究表明，在细胞免疫反应中，靶细胞抗原包括 HBsAg，HBcAg,pre –S1,pre-S2及 LSP(肝细胞膜脂蛋白)等。一般来说，急性肝炎靶细胞抗原可能主要为 HBcAg，pre-S2, 慢性活动性肝炎可能为 HBcAg 及 LSP。近年来研究表明，HBcAg 除位于肝细胞核内，也位于胞浆内及胞膜上。HBcAg 位于细胞膜表面，可提供为 T 细胞毒的靶抗原，而且血清中抗 -HBc 可以和特异性细胞毒性 T 细胞竞争结合在肝细胞膜上的 HBcAg，阻断 T 细胞的攻击。有人提出，HBcAg 的免疫应答对 HBV 感染有保护作用。有人研究证明，在肝细胞膜上有 HBcAg 表达者，细胞毒试验为阳性，且可被抗 -HBc 封闭，用抗 -HBs 无效。这表明位于肝细胞膜表面的 HBcAg 为 T 细胞的靶抗原。亦有人提出在肝细胞膜上仅有 HBsAg，而未发现 HBcAg 或 HbeAg，因此认为 HBsAg 也是 T 细胞的靶抗原。在细胞免疫反应中，T 细胞要求对靶细胞的特异性抗原和组织相容性抗原（HLA）的双重识别。HBeAg 阳性的乙型肝炎患者，肝细胞膜上 HLA 仅为轻度阳性，而抗-HBe 阳性患者则显著增强，提高 T 细胞清除感染细胞的作用，这可能为干扰素抗病毒的疗效机制之一。在细胞免疫反应中，T 细胞除细胞毒效应外，还有淋巴因子效应。致敏的淋巴细胞可以释放各种淋巴因子，如淋巴毒素、细胞毒因子、趋化因子、巨噬细胞移动抑制因子、转移因子等。有人发现淋巴因子可以引起肝细胞广泛坏死，呈小叶中央性或中间带分布。NK 细胞在乙型肝炎发病机理中的作用仍不太清楚，亦可能参与细胞免疫反应的调节 作用。由于细胞免疫反应的不同，就出现不同类型的肝炎，表现不同的临床病理特点。如 T 细胞功能正常，感染病毒量多，毒力强，受感染的肝细胞多而严重，则受到免疫损伤的肝细胞多而且重，表现为急性重型（暴发型）肝炎；如果感染病毒量少，毒力较弱，则发生急性普通型肝炎；如果病毒量很少，毒力很弱，则表现为轻型或亚临床肝炎。如果 T 细胞呈免疫耐受状态或机体免疫机能缺陷，病毒与宿主共生，病毒在肝细胞内不断复制，感染的肝细胞不发生免疫损，则表现为无症状病毒携带者。如果在 T 细胞功能不足，免疫反应仅能清除部分病毒及部分肝细胞受到免疫损伤，未被清除的病毒可以反复感染肝细胞并进行复制，于是不断出现肝细胞的损害，表现为慢性肝炎，特别是慢性活动性肝炎。

（二）乙型肝炎与自身免疫反应

正常人由于 T 细胞对自身抗体系统的调控，在清除老化或破坏的肝细胞时，虽可产生自身抗体，但并不发生自身免疫性疾病。在慢性肝炎，特别是慢性活动性肝炎时，由于 T 细胞免疫机能缺陷，乙型肝炎抗原（包括 HBsAg,HBcAg 及 HBeAg）与宿主肝细胞表面或内部的蛋白质相互作用，形成含自身组织蛋白的抗原，具有较强的免疫原性，可引起持续的自身免疫反应；也可能由于病毒使机体免疫系统稳定性发生紊乱，细胞免疫失去调控，体液免疫反应亢进，对宿主的自身组织产生抗体，发生自身组织免疫反应，引起肝细胞损伤。有研究表明，慢性活动性肝炎的患者出现对肝细胞表面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应。有人报道，根据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积，提示存在与 HBsAg 无关的自身免疫机理。有人认为，肝炎患者病毒性损伤可释放肝特异抗原，使宿主致敏，并使肝损伤持续存在。因此，自身免疫反应在慢性活动性肝炎发病中具有一定的作用。目前已知在慢性活动性肝炎患者常出现某些自身免疫现象，如常伴有关节 炎、皮疹、肾小球肾炎、慢性甲状腺炎及干燥综合症等自身免疫性疾病，患者血清中 IgG、IgA 及 IgM 明显升高，血清中可查到抗平滑肌抗体、抗核抗体、抗线粒体抗体、抗肝细胞膜特异性脂蛋白抗体及类风湿因子等自身抗体；有 15～30% 的患者可查到狼疮细胞。

（三）乙型肝炎肝细胞内病毒抗原的定位及分布

近年来，对乙型肝炎病毒（HBV）分子生物学研究表明，HBV 基因组有四个开放读框（Open reading frame, ORF），其中 S 基因区能编码 HBV 外壳的结构蛋白，即小 S 蛋白（主蛋白，HBsAg），中等 S 蛋白（前 S 2抗原）和大 S 蛋白（前 S 1抗原），它们都具有较高的免疫原性。P 区编码具有反转录酶活性的病毒 DNA 多聚酶。X 区编码 145 至 154 个氨基酸的多肽，编码蛋白为 HBxAg。C 区编码 HBV 的核心部分，即 HBcAg 和 HBeAg。目前通过免疫组化及免疫电镜等技术均可观察到 HBV 各种抗原在肝细胞定位及分布状态。

1．HBsAg pre –S1,pre-S2在肝细胞内的分布 HBsAg，前 S 1和前 S 2抗原在乙型肝炎，特别是慢性活动性肝炎的肝细胞内检出率为 52～65%。HBsAg，前 S 1和前 S 2抗原阳性经常出现于同一部位，甚至同一细胞内。前 S 1阳性反应比 HBsAg 和前 S 2强。有的病例三者并非同时出现，并非在同一位置。少数情况下，HBsAg 阳性，而前 S 1和前 S 2阴性，反之，HBsAg 阴性，而前 S 1和 S 2阳性；绝大多数情况下前 S 1和前 S 2并存在同一部位或同一细胞之内，少数情况下，HBsAg，前 S 1阳性而前 S 2弱阳性或阴性。HBsAg、前 S 1和前 S 2抗原主要位于乙肝的肝细胞浆内，部分位于胞膜上，少数位于胞核内。HBsAg，前 S 1和前 S 2抗原阳性物质在肝细胞内的分布大致有三种形态：①包涵体型：阳性物质聚集成团块状，轮廓清楚，呈圆形或卵圆形，位于核的一侧，或者只占据胞浆的小部分，或占据胞浆的大部分，将核推向一侧，此型最为多见；②全胞浆型或弥漫型：阳性物质均匀分布于肝细胞的胞浆内，核往往为阴性位于中央，此型亦较常见；③胞膜型或周边型：阳性物质沿着胞膜或胞膜内侧分布，有人把胞膜型再分为胞膜抗原 I 型和 II 型，前者主要表现为 S 抗原聚集在肝窦侧的肝细胞膜上，呈线条状排列；后者主要累及整个肝细胞膜，呈颗粒状或串珠排列。上述 S 抗原在肝细胞内分布的三种类型往往是两者或三者联合出现，只是以某一种为主而已，单独存在者少见。S 抗原阳性细胞的分布有三种类型：1）散在型，在切片中只见少数散在的阳性细胞，此型多见于慢性迁延性肝炎或静止期肝硬变组织内；2）局灶型，阳性细胞呈簇分布于切片的某一区域，此型多见于急性轻型肝炎或慢性活动性肝炎的组织内；3）弥漫型，多数阳性细胞弥漫分布于切片内，此型多见于慢性活动性肝炎，急性重型肝炎或肝硬变的整个结节 内。不同病例 S 抗原反应强度及阳性细胞检出率是不同的，就是同一病例不同部位也不尽相同。S 抗原阳性物质反应的强弱取决于 S 抗原的含量。

2．HBcAg 和 HBeAg 在肝细胞内分布 HBcAg 多见于乙型肝炎、肝硬变的肝细胞内，特别是肾脏移植病人，有内 HBcAg 检出率特别高。一般来说，在慢性肝炎 HBcAg 的检出率在 10%～30% 不等，其检出率明显低于 HBsAg。这可能是由于 HBcAg 和抗 -HBc 在核内形成免疫复合物，HBcAg 被封闭之故。HBcAg 多位于肝细胞的胞核内，少数位于胞浆内及胞膜上。HBcAg 阳性物质位于核内常呈细颗粒状均匀分布，少数为斑点状或网状；而在胞浆内则为细颗粒状或絮状；在胞膜上则为均匀细颗粒状。经常出现的是以核型、浆型和膜型同时存在于一个肝细胞内，亦可单独存在。HBcAg 阳性肝细胞的分布和 HBsAg 相似，亦分散在型、局灶型和弥漫型。局灶型经常见于慢性活动性肝炎；弥漫型经常见于肾移植的肝；散在型经常见于急性肝炎或迁延性肝炎。HBeAg 阳性物质在肝细胞内的分布状态与 HBcAg 相似。HBeAg 和 HBcAg 经常位于同一细胞核内，用罗达明标记双染色证明 HBcAg 和 HBeAg 之间有密切关系。HBeAg 阳性主要见于 HBsAg 阳性的慢性活动性肝炎的肝细胞内。

3．HBxAg 在肝细胞内分布 HBxAg 经常见于慢性肝炎的肝细胞内，其检出率为 65% 左右，比 HBcAg 和 HBsAg 高。特别在慢性活动性肝炎检出率更高，约 73%；而慢性迁延性肝炎则为 43% 左右。HBxAg 阳性物质为均匀细颗粒状，主要位于肝细胞的胞浆内，少数位于胞核内及胞膜上。不同病例 HBxAg 阳性物质的分布及阳性反应强度不同，就是同一病例不同部位其结果亦不尽相同。HBxAg 阳性肝细胞的分布状态和 HBsAg 相似，亦呈散在型，局灶型和弥漫型。在慢性活动性肝炎以局灶型多见，其次为弥漫型。有些病例，HBxAg 阳性细胞围绕小血管分布，有的则沿着纤维隔分布。HBxAg 阳性物质亦见于少数肝内胆管上皮内及 kupffer 细胞内。

4．IgG(抗 -HBc)在肝细胞内分布用免疫荧光及免疫酶技术证实在肝炎组织中存在 Igg，这种 IgG 可能就是抗 -HBc，该抗体经常和 HBcAg 以复合物的形式存在于肝细胞核内，少数也见于胞浆内及胞膜上。Rey（1979）还证明这些 IgG 只见于含有 HBcAg 的肝细胞核内。IgG(抗 -HBc)阳性物质的分布及其阳性细胞的分布同 HBcAg。

二、肝硬变免疫细胞化学肝硬变或称肝硬化（liver cirrhosis）是多种原因引起的慢性肝脏疾病，其中原因之一是和 HBV 慢性感染有关，特别在中国 HBV 可能是引起肝硬变的主要原因。HBV 感染引起乙型肝炎，部分病例变成慢性活动性肝炎，进而转变成肝硬变。其中大部分为门脉性肝硬变（小结节 型肝硬变），小部分为坏死后性肝硬变（大结节 型肝硬变）。近年来在我国通过临床、病理及免疫病理的研究证明，HBV 感染与肝硬变的发生有十分密切关系，在肝硬变内 HBsAg 检出率为 70%～90%。世界其它一些国家和地区，如日本、印度、非州、香港等也有类似的报道。肝硬变的发生可能是由于机体免疫机能不足，不能将 HBV 完全杀灭和排除。在机体内 HBV 不断复制繁殖，并通过免疫机制使肝细胞反复遭受破坏，以及肝细胞结节 状再生，纤维组织不断增生，形成纤维隔，致使正常的肝小叶结构破坏，最后形成肝硬变。下面用免疫细胞化学（PAP），亲合免疫细胞化学（ABC）等方法对 HBV 抗原、纤维结合蛋白（FN）、III 型胶原和细胞角蛋白在肝硬变组织内定位及分布进行描述。

（一）肝硬变组织内 HBV 抗原的定位及分布

用免疫细胞化学（PAP）及免疫亲合素（ABC）方法在肝硬变组织内对 HBV 抗原（HBsAg ,pre –S1,pre-S2,HBcAgHBxAg）进行了检测，观察了它们在肝细胞，kupffer 细胞内等定位和其分布状态。

1．HBsAg、pre –S1和 pre-S2在肝细胞内分布 HBsAg 在肝硬变组织中检测率为 70%～80%，其中 86% 伴有肝细胞不典型增生；pre –S1和 pre-S2的检出率为 60%～70%，其中 84% 伴有肝细胞不典型增生。HBsAg、pre –S1和 pre-S2抗原经常出现于肝硬变组织的同一部位，甚至同一细胞内。少数情况下，HBsAg 阳性, 而 pre –S1或 pre-S2阴性，反之，HBsAg 阴性, 而 pre –S1或 pre-S2阳性。HBsAg、pre –S1和 pre-S2抗原主要位于肝细胞浆内，部分位于膜上，少数位于核内。在部分肝硬变病例中，HBsAg、pre –S1和 pre-S2在也见于 kupffer 细胞内及肝内胆管上皮细胞内。

2．HBcAg 在肝细胞内的分布 HBcAg 在肝硬变组织内的检出率为 20% 左右，其中 82% 伴有肝细胞不典型增生。HBcAg 阳性检出率明显低于 HBsAg、pre –S1和 pre-S2，这可能是由于 HBcAg 和抗 -HBc 在核内形成免疫复合物，以至 HBcAg 被封闭之故。HBcAg 主要位于肝细胞核内的形态表现为分布与肝炎的相似。在少数病例 HBcAg 阳性物质也见于汇管区的纤维组织内及肝窦壁上。

3．HBxAg 在肝细胞内的分布 HBxAg 在硬变组织的检出率为 80% 左右，其中 85% 伴有肝细胞不典型增生。HBxAg 的检出率和 HBsAg 相似。HBxAg 阳性物质呈细颗粒状。主要位于肝细胞浆内，少数位于胞核内及胞膜上。HBxAg 在肝细胞内的形态表现及阳性细胞的分布状态与 HBsAg 相似。有部分病例 HBxAg 沿着肝硬变的纤维隔分布。HBxAg 阳性物质也见于肝内胆管上皮细胞及 kupper 细胞内。

4．IgG(抗—HBc)在肝细胞内的分布在肝硬变组织内可观察到抗 -HBc 的存在，其阳性率与 HBcAg 相似。该抗体经常和 HBcAg 以复合物的形式存在于肝细胞核内，少数也见于胞浆内及膜上。抗 -HBc 阳性物质在肝硬变细胞内的存在和阳性细胞的分布状态与 HBcAg 相同。

（二）肝硬变组织内纤维结合蛋白（FN）的定位及分布

纤维结合蛋白（fibronectin, FN）是一个非胶原性的大分子糖蛋白。近年来研究发现它与损伤修复及器官硬化有密切关系。在肝硬变及慢活肝的组织内 FN 沉积增加，可能与肝硬变时纤维组织隔形成有关系。在肝硬变组织内，FN 阳性物质位于肝细胞内及 kupffer 细胞内，其阳率分别为 59%、65%。FN 阳性物质弥漫分布于胞浆内，阳性细胞多呈三五成群地分布于假小叶边缘、中央静脉旁及肝实质内灶（片）状杯死区域的附近。汇管区及纤维隔内可见数量不等的 FN 阳性的组织细胞和纤维母细胞。此外。有的病例肝窦壁、血管内皮及小胆管基底膜也呈阳性反应。FN 阳性检出率和 HBsAg 阳性呈正相关，在 FN 阳性病例中有 80%HBsAg 阳性。而活动性肝硬变 FN 阳性明显高于非活动性肝硬变（P<0.01）。上述结果表明，在由 HBV 感染引起的肝硬变过程中，FN 参与了肝硬变的形成。

（三）肝硬变组织内 III 型胶原的定位及分布

在肝硬变时，I、III 型胶原增加，这与肝纤维化有密切关系。实验结果证明，在惭性迁延性肝炎→慢性活动性肝炎→肝硬变之间，Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布呈逐渐增加的趋势。除汇管区Ⅰ、Ⅲ型胶原增多外，中央静脉周围及小叶内坏死区、炎症区也增多，形成小叶内纤维化与从汇管伸向小叶内纤维组织相连形成纤维隔。在部分肝硬变病例，肝细胞内有Ⅲ型胶原阳性反应。在纤维隔及假小叶的窦壁上Ⅲ型胶原阳性率为 100%，在肝细胞内为 34%。Ⅲ型胶原在宽大纤维隔内呈弥漫密集分布，在窦壁上为连续线状分布，在肝细胞浆内呈弥漫分布。阳性肝细胞主要位于小叶边缘或近纤维隔处。动物实验证明Ⅰ、Ⅲ胶原是由肝细胞合成产生的，并参与肝硬变的形成。

（四）肝硬变组织内角蛋白定位及分布

在正常肝脏中肝细胞和胆管上皮细胞各有其特征性的细胞角蛋白（CK）组型，它们是各自形态发生的过程中建立的。研究结果表明在肝硬变组织中有 81% 呈角蛋白阳性反应，但阳性反应程度各病例是不相同的。CK 阳性的肝细胞主要位于汇管区周围。尤其是碎屑状肝细胞坏死附近，并常伴有肝细胞小管状化生、弧立肝细胞团块形成及胆管或胆小管增生，它们之间在细胞形态和阳性强度上有移行关系，有的病例整个假小叶 CK 阳性。部分肝小多角型细胞也呈阳性反应。在肝硬变组织内 CK 阳性反应与 HBsAg 阳性呈正相关。CK 阳性的肝硬变中绝大多数 HBsAg 也阳性，这一结果 HBV 感染所致的慢性肝脏病变可引起 CK 的异常表达。

三、肝癌免疫细胞化学原发性肝细胞癌（简称肝癌）是世界上较常见的恶性肿瘤之一，特别在非洲和亚洲一些地区肝癌发病率较高。自从发现乙型肝炎抗原（HBAg）以来，给 HBV 与肝癌发病关系的研究开辟了新的途径。近年来用免疫细胞化学技术及分子杂交技术对 HBV 与肝癌发病关系的研究更加深入和广泛，并取得一定成果。全世界各地通过大量的流行病学、免疫病理学、分子遗传学等研究结果表明，HBV 感染与肝癌的发病有密切关系，普遍认为 HBV 是肝癌发病的主要原因。目前尚不完全清楚 HBV 致癌机理，是具有直接致癌作用或间接致癌作用，这有待进一步研究。

（一）HBV 与原发性肝癌的流行病学证据

HBV 与原发性肝癌关系的研究已有 20 余年，目前对 HBV 作为肝癌病因的证据日益增多，特别是对 HBV 的分子生物学的研究表明，HBV 可能具有直接致癌作用。如下事实可作为临床学和流行病学的证据：

（1）原发性肝癌常发生在 HBV 流行区，而非流行区则发病率很低。

（2）血清学研究表明：生活在 HBV 流行区的肝癌病人 50%～90%HBsAg 阳性，而对照组仅为 5%～15%；抗 -HBc 为 80%～90%，而对照组为 15%～35%。近年来研究表明，肝癌病人抗 -GBx 的检出率在 85% 左右。而对照组很低。些标志物被认为是目前正在发生 HBV 感染或先前有 HBV 持续感染的证据。甚至在欧美肝癌发病率很低的国家，肝癌病人 HBsAg，抗 -HBc 和抗 -HBx 检出率也明显比对照组高。从大量的研究结果表明，在 HBV 流行区 HBV 携带者肝癌发病的相对危险性比非携带者高十倍，甚至几百倍。

（3）在 HBV 流行的人群中，HBV 携带者与肝癌家庭聚集性的早期观察，生活早期婴儿从母亲传播感染是 HBV 慢性携带者，后代亦易成为慢性携带者。Larouze 等发现塞内加尔患肝癌的母亲中 71%HBsAg 阳性，而相应的对照组仅为 13%，在朝鲜和我国台湾省也观察到同样的现象。预防母 - 婴的 HBV 传播，对预防肝癌的发生具有重要意义，从研究家族病例来看，大多数最终发生肝癌的个体在出生时或是出生后第一年内从携带 HBV 的母亲或兄弟姐妹间获得感染。

（4）约 80% 的肝癌病例发生在肝硬变或慢性活动性肝炎的基础上，而肝硬变和慢性活动性肝炎双往往由 HBV 慢性持续性感染引起的。在亚洲和非洲一些地区，肝硬变病人 90% 以上 HBsAg 阳性，慢性活动性肝炎病人 75% 以上 HBsAg 阳性，而对照组只有 6%～14%HBsAg 阳性。

（二）肝硬变与肝癌的关系

大多数肝癌病合并有肝硬变，部分肝硬变病人可发展为肝癌，这一事实早已被人们所注意。大多数报道肝癌合并肝硬变为 80%～90%。肝癌合并肝硬变的类型主要为坏死后大结节 型肝硬变，约占 70%～80%，少数为混合型，合并小结节 型肝硬变少见。肝硬变发展为肝癌的百分率，各报道差别较大，但大多数报道为 20% 左右。坏死后大结节 型肝硬变与乙型肝炎病毒感染有密切关系，HBsAg 阳性率很高，达 70%～80%。Blumberg 等（1977）报道在 84 例肝硬变中有 24 例 HBsAg 阳性，其中 6 例（25%）发展成肝癌。Obata(1980)指出，HBsAg 阳性的肝硬变有 23% 发生癌变，Nayak（1977）报道，肝硬变发生癌变的机会和其 HBsAg 阳性有关，HBsAg 阳性的肝硬变发生肝癌的机会为 51%，而与 HBsAg 阳性的大结节 型肝硬变有密切关系。大结节 型肝硬变常伴有肝细胞的不典型增生，而伴有不典型增生的肝硬变 HBsAg 阳性检出率很高，表明肝细胞不典型增生与 HBsAg 慢性持续感染有密切关系。有人认为不典型增生的肝细胞是一种癌前期病变。

（三）肝细胞肝癌及癌周肝组织内 HBV 抗原的分布

目前用组织化学、免疫组织化学及免疫电镜等技术可以在人肝癌及癌旁肝细胞内检测到 HBsAg、前 S 1、前 S 2、HBcAg(HBeAg)及 HBxAg 等。

1．肝癌及癌周肝组织内 HBsAg 定位及分布在肝癌组织内，HBsAg 阳性率一般来说比较低，大多数报道其阳性率在 10%～15%，少数报道阳性率可高达 25～44%。肝癌细胞内 HB-sAg 阳性主要见于分化好的肝癌病例，少数亦见于中度分化及分化差的肝癌病例。一般来说，癌周肝组织内 HBsAg 阳性率明显高于癌组织。大多数文献报道，癌周肝组织内 HBsAg 阳性率为 60%～80%，少数报道在 90% 以上。癌周肝组织内 HBsAg 阳性主要见于癌周肝硬变中，特别是大结节 肝硬变中。这一结果表明，HBV 与肝癌的发生有密切关系。肝癌及癌周肝组织内 HBsAg 阳性的形态和分布状态，不同病例表现不同，就是同一病例不同部位也有很大差异。HBsAg 阳性细胞分布亦不规律。绝大多数 HBsAg 阳性物质位于胞浆内，部分位于胞膜上，少数位于核内。HBsAg 阳性物质呈细颗粒状、絮状或网状。HBsAg 阳性物质在细胞内分布有三种类型：全胞浆型，阳性物质充满整个胞浆；包涵体型，阳性物质集聚成团，位于核旁一侧；胞周型或核周型，阳性物质沿着泡膜或核膜分布，呈环状。在肝癌及癌周肝组织内包涵体型或全胞浆型较多见。HBsAg 阳性细胞的分布有三种类型：弥漫型，多数阳性细胞弥漫分布于切片内；局灶型，少数阳性细胞集聚于某一区域；散在型，阳性细胞较少，孤立的或零散的分布于切片内。一般来说，癌周肝组织 HBsAg 阳性反应强度和阳性细胞检出率比癌组织高。癌组织检出率低的原因，可能是由于癌组织不适于 HBsAg 的复制，或是由于 HBv DNA 和宿主 DNA 发生整合，而 HBsAg 不易表达所致。至于 HBsAg 在肝癌发病中的作用，目前尚不清楚。一般认为 HBsAg 作为靶抗原，通过免疫反应，造成肝细胞的损伤，肝细胞增生，不典型增生，最终可能导致癌变。

2．肝癌及癌周肝组织内前 S 抗原的定位及分布对肝癌及癌周肝组织内前 S（pre-S1和 pre-S2）抗原的研究远不及对 HBsAg 的研究。近来，国内外文献有少数报道。在肝癌组织内前 S 1和前 S 2抗原的检出率为 20% 左右，略比 HBsAg 检出率高。在癌周肝组织前 S 1和前 S 2抗原的检出率为 60% 左右，这个和 HBsAg 的检出率基本相似。在绝大多数 HBsAg 阳性的病例前 S 1和前 S 2抗原亦阳性，而在部分前 S 1和前 S 2阳性病例，HBsAg 却呈阴性反应。因为在基因构成上，前 S 1包括前 S 2和 HBsAg，前 S 2包括 HBsAg 的部分，故前 S 1和前 S 2的表达要比 HB-sAg 强。用免疫组化方法染色，前 S 1和前 S 2阳性物质呈棕红色呈均匀细颗粒状，主要位于癌细胞及肝细胞的胞浆内，有些病例则和 / 或位于胞膜上及核内。阳性物质反应的强弱和前 S 1或前 S 2抗原的含量有关。一般来说，前 S 1或前 S 2阳性反应强度和阳性细胞检出率，癌周肝组织比癌组织强。这一规律和 HBsAg 相同。前 S 1或前 S 2阳性物质在细胞内的分布情况及其阳性细胞分布状态和 HBsAg 的基本相似。目前对前 S 1或前 S 2抗原在肝癌发病中的作用尚不完全清楚。有人研究证明，在人肝细胞膜上存在两种不同的受体，一种受体可以直接与前 S 1蛋白结合；另一种受体通过多聚人血清白蛋白（PHSA）与前 S 2蛋白结合。所以 HBV 通过 PHSA 介质结合在肝细胞上，从而形成靶抗原，通过免疫反应引起肝细胞的损伤，进而可能发生肝细胞的增生，不典型增生，最终导致癌变。

3．肝癌及癌周肝组织内 HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前为止，在肝癌细胞内发现有 HBcAg 只有少数报道。所有的报道，HBcAg 的检出率都不太高，大多在 10%～20% 左右。HBcAg 和 HBeAg 在肝癌及癌周肝组织内不易检出或检出率较低的原因，可能是由于 HBcAg 和抗 HBc 常以免疫复合物的形式存在于胞核内，HBcAg 被封闭之故；亦可能由于 HBcAg 基因和宿主基因进行了整合，使 HBcAg 不再表达出来。HBcAg 和 HBeAg 经常并存，因此 HBeAg 亦经常不易单独检出。HBcAg 或 HBeAg 阳性物质呈均匀细颗粒状分布于胞核内，少数见于核仁内。位于核内常呈圆形或卵圆形，围绕核仁占据整个核或占据核的大部分。少数病例 HBcAg 阳性物质位于胞浆内或胞膜上，有的病例核、膜及浆内同时阳性。HBcAg 阳性细胞的分布与 HBsAg 的分布相似。

关于肝癌的免疫学方面的研究，血清学方面的研究较多，组织学研究的较少。大量的流行病学和临床学方面的资料表明，肝癌患者血清中抗 -HBc 明显高于对照组，其阳性率高达 70%～95%。用免疫组化技术在肝癌及癌旁肝组织内亦发现有抗 -HBc 的存在。有人证实抗 -HBc 为 IgG，这种 IgG 经常和 HBcAg 以复合物的形式存在于细胞核内，少数也见于胞浆及胞膜上。并证实，IgG 只见于含有 HBcAg 的胞核内，而无核内 HBcAg，就无抗 -HBc 存在。因此，如果能测出 IgG（抗 -HBc），也就间接地证实了 HBcAg 的存在。IgG(抗 -HBc)阳性呈圆形或卵圆形位于核内或以包涵体位于胞浆内。IgG 阳性细胞的分布状态和 HBcAg 的分布相同。IgG(抗 -HBc)在肝癌发病中起何作用，目前尚不清楚，有人认为 IgG 和 HBcAg 形成免疫复合的，由于免疫反应，在慢性活动性肝炎发病中和肝硬变形成中起重要作用，而慢活肝和肝硬变又是肝癌发生的重要环节。HBcAg 和抗 -HBc 形成的免疫复合物是否为癌变的始动因素，还有待进一步研究。

4．肝癌及癌周肝组织内 HBxAg 的定位及分布近年来，对 HBV 分子生物学研究发现了 HBV 另一种抗原，即 HBxAg。HBxAg 和肝癌发生的关系密切，已引起人们广泛的重视。目前，国内外已有少数文献报道关于 HBxAg 和肝癌发病的关系的研究。在人原发性肝癌组织内 HBxAg 的检出率大约为 60%～80%，这明显高于 HBsAg 的检出率。在癌周肝组织内 HBxAg 阳性检出率在 70%～80%，这和 HBsAg 的检出率基本相似。用 PAP 或 ABC 方法检测 HBxAg，其阳性物质呈棕褐色均匀细颗粒状，主要位于癌细胞和肝细胞胞浆内，部分病例除胞浆阳性外，胞膜或核亦阳性（约 20%），单独膜型或核型少见。不同病例 HBxAg 阳性物质的分布及阳性反应强度是不同的，就是同一病例不同部位，其结果也不尽相同。一般来说，癌周肝组织内 HBxAg 阳性检出率及阳性反应强度比癌组织内高。其反应强弱与 HBxAg 含量多少有关。HBxAg 阳性细胞分布与 HBsAg 阳性细胞分布相似，亦分为散在型，局灶型和弥漫型。在癌周硬变组织内，HBxAg 阳性细胞有时围绕小血管分布。有的则沿着纤维膈分布。在 HBxAg 阳性病例，有 24% 在癌组织内伴有 HBsAg 和 / 或 HBcAg，有 72% 在癌周肝组织内伴有 HBsAg 和 / 或 HBcAg。HBx-Ag 在肝癌发病中的作用，目前尚不完全清楚。有人报道在肝癌患者血清中含有较高的抗 -HBx，其检出率高达 85%。Miyaki 等（1986）发现在所检查的原发性肝细胞癌组织中都存在和 HBV 的 X 基因相同的 DNA 序列。有些作者认为，宿主细胞 DNA 和 HBv DNA 的整合是通过 X 基因区特殊的重组来完成的，其翻译产物 -HBx 蛋白（HBxAg）对癌基因具有反式激活作用，而引起细胞癌变。最近有人通过 HBV 的 X 基因在转基因小鼠中诱发肝癌的动物实验证明，HBx 蛋白能够改变宿主基因的表达，并导致肝细胞癌的发生。因此，有些作者认为 HBxAg 在肝癌发生中具有重要作用，并认为 HBV 可能具有直接致癌作用。

（四）肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内 HBV 抗原的分布

在原发性肝癌中，最常见的是肝细胞肝癌，而肝内胆管细胞癌比较少见，在我国大约为 10%。长期以来，人们对肝内胆管细胞癌的病因及发病机理研究甚少，认识不清。早年候宝璋曾报道，胆内提管细胞癌的发生与中华分枝睾吸虫感染有关。最近有文献报道，在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内检测出 HBv 5 中抗原（HBsAg、pre-S1、pre-S2、HBxAg 和 HBcAg），而且检出的阳性率很高。王文亮等报道（1993），在 20 例肝内胆管细胞癌中，HBxAg 阳性检出率为 75%，pre-S1和 S 2各为 40%，HBsAg 为 10%；在 19 例癌周肝组织中，HBxAg 阳性检出率为 84%，pre-S1和 S 2各为 47%，HBsAg t HbcAg 分别为 32%。在 20 例肝内胆管细胞癌的病例中有 17 例（85%）有不同 HBV 抗原的表达，其中 HBxAg 阳性检出率为 80%。这一结果表明，肝内胆管细胞癌的发生与 HBV 感染有密切关系。HBV5 种抗原在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内的阳性反应及阳性细胞分布状态与肝细胞肝癌相同。肝内胆管细胞癌的发病过程可能与肝细胞肝癌不完全相同。肝细胞肝癌 80% 伴有肝硬变，特别是大结节 型肝硬变。一般认为大多数肝细胞肝癌是由于 HBV 感染→慢性肝炎→肝硬变→肝癌。而肝内胆管细胞癌很少伴有肝硬变，它的发生过程主要不是通过肝硬变这一重要环节，而是由慢性肝炎，肝细胞不典型增生或中间型细胞演变为肝癌。HBV 是否有直接致癌的作用尚有等进一步研究。

（五）肝细胞癌中的 HBV 的分子生物学

近 10 年来，国内外对原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒 DNA 的存在，分布及意义进行了广泛的研究，并取得了可喜的成果。用 southern blot 分子杂交技术及原位分子杂交技术，在肝癌患者血清中和肝癌组织中检测 HBV-DNA 的分布状态。用 HBV-DHA 基因或其亚基因标记同位素（32P、35 S 等）及生物素地高辛等作为探针和肝癌及癌旁肝组织中的 DNA 进行杂交，通过放射自显影法检测 HBV-DNA 存在状态（是整合或游离）；原位分子杂交经过染色反应观察细胞内 HBV-DNA 的定位和分布状态。有人用 southern blot 方法检测肝癌病人血清中 HBV-DNA 的情况，只有少数病例血清中有微量的 HBV-DNA，则慢性乙型肝炎患者血清却多为阳性，提示在 HBsAg 阳性肝癌病人血清中很少或没有可测出的 HBV-DNA。目前，国内外已有不少文献报道，在肝癌组织中有整合的 HBV-DNA。例如，Shafritz 等（1981）检测了 20 例来自南非的肝癌患者，有 15 例 HBV-DNA 整合人宿主细胞 DNA 中，其中 12 例 HBsAg 阳性，3 例 HBsAg 阴性而抗 -HBs 阳性。Tiollais（1981）检查了 15 例来自欧洲的肝癌标本，HBsAg 或抗 -HBs 阳性病例，检查结果 HBV-DNA 均以整合形式存在。他们还观察了 32 例 HBsAg 阳性的肝癌病人，结果证明在所有肝癌组织中均有 HBV-DNA。国内大多数报道在肝癌组织中 HBV-DNA 检出率为 60%～80%。上述结果表明，人原发性肝细胞癌的发生和 HBV 感染有极为密切关系。

（六）肝癌发生中 HBV 分子遗传学及免疫机理

免疫病理学及分子生物学的研究表明，HBV 不仅有间接致肝癌作用，而且还可能有直接致癌作用。HBV 致癌作用的分子机理目前集中对于 HBV 的分子遗传学和分子免疫学的研究。在原发性肝细胞癌发生中，HBV 致癌作用可能有两个模式：一是病毒的癌基因模式，就是表达病毒的癌基因（HBV-DNA）；另一个是细胞癌基因模式，在肝细胞癌变过程中，细胞癌基因可能发生启动子插入，染色体异常（缺失、重复、易位）及点突变等。研究证明，机体感染 HBV 后，HBV 将其本身的基因掺入到肝细胞核内，和宿主细胞基因发生整合，从而使正常的肝细胞转变为癌细胞。这需要经过一个复杂的演变过程。在肝癌的 HBV-DNA 整合部位，常发生染色体缺失、重复或易位。Slagle 等（1990）研究发现，有 44% 的肝细胞癌病人发生染色体的丢失，而 17P 的丢失常包括抑癌基因 P 53的丢失，这可能是肝细胞癌发生的原因。Blum（1985）认为在 HBV-DNA 整合位点附近宿主细胞基因有重排现象。Tiollais 等认为病毒 DNA 整合人宿主细胞 DNA 或与 DNA 发生重排，产生 HBV 激活的基因或激活细胞的原癌基因，进而导致细胞的转化，最终发生肝癌。有人通过实验研究证明病毒插入到细胞原癌基因附近，作为一种诱变剂，可能直接参与肝细胞癌的发生。Seifter 等（1990）在体外进行 X 基因的转化实验，将 HBV-DNA 或 X 基因序列连在 SV40早期启动子的加强子上，用以转化传代鼠肝细胞及传代鼠纤维母细胞，转染成功的能稳定复制 HBV 的肝细胞表现出恶性生长的特征，将其接种裸鼠，显示出致癌性，并激活细胞原癌基因 c -fos 过量表达。这提示，HBV-DNA 含有致癌基因序列，可以促进细胞向恶性转化。HBV 基因组中编码加强子和 X 蛋白的碱基序列也有某些致癌活性。尽管如此，到目前为止，HBV 致癌的分子机理尚不完全清楚，有待进一步研究。

（王文亮）

参考文献1. 张忠兵，等. 双标记免疫荧光法研究胃粘膜中抗体产生细胞分布. 上海免疫学杂志,1983;3(2):304～305

2. 张忠兵, 等. 正常胃十二指肠粘膜抗体产生细胞分布 - 冷酒精固定法免疫荧光研究. 中华消化杂志,1983;3(3):167～168

3. 张忠兵, 等. 胃癌及其周围组织抗体产生细胞的免疫细胞化学研究. 中华肿瘤杂志,1984;6(5):326～328

4.ZhangZhongbing, et al. Immunocytochemical and histochemical studies on T lymphocytesand immunoglobulin- producing cells in gastric carcinoma. Chinese MedicalJournal, 1985;98(3):197～202

5.ZhangZhongbing, et al. Sc,IgA and IgA- producing cells in gastric muscosa of chronicgastritis and gastric carcinonia and their clinical significance. ChineseMedical Journal, 1988; 101(10):755～760

6.ZhangZhongbing, et al. Gastric musoca T lymphocyte, IgG-,IgM- and IgA- producingcells distribution in chronic gastritis. Biological Abstracts, 1989;87(1):2774

7. 张忠兵, 等. 用 Ia 和 OKT 单克隆抗体研究胃癌和食管癌患者的免疫功能. 解放军医学杂志,1987;12(5):352～354

8. 张忠兵, 等. 冷冻治疗对直肠癌患者免疫功能的调节 . 癌症杂志,1990;9(50:365～368

9.ZhangZhongbing , et al. Studies on gastrin in duodenal ulcer. Chinese Medical Joural, 1990;103(1):45～49

10.ZhangXueyong and Zhang Zhongbing. Antral D and G cell istribution in gastric andduodenal ulcer. Chinese Medical Joural, 1987;100(10):827～830

11.BraudtzaegP, et al. Ontogeny of the mucosal immune systtem and igA deficiency.Gastroenterology clinics of North America,1991;20(3):397～440

12.MesteckyJ, et al. Selective transprot of IgA: Cellular and molecular Aspects.Gastroenterology clinics of North America, 1991;20(3):441～472

13.Nadine cerf –Bensussan and Delphine Guy –Grand. Intestinal intraepitheliallymphocytes. Gastroenterology Clinics of North America, 1991;20(3):549～578

14.Stephen P. James. Mucosal T- cell funciton.Gastroenterology clinics of NorthAmerica, 1991;20(3):597～612

15. KutluT, et al. Numbers of T cell receptor (TCR) αβ+but not of TcRr+intraepitheliallymphocytes correlate with the grade of villous atrophy in coeliac patients ona long term normal diet. Gut, 1993;34(2):208～214

16.Sachdev GK, et al. Human colonic intraepithelial lymphocytes suppress in vitroimmunoglobulin synthesis by autologous peripheral blood lymphocytes and laminapropria. Gut, 1993;34(2):1993；257～263

17.RuthleinJ, et al. Anti- CD2and anti –CD3induced T cellcytotoxicity of human intraepithelial and laminal propria lymphocytes. Gut ,1992:1626～12632

18 HongP, et al. Epithelial cells bearing class II nolecules stimulate allogenic humancolonic intraepithelial lymphocytes. Gut ,1992;33(8):1089～1093

19. CaiWQ(蔡文琴)and Gabelle G. Innervation of thebiliary pathways in guinea –pigs. J Anat., 1983;136:97～101

20. 李巍, 等. 小肠铺片 PAP 染色的体会. 第三军医大学学报,1990;12(3):224～225

21. 蔡文琴. 胃肠道植物性神经分布的研究进展. 何译涌, 主编. 组织与胚胎学进展. 人民卫生出版社,1987:83～102

22. 蔡文琴. 豚鼠小肠壁内神经丛的形态学观察. 解剖学杂志,1985;8(2):95～99

23. 王正品, 蔡文琴. 大鼠小肠血管活性肠肽、P 物质、亮氨酸 - 脑啡肽和生长抑素的正常分布. 解剖学报,1989;20(1):68～73

24. 黄祯祥, 主编. 病毒性肝炎研究进展. 北京科学技术出版社,1986:65～76, 167～205

25. 张定风, 乙型病毒性肝炎免疫及临床. 科学技术出版社重庆分社,1985:48～87,139～171

26. 梁英锐. 乙型病毒性肝炎的免疫病理学. 国外医学: 生理病理学分册,1981;1:21

27. 周庆均, 主编. 病毒性肝炎. 人民卫生出版社,1980:29～51

28. 王文亮, 等. 肝癌及其周围组织内的乙型肝炎表面抗原(HBsAg). 中华肿瘤杂志,1979;1:101

29. 王文亮, 等. 肝癌及其周围组织内的乙型肝炎核心抗原(HBcAg). 中华医学杂志,1980;60:99

30. 谭承项, 等. 肝组织内 HBsAg 的免疫组织化学研究一、细胞膜 HBsAg 的观察. 中华内科杂志,1983;22:13

31. 王文亮, 等. 肝癌及其周围组织内 IgG（抗 -HBc）的分布及意义. 中华病理学杂志，1983；12：30

32. 张晓东, 等. 肝硬变组织内 HBv DNA 和 HBsAg 的分布及意义. 第四军医大学学报,1991;12:405

33. 王文亮, 等. 慢性肝炎, 肝硬变和原发性肝癌内 HBxAg 的表达及意义. 第四军医大学学报,1992;13～88

34. 王文亮, 等. 慢性肝炎和肝硬变内 HBV 的前 S 1和 S 2抗原的表达及意义. 中华消化杂志,1993;13:8

35. 王文亮, 等. 慢性肝炎和肝硬变内 HBxAg 的分布与 HBsAg 和 HBcAg 的关系. 第四军医大学学报,1992;13:244

36. 李煊, 等. 纤维结合蛋白在肝硬变组织的免疫化学研究. 中华病理学杂志,1988;17:124

37. 朱明华, 等.III 型胶原在肝炎、肝硬变和肝细胞癌的免疫组化定位. 第四军医大学学报,1993;14:32

38. 苏勤, 等. 慢性乙型肝炎和肝硬变中肝细胞角蛋白的异常表达. 中华病理学杂志,1992;12:287

39. 应越英, 等. 原发性肝细胞癌与肝硬变和乙型肝炎的关系. 肿瘤,1981;1:1

40. 王家駹, 等. 原发性肝炎与肝癌、肝硬化关系的探讨. 中华消化杂志,1981;1:104

41. 步宏, 等. 肝细胞癌与乙型肝炎病毒感染. 国外医学: 肿瘤学分册,1990;5:260

42. 金 灵, 等. 肝癌组织内乙型肝炎病毒 X 抗原的检测. 中华病理学杂志,1990;19:228

43. 陈梅龄, 等. 用原位杂交技术对肝细胞性肝癌 HBv DNA 分布的研究. 中华病理学杂志,1989; 18:178

44. 王文亮, 等. 人原发性肝癌内乙型肝炎病毒 S 1和 S 2抗原的表达及意义. 中华病理学杂志,1992;14:83

45. 王文亮, 等. 人原发性肝癌内乙型肝炎病毒 X 抗原 (HBsAg) 的免疫组化研究. 中华肿瘤杂志,1992;14:330

46.PughJc, et al. Expression of x gene of hepatitis B virus.J Med Virol, 1986; 20:229

47.PasekM, et al. Hepatitis B virus gene and their expression in E. coli.Nature,1979;282(5739):575

48.MeyersML, et al. Hepatitis B virus polypeptide X:expression in E. Coli andidentification of specific antibodies in sera from hepatitis B virus infected humans. J Virol,1986; 57:101

49. KinEM, et al. HBx gerne of hepatits B virus induces liver cancer in transgenicmice. Nature, 1991; 351(6324):317

50.WangWL, et al. HBxAg in the liver from carrier patients with chronic hepatitis andcirrhosis .Hepatology, 1991; 14:29

51. WangWL, et al. Hepatitis B x antigen in hepatitis b virus carrier patients withliver cancer. Cancer Res, 1991;51:4971

52.TheilmannL, et al. Detection of pre-S1proteins in serum and liver of HBsAg-positive patients: a new marker for hepatitis b virus infection. Hepatology,1986;6:186

53.Alberti A, et al. The pre-S/anti- pre –s systems in hepatitis B virus infection. In: Robinson W, eds. Hepadna viruses.New York: Alan R Liss Inc, 1987:397

54.KlinkertMQ, et al. Pre- S antigens and antibodies early in the coures of acutehepatitis B virus infection. J virol,1986; 58:522

55.PontissoP, et al. Human liver membranes contain receptors for the hepatitis B viruspre- S1region and via polymerized human serum albumia, for the pre-S2region . J virol, 19889;63:1981

56.Shafritz DA, et al. Identification of integrated hepatitis B virus DNAsequences in human hepatocellular carcinoma. Hepatology,1981; 1:1

第十四章 肾脏疾病免疫细胞化学60 年代初期，人们已认识到肾小球肾炎为一种免疫性疾病，是溶血性链球菌、葡萄球菌等病原体侵入人体后引起的变态反应性疾病。1968 年 Dixon 根据荧光显微镜的观察结果，提出肾小球肾炎的发病机制可分为抗肾小球基底膜性肾炎和免疫复合物性肾炎两个类型。1980 年 Couser 根据多个学者的动物实验观察，又提出了除循环免疫复合物可沉积于肾小球内而引起肾小球肾炎外，尚可在肾小球内有原位免疫复合物形成而导致肾小球肾炎发生。1982 年 Cameron 又指出，多价大分子抗原与多量高亲合力之抗体相遇时，可形成大分子的不溶性免疫复合物，当系膜细胞清除能力降低时，即沉积于肾小球系膜区内而引起肾小球肾炎。此外，除上述之体液免疫发病机制外，目前已有多数学者证实细胞免疫亦在肾小球肾炎的发病机制中起重要作用。所有这一系列肾炎发病机制的深入研究，皆有赖于免疫学理论的不断进展和免疫细胞化学技术的应用。目前，应用免疫细胞化学技术对肾脏疾病的诊断更为重要的意义。过去对于肾脏疾病的诊断手段过于简单而落后，一般仅依据病人的临床表现（如尿量变化、水肿及高血压等）和化验室尿常规检查结果（如蛋白尿、血尿、管型尿等）进行诊断。即使 Iverson 和 Brun 于 1951 年开展明穿刺后，病理学家也仅能进行光学显微镜的一般形态学观察，根本无法作出正确的诊断和分类。近年来由于免疫细胞化学技术的迅速发展，为肾脏疾病的诊断提供了有力的武器，肾脏病理学因之有了迅猛的发展，各型肾小球疾病的病理实质才为人们进一步深入认识。本章 将较系统地介绍免疫细胞化学技术在肾脏疾病领域中的应用。

第一节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围在肾脏疾病时，免疫细胞化学技术主要应用于肾脏穿刺组织的检查，也可应用于血清或肾脏洗脱液及尿液的特殊检查，兹分述如下：

一、肾脏组织的检查肾穿刺组织一般应切割为三小块，分别作冰冻切片、石蜡切片及超薄切片，进行荧光显微镜、光学显微镜及透射电镜观察。所应用的免疫细胞化学技术包括免疫荧光、免疫酶标及免疫电镜，兹分述如下：

（一）免疫荧光细胞化学技术的应用

自 1938 年超高压汞灯荧光显微镜问世后，Coon 于 1942 年首先应用荧光素标记抗体检查肺炎球菌，为荧光抗体技术的发展奠定了基础。1961 年 Dixon 开始在肾脏疾病中应用，对肾脏的免疫病理研究起了重要的推动应用，并逐渐成为在肾脏疾病的病理诊断中不可缺少的重要环节。主要用于冰冻切片，具体操作技术如下：

1．切片及染色肾组织要求为未经任何处理的新鲜组织，应立即送入恒温冷冻切片机（cryostat）内，将肾组织放置于金属托上，周围添加 OCt compound 包埋剂（如无包埋剂，滴加数滴生理盐水亦可），迅速冷冻至 -20℃，切出 3~5μm 厚的冰冻切片附贴于载玻片上，至少需切 10 张以上备用。继而使用荧光素标记之各种抗体进行免疫荧光染色（具体操作步骤参见第三章）。所使用之荧光标记抗体包括羊或兔抗人各种免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)、抗人补体各种成分（C1q、C4、C2、C3、C5、备用素、B 因子等）以及抗人纤维蛋白元等，以期了解肾小球内有何种免疫球蛋白沉积、补体激活的途径和有无凝血机制启动。此外，目前尚有应用荧光标记之抗纤维连接蛋白（fibronectin）、抗层粘连蛋白（laminin）、抗 α - 纤溶酶抑制因子（α-PI）、抗纤溶酶原（P1q）等特殊抗体，以探讨研究各种肾小球肾炎时肾小球内纤维连接蛋白和层粘连蛋白分布情况的变化以及凝血和纤溶系统成分的变化。常使用之荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC，显绿色荧光）及异硫氰四乙基罗达明（Rodamine B-200，显橙红色荧光），对各种抗体进行标记。必须指出，每种荧光抗体只能检测一种相应抗原，因此必须准备多张冰冻切片，才能满足检查要求。一般在检查每一种抗原时，只能使一种相应抗体用荧光显微镜进行观察。如果同时需要检查二种抗原时，可同时使用 FITC 及 RB-200 标记的不同抗体进行双标记法观察。

2．荧光显微镜观察一般要求使用质量较高的荧光显微镜，最好使用落射光型，以提高在高倍镜观察时之清晰度，并应配备电子摄影装置，以便及时进行记录。进行荧光显微镜观察时，滤光片之配合使用十分重要。以常用之日本 olympus 荧光显微镜为例，观察 FITC 标记之抗体时，激发滤光片须使用 RG-12，而压制滤光片应使用 O -350，如观察 RB-200 标记之抗体时，激发滤光片须使用 UG-1，而压制滤光片应使用 R -610。观察时应做以下记录：①使用抗体的种类。②荧光显示的部位：如显示于肾小球毛细血管壁、系膜区、肾球囊壁、肾小管基底膜、间质血管壁及间质细胞等。③荧光显示的型式、：为连续线形、不连续颗粒状、团块状或短线状，不规则状等。④荧光显示的强度：可分为（—）荧光弱、（±）为荧光微弱、（+）为明确可见荧光、（++）为明亮荧光、（+++）为耀眼荧光。在特殊情况下可进行双重标记，即分别使用 FITC 标记和 RB-200 标记的两种不同抗体，在同一切片上进行染色，使用不同滤光片进行观察及摄影，以绿色荧光和橙红色荧光在同一张切片上显示两种抗原分布的部位。

3．荧光显微镜摄影技术使用荧光显微镜观察时，由于光源紫外线的照射，切片标本上抗原的荧光亮度常很快逐渐减弱，并可发生荧光淬灭现象；且免疫荧光染色的切片不能长期保存，因此必须立即及时进行显微摄影以记录所观察到的情况，以作为诊断根据和作为资料保存。摄影时一般应使用感光速度较快的彩色胶片，以 160 或 400ASA 为宜，才能保证拍摄出良好的荧光图像。必须指出的是，在标本的荧光强度不太明亮时，使用自动曝光摄影设备常不能取得良好的摄影效果。由于在摄影过程中，荧光强度逐渐减弱，照像机快门常长期不能关闭，以致影响摄影效果。因此，各个实验室应根据所使用的荧光显微镜的具体情况，以手动控制自动摸索适宜的摄影条件。一般应首先使用黑白胶片在低倍镜及高倍镜下对中等荧光亮度的标本以不同曝光时间进行摄影，根据底片曝光效果找出合适的曝光时间。待积累一定经验后再使用彩色胶片进行摄影。根据个人的经验，以 Olympus 落射光型荧光显微镜为例，中等荧光亮度的标本，使用 160ASA 彩色胶片，于低倍镜下摄影，曝光时间为 1~2min 即可，高倍镜下摄影时曝光时间需延长 1 倍。曝光时间适宜之彩色胶片，洗印后荧光呈绿色；如呈现黄色，即为曝光过度，应减少曝光时间。一般在荧光显微镜摄影时，最好应准备 3 个照像机暗盒，分别拍摄彩色正片（作幻灯片用）、彩色负片（作实验记录用）及黑白负片（供发表文章 用），以保存完整之资料。

必须指出，肾组织冰冻切片的免疫荧光染色法特异性强、敏感度高，对荧光标记物的分布部位、分布型式扩荧光强度显示极为明确。可在组织及细胞水平进行定位观察，为国际上公认的较好观察方法。但因其需要恒温冷冻切片机、荧光显微镜等昂贵设备，且切片不能长期保存为其不足之处。

如未能及时制作冰冻切片，亦中使用石蜡切片进行荧光染色。石虹节 片需经二甲苯脱蜡，降酒精至水，用 0.1% 胰蛋白酶在 37℃温箱内消化 20min，以暴露其抗原决定簇。再用各种荧光标记抗体按常规步骤进行染色后，荧光显微镜观察。石蜡切片之荧光观察效果不佳，其结果仅可作为参考。

（二）免疫酶标细胞化学技术的应用

由于免疫荧光技术的应用受一定的条件限制，1966 年 Nakane 使用辣 根过氧化物酶（HRP）代替荧光素对抗体进行标记，通过酶的显示使抗原定位，称为酶标记抗体技术。其后，1969 年 Mason,1970 年 Sternberger 又在基础上发展了非标记酶抗体法。包括酶桥法和过氧化物酶 - 抗过氧化物酶复合物法（PAP）。这一技术的建立，为医学、生物学的各个领域提供了一个很好的研究手段，在免疫学和免疫病理学的研究和诊断工作中已日益广泛应用。

1．免疫酶标技术及其进一步发展 免疫酶标细胞化学技术较免疫荧光细胞化学技术有不少优点。首先，酶标法染色之切片使用普通的光学显微镜即可观察，切片可以长期保存；用苏木素进行细胞核的重复染色后，还能对组织结构和抗原进行细致确切的观察和定位。PAP 法的特异性和敏感性皆优于荧光抗体法，且操作简便，适合于一般实验室应用（详见第四章）。

免疫酶标技术以明确的颜色（棕褐色或鲜红色）显示抗原沉积的形式（细线状、颗粒状或团块状），又可精确地定位，不但可以判断抗原沉积于肾小球毛细血管壁或系膜区，也可辨别出抗原在毛细基血管基底膜内外侧的沉积部位。故免疫酶标法在此方面的优于免疫荧光法，但其反应强度受力人为因素干扰较大（如作用时间的长短、抗体浓度的差别等），且有时背景出现非特异性染色，而影响对结果的判断。如果组织内源酶未消除干净，亦可出现假阳性结果。

近年来，由于单克隆抗体的制备成功和应用，推动了免疫细胞化学技术的进一步发展。单克隆抗体是通过细胞融合技术，建立杂交瘤细胞株而产生的高纯度抗体。由于免除了抗原种或株间的交叉反应，因而提高了抗原抗体反应的特异性和敏感性。在肾脏疾病的研究中，主要用于肝炎病毒抗原的检测，如使用抗 HBsAg 或抗 HBeAg 单克隆抗体，用 ABC 法检测肾小球中肝炎病毒抗原的存在部位和数量等。

目前，由于分子生物学的进展，原位核酸分子杂交技术已与免疫细胞化学技术相结合，而成为分子杂交免疫细胞化学技术（详见第二十章）。这一技术在病理学上的应用可以从核酸及其功能活动水平上，在细胞或组织的原位显示有助于诊断或研究的信息。目前常使用乙型肝炎病毒（HBV）的 DNA 标记后作为探针，研究乙肝病毒相关性肾炎肾组织中 HBV-DNA 之存在状态。

2．光学显微镜观察及摄影技术由于免疫酶标技术的应用，使用光学显微镜可对肾组织内沉积的抗原性物质（包括免疫复合物）进行定性、定位及定量观察。例如肾小球内沉积的 IgG、IgA、IgM 等免疫球蛋白 C1q、C3 等补体成分以及纤维连接。蛋白（fibronectin）和 HBV 病毒抗原等的存在部位、分布形式和状况及量的多少，并结合形态学观察，研究其与形态学变化之间的关系。观察时常需使用油镜。观察结果需进行摄影记录。摄影时应使用研究用显微镜附有摄影设备及自动曝光装置。摄影技术在具备自动曝光设备条件下简便易行，但滤光片之选择甚为重要。在拍摄彩色反转片（制作幻灯片时）时，应使用灯光型彩色反转片，滤光片无需使用，直接用钨丝灯泡之黄光即可进行摄影。如使用普通之日光型彩色反转片时，则需使用蓝色滤光片。在拍摄彩色负片（制作彩色照片用时），由于皆为日光型胶片，故需使用蓝色滤光片。拍摄彩色胶片时，首先需注意胶卷之感光度，应将自动曝光装置调至相应位置；另需在拍摄每张胶片前皆需调节 色温，以保证获得良好的彩色效果。在拍摄黑白胶片（供发表论文用）时，应使用绿色滤光片，以加强反差，提高摄影效果。

（三）电镜免疫细胞化学技术的应用

免疫电镜在细胞超微结构水平应用抗原与相应抗体能特异性结合的原理，使用标记抗体对细胞内存在的抗原性物质进行定性、定位和定量观察，是免疫细胞化学技术在亚细胞水平的进一步发展。

1．免疫电镜标本制备肾脏组织的免疫电镜标本制备与一般透射电镜标本的制备有所不同，其具体步骤如下：

（1）固定与包埋：肾脏组织一般采用低浓度戊二醛为固定剂，而不使用锇酸，以尽可能多地保存抗原活性，常使用甲醛 - 戊二醛固定液（甲醛 4%，戊二醛 0.05%~0.5%）。包埋剂常使用 Lowicryl K4M（丙烯酸酯类化合物）或 LRWhite 树脂在 -20~35℃低温下包埋，以紫外线照射使之聚合。避免使用常规之环氧树脂包埋，因环氧树脂需加热使之聚合，而使标本之抗原活性下降。

（2）修块、定位及切片：包埋后之组织块经初步修块后，先在超薄切片机上用玻璃刀（勿用钻石刀）切出一张 0.5~1μm 厚的半薄片，用 1% 硷性复红或美蓝溶液进行染色，在光镜下观察组织内肾小球的数量及病变情况，挑选出一个病变最为典型的肾小球，作出标记。然后在组织块上定出相应部位，用刀切去周围组织，修成约 0.1mm 大小之组织块，再用超薄切片机切出 500。A 厚度的超薄切片。

（3）免疫标记：目前应用最多的是胶体金标记抗体（详见第七章）。

2．免疫电镜观察肾组织标本皆采用包埋后染色，第一抗体为特异性抗血清（如兔抗人 IgG），第二抗体为胶体金标记之抗体（如猪抗兔 IgG，金标记 Au10）。最后用枸椽酸铅（或醋酸铅）作对照染色，在透射电镜下观察。根据金颗粒的分布状况，可作定位、定性及定量观察，了解肾小球超微结构成分的变化、探讨肾脏疾病的病原及研究免疫复合物（沉积之电子致密物质）的组成成分等（详见后）。

二、血清或肾脏洗脱液的检查肾脏疾病时，血清学检查亦甚为重要，现仅就与免疫细胞化学有关者介绍如下：

1．血清或肾脏洗脱液内抗肾小球基底膜抗体的测定在快速进行性肾小球肾炎（RPGN）及 Goodpasture 综合征病人血清中常存在有抗肾小球基底膜抗体，对病人血清进行检查有重要的诊断意义。动物实验中，对马杉氏肾炎等实验性肾小球肾炎动物，进行肾脏洗脱液的检查，以确定有无抗肾小球基底膜抗体的存在。一般常用免疫细胞化学技术进行检查，先将病人血清与灵长类（如猴等）的肾组织冰冻切片在 37℃湿盒内孵育半小时，再将切片用 FITC 荧光素或 HRP 标记的抗人 Igg 抗体处理。如果病人血清中存在有抗肾小球基底膜抗体，即可与切片上的肾小球基底膜相结合，进一步与荧光标记抗人 IgG 抗体相反应，而显示沿肾小球毛细血管壁呈连续线形之荧光分布（酶标抗体亦显示同样之连续线形分布）。本方法又可用于与抗肾小管基底膜抗体和抗核抗体的鉴别。

2．血清中循环免疫复合物内 IgG 亚类的分析以 3% 聚乙二醇（PEG）沉淀病人血清中大分子蛋白质，分别使用鼠抗人 IgG 亚类 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 的单克隆抗体，以 ELISA 法测定免疫复合物内 IgG 亚类的分布状况。以同样方法亦可测定肾小球中沉积的免疫复合物内的 IgG 亚类。Noel 报道，不同肾炎时肾小球内沉积之 IgG 亚类有所不同。原发性膜性肾炎之沉积物为 Igg 1 和 IgG4，狼疮性肾炎之沉积物为 IgG1、IgG2 和 IgG3。

3．血清中 Tamm-Horsfall 糖蛋白（THP）的测定 THP 是由肾小管髓袢升支厚壁段及远曲小管上皮细胞合成的糖蛋白，主要存在于正常人的尿中，血清中含有微量。当肾功能减退时，血及尿中 THP 明显降低，尿毒症时则血及尿中几乎测不出 THP。目前可使用抗 THP 单克隆抗体，用 ELISA 夹心法测定血清中 THP 的含量。第一抗体使用鼠抗人 THP 单克隆抗体，第二抗体为 HRP 标记的兔抗鼠 IgG。

4．其它血清中自身抗体如抗核抗体、抗双链 DNA 抗体、抗 Sm 抗体等的测定，对狼疮性肾炎有诊断意义。抗着丝点抗体的测定对进行性系统性硬化（硬皮病）有诊断意义，以上测定皆使用免疫荧光法，具体操作不再赘述。

三、尿液的检查1．尿中 THP 测定如前所述，使用抗 THP 单克隆抗体进行测定。除在慢性肾功能损害时血中及尿中 THP 下降以外，目前提出当肾移植急性排斥反应时或毒性物质导致肾小管大量破坏时，尿中可出现 THP 升高。

2．尿中抗体包裹细菌的测定尿路感染可分为上尿路感染（肾盂肾炎）和下尿路感染（膀胱炎、尿道炎及前列腺炎）。上尿路感染时，细菌来源于肾组织，机体对细菌产生抗体而包裹于细菌表面，形成抗体包裹细菌（ACB）。抗体为 IgG、IgA 或 IgM 组成，可用荧光素标记的抗人 lgG、lgA、或 lgM 与之结合而使其显示荧光。反之，下尿路感染之细菌，一般不能形成抗体包裹细菌，用免疫荧光检查常为阴性，故能对上下尿路感染进行鉴别诊断。

3．尿沉渣中管型及粘液丝中免疫球蛋白之测定使用直接荧光进行观察，肾小球肾炎病人尿沉渣中管型及粘液丝可观察到 IgG、IgA 或 IgM。一般认为是由于病变肾小球漏出之免疫球蛋白，与肾小球内沉积之免疫球蛋白可能无关。但泌尿系感染时尿中粘液丝中很少检出免疫球蛋白。故本检查有助于肾小球肾炎与泌尿系感染的鉴别。

四、肾小球细胞的体外培养肾小球的固有细胞有 3 种，即系膜细胞、脏层上皮细胞及内皮细胞。近年来随着细胞培养技术的发展，肾小球的体外培养亦受到了重视。1969 年 Bernik 首先在体外培养肾小球成功，并初步培养出系膜细胞，1975 年 Fish 正式分离培养系膜细胞获得成功，1978 年 Kreisberg 分离培养上皮细胞成功，1984 年 Striker 分离培养内皮细胞成功。目前，国内亦有不少单位从事肾小球细胞体外培养工作，已取得一定成绩。肾小球细胞的体外培养，不仅限于正常人及兔、鼠等动物，目前亦发展至肾脏病人肾穿刺组织进行细胞培养。经体外培养的一生长之原代培养细胞需进行鉴定，除使用光学显微镜及电子显微镜观察其形态及结构外，尚需进行免疫细胞化学染色而使用一系列免疫酶标记的相应抗体。例如使用抗结蛋白（desmin）单克隆抗体和抗肌动蛋白（actin）单克隆抗体（ABC 试剂盒），对上皮细胞进行鉴定，二者皆为强阳性。使用抗细胞角蛋白（cytokerfatin）单克隆抗体（ABC 试剂盒），对上皮细胞进行鉴定，以硷性磷酸酶为底色，上皮细胞胞浆内可见红色颗粒。内皮细胞之鉴定则使用抗Ⅷ因子单克隆抗体（因第Ⅷ因子只在内皮细胞内生成）。

此外，目前已认识到天很多生物活性因子如白细胞介素 - 1 及 6、血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGFβ）、内皮素等皆可对系膜细胞、上皮细胞及内皮细胞起作用。使用其合成及分泌多种细胞因子如血小板活化因子、前列腺素 E2、白细胞介素 -1、6、8 等。人们可应用分子杂交免疫细胞化学技术，探知系膜细胞、上皮细胞或内皮细胞中相应细胞因子 mRNA 的表达，从而了解在不同肾小球疾病中各种细胞功能的变化。对肾小球体外培养细胞的分子生物学研究，开拓了研究肾小球疾病机制的广阔领域。

第二节 荧光或酶标抗体在肾脏内显示的部位及形式在不同的肾脏疾病时，荧光标记抗体或免疫酶标记抗体在肾脏内显示的部位、分布情况和型式（pattern）皆有所不同。现根据其在肾脏内显示的不同部位叙述如下：

一、肾小球毛细血管壁荧光标记或酶标记抗 IgG 抗体在肾小球毛细血管壁沉积的型式可分为线条状及颗粒状。连边续线形荧光常为抗肾小球基底膜抗体所致的肾炎，如 Goodpasture 综合征。不连续颗粒状荧光常为循环免疫复合物或原位免疫复合物所致的肾炎。但当抗肾小球基底膜性肾炎的肾小球毛细血管壁因遭受破坏而断裂时，连续线形荧光可变为不连续的短线状。反之，免疫复合物性肾炎的沉积物过于密集时，可以出现假线条状荧光。而抗补体各种成分（如 C1q、C3、B 因子等）的抗体及纤维蛋白元抗体在肾小球毛细血管壁的沉积往往呈颗粒状。

根据荧光标记或酶标记抗体沉积的范围，可分为下列三种情况。

1．弥漫型 颗粒状荧光普遍而均匀地分布在肾小球毛细血管袢的各个部位。常见于膜性肾小球肾炎、毛细血管内增生性肾小球肾炎和狼疮性肾炎的弥漫型。

2．不规则型 颗粒状荧光或短线状荧光不规则地分布于肾小球毛细血管袢，常见于快速进行性肾小球肾炎。

3．局灶性节 段性型 仅部位肾小球的某个节 段有颗粒状荧光，而大部位肾小球不显示荧光。常见于局灶性节 段性肾小球硬化及狼疮性肾炎的局灶节 段型。

二、肾小球系膜区某些免疫球蛋白可沉积于肾小球系膜区而呈颗粒状或团块状荧光。如 Iga 肾病时系膜区有 IgA 沉积，IgM 肾病时系膜区有 IgM 沉积，狼疮性肾炎的系膜型可在系膜区有 IgG、IgA、IgM 沉积。除上述之免疫球蛋白可在系膜区沉积外，目前对系膜区细胞外基质的研究已逐渐深入，酶标记抗体可分别显示系膜区内纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原及Ⅳ型磁原之分布状况。

三、肾小球毛细血管壁及系膜区免疫球蛋白沉积于肾小球毛细血管壁，同时也沉积于系膜区，呈颗粒状。常见于系膜毛细血管性肾小球肾炎及狼疮性肾炎的弥漫型。

四、新月体性新月体性肾小球肾炎时，在新月体内可见有 IgG 及补体 C3 呈颗粒状沉积，并常出现纤维蛋白元（Fb）沉积。在 Goodpasture 综合征时常可有多数新月体形成，亦可在新月体内出现 IgG 及纤维蛋白元的颗粒状沉积。

五、肾小球球囊腔在急性毛细血管内增生性肾小球肾炎伴有球囊腔内渗出性病变时，可于球囊腔内出现 IgG 及纤维蛋白元的颗粒状沉积。在眦癜性肾炎及 Wegener’s 肉芽肿时，偶可于球囊腔内有纤维蛋白元沉积。

六、肾小管狼疮性肾炎时，免疫球蛋白既可沉积于肾小球，也可沉积于肾小管基底膜，有时肾小管上皮细胞的胞核亦可显示荧光。

七、小动脉系统性硬化（硬皮病）、紫癜性肾炎、Wegener’s 肉芽肿及恶性高血压病时，小动脉壁及细动脉壁可有纤维蛋白元沉积呈颗粒状。

八、紧间质狼疮性肾炎时，肾间质可见有多种免疫球蛋白及补体 C3 沉积。Sjogren 综合征的部位病例可于肾间质内有 IgG 呈颗粒状沉积。在以单核细胞浸润为主要表现的间质性肾炎，肾间质中可用 Tamm – Horstall 糖蛋白的沉积。

第三节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中应用的意义一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中的应用的意义（一）肾小球疾病发病机制的研究

应用免疫荧光或免疫酶标技术，可对肾小球内免疫复合物沉积的机制、补体系统的激活途径、凝血机制的启动等进行研究，兹分述如下：

1．免疫复合物的形成及沉积的机制 有下列三种情况：

（1）抗原及抗体在血液循环中结合形成循环免疫复合物沉积于肾小球：常见于毛细血管内增生性肾小球肾炎，抗原（如链球菌、葡萄球菌等）侵入人体后，免疫系统产生相应抗体。抗原与抗体在血液循环中形成免疫复合物，经血液流至肾脏而沉积于肾小球内。荧光显微镜可见 IgG 沿肾小球毛细血管壁有弥漫性不连续的颗粒状荧光，一般其分布不太均匀，大小亦不太一致。

（2）肾小球抗原导致的原位免疫复合物形成：在感染或某些因素作用下，肾小球基底膜的结构成分了生改变而具有抗原性，可刺激机体免疫系统而产生抗基底膜抗体，可与肾小球基底膜结合而形成原位免疫复合物。在荧光显微镜下可见 IgG 沿肾小球毛细血管壁呈连续线状荧光。常见于 Goodpasture 综合征。

（3）非肾小球抗原导致的原位免疫复合物形成：外源性抗原在一定条件下可先植入肾小球基底膜，抗原刺激免疫系统可产生相应抗体而出现于血液中，这种循环抗体当流经肾小球时与原先植入肾小球基底膜的抗原在原位结合而形成原位免疫复合物。在荧光显微镜下可见 IgG 沿肾小球毛细血管壁呈大小一致的、分布均匀的颗粒状荧光。常见于膜性肾小球肾炎。

2．补体系统激活的途径 补体系统一方面参与机体的正常防御功能，另一方面又可参与变态反应而引起组织损伤。补体的成分既可直接破坏靶细胞，又可产生炎症介质（如过敏毒素和趋化因子）而促发炎症反应，并可启动凝血机制，故在肾小球肾炎的发生发展过程中起着重要作用。补体的激活途径有二，即经典途径和旁路途径。

（1）经典途径：抗原与抗体结合形成免疫复合物后，抗体的 Fc 段被激活，暴露其补体结合点，可与补体 C1q 结合，进一步使 C1r、C1s 活化，再依次活化 C4 及 C2，而使 C3 活化，继之 C5、C6、C7、C8、C9 相继活化。

（2）旁路途径：细菌内毒素或脂多糖可使血清中 C3 激活剂前体（C3PA）转化酶被激活，在备解素作用下，使 C3PA（又称 B 因子）转化为 C3A（C3 激活剂），而使补体 C3 激活，然后依次激活 C5 至 C9。

在多数肾小球疾病，补体之激活皆为通过旁路途径：仅少数肾小球疾病，如狼疮性肾炎、Wegener’s 内芽肿等，其补体之激活为通过经典途径。因此，了解肾小球疾病时补体系统激活的途径有重要的鉴别诊断意义。例如在肾小球系膜区有多量 IgA 沉积时，同时有备解素 B 因子显示阳性，即其补体激活为旁路途径，此时则可诊断为 IgA 肾病。但如 C1q、C4、C2 显示阳性，即其补体激活为经典途径，则应诊断为狼疮性肾炎。

3．凝血机制的启动 在肾小球肾炎时，由于炎症造成肾小球毛细血管内皮细胞的损伤，毛细血管基底膜的暴露，以及补体 C3b 的免疫粘附作用使血小板聚集，而激活凝血因子Ⅲ、凝血因子ⅩⅠⅠ和血小板因子 3，启动了凝血机制，结果使血浆中的纤维蛋白元转变为纤维蛋白（即纤维素）而于肾小球毛细血管内形成微血栓。如果炎症严重而发生渗出时，肾小球毛细血管内的纤维蛋白元也可渗出至球囊腔内，进一步转变为纤维素。球囊腔内的纤维素可刺激球囊壁层上皮细胞增生而形成新月体，使病变逐渐恶化。因此，对纤维蛋白相关抗原（FRA）的免疫荧光或酶标染色观察有重要的意义。

（二）判断肾脏疾病是否为免疫性疾病

在肾小球或肾小管如发现有免疫球蛋白或补体沉积时，一般皆为免疫性疾病，说明体液免疫参与其发病机制。其表现多种多样，已如前述。如未能发现有免疫球蛋白及补体沉积时，一般提示为非免疫性疾病，如 Alport 综合征、Fabry’s 综合征及良性复发性血尿等。但慢性硬化性肾小球肾炎时，往往不能发现有免疫球蛋白或补体的沉积，有时偶可发现不规则而稀疏的免疫球蛋白散在性分布，这是由于硬化的肾小球病变陈旧，已无免疫反应参与。又如微小病变肾病，临床表现有严重的肾病综合征，但其肾穿刺标本荧光显微镜检查为阳性，无任何免疫球蛋白及补体沉积，这仅能说明体液免疫未参与其发病机制。现已证明本病为细胞免疫球蛋白及补体沉积，这仅能说明体液免疫未参与其发病机制。现已证明本病为细胞免疫异常所致，故仍为免疫性疾病。此外，在糖尿病性肾小球硬化时，常可见到肾小球内有 IgG 沿毛细血管壁呈连续线形沉积，这种现象目前认为是 IgG 的非特异性沉积，不能认为是免疫性疾病。

（三）有助于某些肾小球疾病的确诊

某些肾小球疾病，虽然其临床表现多种多样，但其肾穿刺组织检查有其免疫荧光或酶标染色的特征性表现，往往有助于肾小球疾病的确诊，甚至在光镜观察及电镜观察之前即可作出诊断。例如 IgA 肾病在临床上除表现为反复发作性血尿外，也可表现为蛋白尿、高血压、肾病综合征等。但如荧光显微镜发现肾小球系膜区有 IgA 沉积，并有备解素或 B 因子显示为旁路途径激活补体时，即可确诊为 IgA 肾病。如同时伴有皮肤紫癜、腹痛或关节 疼痛时，即可确诊为紫癜性肾炎。又如 IgM 肾病之诊断依赖于肾小球系膜区的 IgM 大量沉积；膜性肾小球肾炎之诊断则可根据沿肾小球毛细血管壁均匀一致的颗粒状荧光；局灶性节 段性肾小球硬化的诊断有赖于 IgM 在部分肾小球的节 段性沉积。又如肾小球内有多种免疫蛋白沉积，并伴随有 C1q、C4 或 C2 的沉积，显示补体系统为经典途径激活，即可确诊为狼疮性肾炎。因此，荧光显微镜的观察在诊断上占有很重要的地位。

（四）其他

目前对免疫球蛋白轻链和肾小球系膜内的细胞外基质，以及肾小管间质性疾病进行了研究，现介绍如下：

1．免疫球蛋白轻链在各型肾小球疾病中的分布 各种免疫球蛋白的重链，根据其结构及抗原性的不同，而可分为 IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。轻链则仅有两种类型，即 Kappa 及 Lambda（κ 轻链及 λ 轻链）。目前使用荧光素标记之羊抗人 κ 及 λ 单克隆抗体，对人类各型肾小球肾炎观察轻链分布之情况。初步观察结果为：系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、局灶性硬化性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎时，κ 与 λ 的轻链的沉积皆无明显差异，而 IgA 肾病时主要为 λ 轻链沉积，淀粉样变时则为大量 κ 轻链沉积。目前又有轻链性肾病的提法，常见于多发性骨髓瘤患者，可见有大量 κ 轻链沿肾小球底膜、肾小管基底膜、肾小球系膜区、小血管壁及间质中沉积，实际上仍为类似淀粉样之病变。

2．细胞外基质（ECM）的研究 肾小球中细胞外基质的变化与肾小球硬化的发生有十分密切的关系，目前已受到重视而成为研究的重点。ECM 是种多种成分形成的高度有序列的网络结构，主要包括胶原、糖蛋白及蛋白多糖三类大分子物质。

（1）胶原：ⅠⅡⅢ型胶原呈纤维束状分布，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原呈纤维网状分布。

（2）糖蛋白：起将细胞粘着于细胞外基质的作用，主要包括纤维连接蛋白（fibronectin,FN）和层粘连蛋白（laminin, LN）。

（3）蛋白多糖：包括硫酸肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。

从形态上，肾小球中 ECM 可分为系膜基质和肾小球基底膜两部分。近 10 余年来，ECM 多种成份分离纯化的成功，相应抗体的制备，为利用免疫荧光或酶标技术对研究肾小球 ECM 的组成和分布提供了有利条件。目前研究结果表明，系膜基质及基底膜皆含有网状的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原，系膜基质中含纤维连接蛋白较多，而基底膜中含层粘连蛋白较多，且硫酸肝素含量丰富。肾脏间质中则主要为束状的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原。这些正常分布状况在肾小球疾病时可发生变化。目前已证实，在系膜增生性肾小球肾炎时，系膜基质中可出现Ⅰ型及Ⅲ型胶原，一般认为由系膜细胞所产生。此外，如前所述，很多生物活性因子可对系膜细胞起作用，使其增殖并合成及分泌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、FN、LN 及蛋白多糖，促进 ECM 的增多，逐渐使肾小球发生硬化。应用分子杂交免疫细胞化学技术，可对系膜细胞等探知相应分子的 mRNA 表达，从而更深入地研究肾小球硬化的发生机制。

3．肾小管间质性疾病 与免疫异常有关者有二种情况：

（1）肾小管间质中免疫复合物沉积：常见于狼疮性肾炎，可见 IgG、IgM、IgA 及 C3 呈颗粒状沉积于肾小管基底膜、肾小管周围毛细血管壁或散在于肾间质中。这种颗粒状沉积还可见于肾移植排斥反应。少数 Sjogren 综合征的少数混合性冷球蛋白血症，也可见于特发性间质性肾炎。

（2）抗肾小管基底膜抗体性肾小管间质性疾病：在 Goodpasture 综合征时，除可见沿肾小球基底膜有 IgG 呈连续线形荧光外，同时也可看到肾皮质部的肾小管有 IgG 和 C3 呈连续线形沉积，最初常出现于近曲小管。这说明体内有抗肾小管基底膜抗体产生。此外，在一些药物性间质性肾炎、特发性间质性肾炎或肾移植急性排斥反应时也可见 IgG 及 C3 沿肾小管基底膜呈连续线形沉积。

二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义1．用以研究正常和病理状态下肾小球的超威结构成分及其变化 应用免疫酶标记的各种 ECM 成分的单克隆抗体，使用免疫电镜观察正常肾小球中各种结构成分如各型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、硫酸肝素等在基底膜和系膜区的分布状况，并对比观察在病理情况下出现的变化。这有助于深入了解肾脏疾病的时超威结构成分的分布和数量变化。

2．探讨肾脏疾病的病源 应用免疫电镜可清晰显示乙肝病理在肾小球及肾小管的分布部位及数量，以及确定其在细胞内之位置（胞浆内或胞核内）和与在上皮下或内皮下沉积之免疫复合物间的关系。目前并 可利用分子生物学技术鉴别乙肝病毒有无复制，从而深入探讨乙肝病毒相关性肾炎的发病机制。

3．研究肾小球内沉积之免疫复合物的组成成分及其形成过程 应用不同大小胶体金颗粒标记多种免疫球蛋白，以显示肾小球中沉积的电子致密物质（即免疫复合物）中各种免疫球蛋白的组成情况，以分析免疫复合物的组成成分。在动物实验中，可动态地观察肾小球肾炎时免疫复合物的形成过程。例如在动物的被动性 Heymann 肾炎时观察到特异抗体首先沉积于肾小球上皮细胞膜表面的有被小窝内，进一步聚集成帽，而后脱落至上皮下而成为上皮下沉积物的动态过程。这有助于对肾小球肾炎发病机制的深入研究。

4．有助于正确评价免疫荧光的观察结果 糖尿病性肾小球硬化病人的肾穿刺标本，免疫荧光观察显示 IgG 沿肾小球毛细血管壁呈连续线形荧光。目前有人应用免疫电镜技术未能证实有相应免疫球蛋白存在，这提示糖尿病时的免疫荧光阳性结果可能为肾小球基底膜通透性增加而导致的非特异性沉积所致。

第四节 各种肾脏疾病的病变以及免疫荧光（酶标）表现特征各种肾脏疾病各有其特殊病理改变，亦有其相应的免疫荧光（酶标）表现特征，现介绍如下：

一、原发性肾小球疾病1．微小病变肾病 临床表现为肾病综合征。光镜下可见肾小球上皮细胞轻度肿胀。电镜下可见上皮细胞足突融合，荧光观察无免疫球蛋白沉积。

2．局灶性节 段性肾小球硬化 临床表现为肾病综合征。光镜可见部分肾小球有节 段性硬化及玻璃样变。电镜可见上皮细胞足突融合，部分肾小球有节 段性毛细血管袢塌陷和系膜基质增多。荧光可见部分肾小球有节 段性 IgM 呈颗粒状沉积，主要沿毛细血管壁沉积，偶可有系膜区沉积，有时可见 C1q 及 C3 沉积。

3．局限性肾炎 临床表现为血尿、蛋白尿和肾脏综合征。光镜可见部分肾小球有增生、渗出、坏死或硬化性病变。电镜可见系膜细胞增生、系膜内沉积物、毛细血管血栓及坏死。荧光可见 C1q、IgA 及 C3 呈局灶性节 段性系膜区沉积，纤维蛋白元（Fb）沉积，偶可见 C1q 及 C3 呈线形 沉积。

4．弥漫性膜性肾小球肾炎 临床表现为肾病综合征或有血尿。光镜可见肾小球毛细血管壁弥漫性增厚，钉突及上皮下沉积物。电镜可见弥漫分布之上皮下沉积物及钉突，有时可出现基底膜内沉积物。荧光可见肾小球毛细血管周围有 C1q、C3 呈均匀一致性颗粒状沉积，偶可见 IgM、IgA、C1q、C4 及 Fb 沉积。

5．弥漫性系膜增生性肾小球肾炎 临床表现为镜下血尿或蛋白尿，严重时可出现肾病综合征及肉眼血尿。光镜可见弥漫性系膜细胞增生、系膜基质增多及系膜内沉积物。电镜可见系膜区沉积物，上皮细胞足突变平或消失。荧光可见系膜区有 IgG、IgA、C3 或有 IgG 及 C3 呈弥漫性颗粒状沉积。

6．弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎 临床表现为急性肾炎综合征或肾病综合征。光镜可见内皮细胞及系膜细胞增生，系膜区有单核细胞或中性白细胞浸润，肾小球毛细血管腔变狭窄。电镜可见上皮下沉积物（驼峰），偶可见内皮下及系膜内沉积物。荧光可见肾小球毛细血管周围有 IgG 及 C3 或有 IgM、IgA 呈颗粒状沉积，偶可有 C1q、C4、备解素及 Fb 沉积。

7．弥漫性系膜毛细血管性肾小球肾炎（膜增殖性肾小球肾炎 I 型及 III 型）临床表现为肾病综合征，或为急性肾炎综合征有肉眼血尿，可能出现快速进行性肾衰。光镜可见系膜细胞增生及“间位”，基底膜呈双层化。肾小球增大而呈分叶状，III 型并可见有钉突形成。电镜可见系膜细胞有插入现象（间位），I 型可见内皮下沉积物，III 型可见上皮下沉积物。荧光可见 C3 呈粗大不规则颗粒状沉积于肾小球毛细血管周围及系膜区，常伴有 IgG、IgM、C1q、X4、备解素及 Fb 沉积。

8．致密沉积物性肾小球肾炎（膜增殖性肾小球肾炎 II 型）临床表现为肾病综合征、肉眼血尿及快速进行性肾衰。光镜可见肾小球基底膜为 PAS、伊红及 Masson 染色呈强阳性，而银染色着色甚浅，有 1 / 3 病例可出现新月体。电镜可见基底膜致密层内有电子致密物质沉积。荧光可见 C3 呈粗大颗粒状沉积于系膜区或毛细血管周围，但不见有免疫球蛋白沉积。

9．弥漫性新月体性肾小球肾炎 临床表现为快速进行性肾炎综合征，偶有肾病综合征。光镜可见 50%～80% 肾小球有各型新月体（细胞性、纤维细胞性、纤维性）。电镜可见肾小球基底膜有裂口，有时有内皮下沉积物。荧光可见新月体及肾小球毛细血管腔内有 Fb 沉积，有时可见 IgG 及 C 3沿毛细血管壁呈连续线形沉积。

10．弥漫性硬化性肾小球肾炎 临床表现为慢性肾衰。光镜可见大量肾小球呈球性硬化，球囊壁增厚、粘连，肾小球萎缩，间质纤维化。电镜可见反映原始病变之变化。荧光可见 IgG、IgM、C3呈不规则、稀疏的非特异性沉积。

二、继发于全身性疾患的肾小球疾病1．狼疮性肾炎 临床表现为蛋白尿、血尿、肾病综合征、肾功能减退、低补体血症，抗核抗体（+）。光镜下可分为六型，即轻度病变、系膜增生、局灶性节 段性增生及坏死、弥漫增生（接种环样病变及新月体）、系膜毛细血管性及膜型。电镜可见系膜内、内皮下及上皮下沉积物，指纹状沉积物、管泡状小体、苏木素小体。荧光可见各种 Ig、C1q、C4、C3、Fb 沿肾小球毛细血管壁及系膜区呈颗粒状沉积，肾小管基底膜和血管壁亦有同样荧光。

2．IgA 肾病 临床表现为持续性或复发性血尿，蛋白尿，偶有肾病综合征，缓慢发展为肾功能不全。光镜可见弥漫性或切段性系膜细胞增生及系膜区增宽、基质增多，偶有新月体形成。电镜可见系膜内沉积物，偶可有上皮下及内皮下沉积物。荧光可见 IgA 及 C3 在系膜内呈颗粒状或团块状沉积，可伴有 IgG 及 IgM。

3．紫癜性肾炎 临床表现为血尿、蛋白尿，皮肤紫癜，偶可有肾病综合征。光镜可见系膜增生，局灶性节 段性坏死及增生，系膜毛细血管性或新月体性肾炎病变。电镜可见系膜内、内皮下及上皮下沉积物。荧光可见 IgA、IgG、C3 及 Fb 在系膜内沉积，Fb 在毛细血管腔、毛细血管壁及球囊腔内沉积。

4．Goodpasture 综合征 临床表现为肺出血及肾炎。光镜可见局灶性坏死性肾小球肾炎，有多量新月体形成。电镜可见内皮下电子透亮区，一般无沉积物。荧光可见 IgG 及 C 3沿肾小球毛细血管壁呈连续线形沉积，偶可呈颗粒状沉积。另可见有 Fb 沉积。

5．细菌性心内膜炎时的肾小球肾炎 临床表现为血尿、蛋白尿、急性肾炎综合征、快速进行性肾炎。光镜可见系膜细胞增生、局限性坏死及新月体形成。电镜可见系膜细胞增生，系膜内及上皮下、内皮下沉积物。荧光可见 IgG、C3呈颗粒状沉积，有时有 IgM、IgA 及 Fb 沉积。

6．分流性肾炎 临床表现为肾病综合征、镜下血尿、氮质血症。光镜可见弥漫性系膜毛细血管性肾小球肾炎。电镜可见基底膜双层化及内皮下沉积物。荧光可见 IgG、IgM、C3沿毛细血管壁呈颗粒状沉积。

7．疟疾性肾病 临床表现，急性型为血尿、蛋白尿，慢性型为肾病综合征、肾功能不全。光镜：急性型为轻度系膜增生性肾小球肾炎，慢性型为毛细血管壁增厚，可伴有细胞增生。电镜可见系膜内沉积物，基底膜增厚，上皮下或基底膜内沉积物。荧光可见 IgM、IgG、C3沿毛细血管壁呈颗粒状沉积，偶可见 C1­q 及 C4。

8．血吸虫性肾病 临床表现为肾病综合征、镜下血尿、慢性进行性肾衰。光镜为系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎及局灶性节 段硬化。电镜及系膜细胞增生，系膜内及上皮下或内皮下沉积物。荧光可见 IgG、IgM、C3在系膜区及沿毛细血管壁沉积，偶可见 IgA 及 IgE。

三、结缔组织病时的肾脏损害1．结节 性动脉周围炎及 Wegener’s 肉芽肿 临床表现为血尿、蛋白尿、高血压及急性肾衰。光镜为肾小球局灶性节 段性坏死、弥漫性增生、系膜毛细血管性肾小球肾炎及新月体形成。电镜为肾小球毛细血管内血栓、系膜增生、基底膜破裂。荧光为 IgG、IgM 及 C 3沿毛细血管壁呈颗粒状沉积，于坏死节 段及血管壁有 Fb 沉积。

2．系统性硬化（硬皮病）临床表现为蛋白尿、偶有肾病综合征、氮质血症、恶性高血压。光镜为小叶间动脉内膜增厚、粘液样变性或纤维素样坏死，肾小球毛细血管袢皱缩、栓塞及梗死。电镜为毛细血管皱曲、基底膜增厚、系膜基质增多。荧光可见纤维素、各种免疫球蛋白及 C 3于坏死区沉积。

3．干燥综合征（Sjogren’s 综合征）临床表现为口眼干燥、肾小管性酸中毒。光镜为中度～重度间质性肾炎，肾小管萎缩。电镜无改变。荧光为肾间质内浸润之浆细胞内有 IgG 沉积，肾小管基底膜有灶性 IgG、IgM 及 C 3沉积。

四、血管性疾患导致肾脏的损害1．良性肾硬变 临床表现为高血压、镜下血尿、轻度蛋白尿。光镜为细动脉玻璃样变，肾小球毛细血管袢皱缩，系膜区增宽，纤维性新月体。电镜为系膜基质增多，偶有少量系膜内沉积物。荧光为阳性。

2．恶性肾硬变 临床表现为严重高血压、血尿、蛋白尿、肾衰。光镜可见肾小球毛细血管袢缺血性皱缩及切段性坏死，新月体形成。电镜可见基底膜皱曲，内皮下透明带。荧光可见肾小球及动脉壁有纤维素沉积。

3．溶血性尿毒症综合征 临床表现为溶血性贫血，血小板减少性紫癜，肾小血管内血栓，急性肾衰。光镜可见人球细动脉、小叶间动脉及弓形动脉分支管壁有纤维素样坏死及血栓形成，肾小球毛细血管袢皱缩及节 段性纤维素样坏死。电镜可见基底膜皱曲，内皮下透明带，小动脉内皮细胞脱落，腔内有纤维素及红细胞碎片。荧光可见肾小球及动脉壁有纤维素、IgG 及 C 3沉积。

五、代谢性疾患引起的肾脏损害1．糖尿病性肾小球硬化 临床表现为蛋白尿，偶有肾病综合征、中度高血压，晚期出现肾衰。光镜：弥漫型为系膜基质增多，系膜区增宽；结节 型为 K—W 结节、假性动脉瘤及“玻璃帽”，肾小球及肾小管基底膜增厚，人球细动脉玻璃样变。电镜可见基底膜显着增厚，系膜基质增多，偶见基底膜内及系膜区沉积物。荧光可见 IgG 沿肾小球毛细血管壁、球囊壁及肾小管基底膜呈连续线形沉积，偶可见 IgM 及 C 3在系膜区沉积。

2．淀粉样变 临床表现为蛋白尿、肾病综合征，偶有肾静脉栓塞，急性或慢性肾衰。光镜可见肾小球毛细血管壁及系膜区有淀样物质沉积，甲紫及刚果红染色阳性。电镜可见淀粉样原纤维，上皮下钉突样结构。荧光可见淀粉样变区域有 IgG 及 C 3沉积，Kappa 轻链阳性，抗淀粉样蛋白 A（AA）阳性，抗淀粉样蛋白中血浆成分（AP）阳性。

3．多发性骨髓瘤 临床表现为 Bence—Jone 蛋白尿，急性及慢性肾衰，偶有肾病综合征。光镜可见系膜结节，肾小管萎缩，层次管型及多核巨细胞。电镜可见系膜结节，内皮下沉积物及肾小管周围沉积物。荧光可见 Kappa 轻链于肾小球毛细血管壁及肾小管周围沉积，管型亦有明显荧光，主要为 IgG 及 Kappa 轻链。

4．Waldrenstrom’s 巨球蛋白血症 临床表现为蛋白尿，偶可有肾病综合征，Bence Jone 蛋白尿，急性肾衰。光镜可见系膜结节，肾小球毛细血管内巨大玻璃样血栓。电镜可见系膜结节，内皮下沉积物，肾小管周围沉积物。荧光可见 IgM 沉积于玻璃样血栓内。

5．混合性冷球蛋白血症 临床表现为蛋白尿、肾病综合征、血尿、急性肾衰。光镜可见系膜毛细血管性肾小球肾炎，肾小球毛细血管堵塞（玻璃样血栓），系膜区沉积物。电镜可见内皮下及系膜内沉积物，内皮细胞胞浆中可见菱形或圆形之结晶体。荧光可见 IgM，Kappa 轻链及 C 3沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积。

六、某些特殊疾病时的肾脏损害1．乙肝病毒相关性肾炎 临床表现为轻度蛋白尿，镜下血尿。光镜可见膜性肾小球肾炎或系膜毛细血管性肾小球肾炎。电镜可见上皮下、内皮下、基底膜内及系膜区沉积物。荧光可见 IgA、IgG、IgM、C3及 HBsAg、HBeAg 沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积。

2．肝病性肾小球硬化症 见于肝硬变病人，临床表现为轻度蛋白尿及血尿。光镜可见肾小球系膜区增宽、系膜基质增多，毛细血管基底膜呈不规则增厚。电镜可见系膜区沉积物，基底膜增厚，内皮下出现电子密度稀疏区。荧光可见 IgA 及 C 3于系膜区呈颗粒状沉积（有人称之为继发性 IgA 肾病）。

3．镰状细胞贫血性肾病 临床表现为蛋白尿、肾病综合征、血尿。光镜可见局灶性节 段性肾小球厚化或系膜毛细血管性肾小球肾炎。电镜可见系膜细胞增生及插入，系膜区及内皮下沉积物。荧光可见 IgG 及 C 3沿肾小球毛细血管壁及系膜区呈颗粒状沉积。

七、遗传性和先天性肾病包括 Alport 综合征、良性复发性血尿（薄基底膜综合征）、先天性肾病综合征（Finish type）、婴儿肾病综合征（French type）、甲一髌综合征、Fabry’s 病等，荧光显微镜观察皆为阳性。

八、杂病1．妊娠毒血症性肾病 临床表现为蛋白尿、高血压、或有镜下血尿。光镜可见肾小球毛细血管内皮细胞高度肿胀，使毛细血管腔变狭窄。电镜可见内皮细胞及系膜细胞肿胀，内皮下及系膜区沉积物。荧光可见纤维素沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，可伴有 IgG、IgM 及 C 3。

2．放射性肾炎 临床表现为蛋白尿、高血压及肾衰。光镜可见肾小球毛细血管壁增厚及皱曲，节 段性坏死及硬化。电镜可见内皮细胞剥离，内皮下沉积物。荧光为阴性或有 IgM 呈节 段性沉积。

九、肾移植1．超急性排斥反应 发生于移植后几分钟至几小时，临床表现为高热、腰痛、无尿。光镜可见肾小球和间质的毛细血管内大量中性白细胞集聚，继而形成血栓并有血管壁纤维素样坏死。电镜可见肾小球毛细血管内有纤维素，内皮细胞剥落，基底膜疏松肿胀。荧光可见 lgG、lgM、和 C 3沿肾小球毛细血管壁呈线形沉积，间质小动脉壁有纤维素沉积。

2．加速性排斥反应（严重急性排斥反应）发生于移植后一个月内，临床表现为高热、腰痛、血尿、少尿并发展为无尿。光镜可见肾小球毛细血管及肾小动脉壁有纤维素样坏死及广泛微血栓形成，常继发出血及梗死。电镜所见与前大致相同。荧光可见血管壁有纤维素沉积。

3．急性排斥反应 发生于移植后二个月，临床表现为发热、腰痛、少尿及血压升高。光镜可见肾间质水肿及小圆形细胞湿润，人球小动脉及小叶间动脉管壁水肿、内皮细胞剥脱，甚至管壁纤维素性坏死。电镜所见与前大致相同。荧光可见 IgG、IgM、C3 及纤维素在小动脉壁沉积。

4．慢性排斥反应 发生于移植后数月至数年，临床表现为蛋白尿、高血压及肾功能减退。光镜可见细动脉及小动脉的闭塞性血管内膜炎，肾小球毛细血管袢皱缩，基底膜增厚，系膜基质增多，并有局灶性和弥漫性肾间质纤维化。电镜可见内皮下电子密度疏松区。荧光可见 IgG、IgM 及 C 3于肾小球系膜区和动脉壁有颗粒状沉积。

十、肾小管间质性疾病主要介绍过敏性间质性肾炎，多由磺胺、青霉素、庆大霉素、卡那霉素等药物引起。临床表现为蛋白尿、少尿甚至无尿。光镜可见肾间质水肿，有淋巴细胞、单核细胞及嗜性白细胞浸润。肾小管上皮细胞有灶状坏死，管腔内有蛋白管型。发展至慢性时，肾间质有淋巴细胞浸润及纤维化，肾小管萎缩。荧光可见 IgG 及 C 3于肾小管基底膜呈线形沉积。

参考文献1．Dixon FJ. The pathogenesis ofglomerulonephritis. Am J Med, 1968; 44:453

2.CouserWG, et al. In situ immune complex formation and glomerular injury. Kidney Int,1980; 17:1

3.CameronJS, et al. A role for insoluble antibody – antigen complexes inglomerulonephritis. Clin Nephrol, 1982; 18:55

4.Bhan AK,et al. Evidence for a pathogenic role ofa cell - mediated immune mechanism inexperimental glomerulonephritis. J Exp Med, 1987;148:246

5.SeymourAE, et al. Contributions of renal biopsy studies to the understandings ofdisease. Am J Pathol, 1971; 65:550

6. Coons AH, et al.Localization of antigenin tissue cell . II. Improvements ina method for the detection of antigen by means of fluorescent an-tibody . J Exp Med,1950; 91:1

7.Heya M,et al. Study on the intraglomerular fibronectin in primary and secondaryglomerular lesions. Jpn J Nephrol, 1986; 28:105

8.NakanePK, et al. Enzyme labeled antibodies: Preparation and application for thelocalization of antigens. J Histochem Cytochem, 1966;14:929

9.Mason TE, et al. An immunoglogulin – enzyme bridgemethod for localizing tissue antigens. J Histochem Cytochem, 1969; 17:563

10.SternbergerLA, et al. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry.Preparation and properties of soluble antigen –an ╟ tibody complex (Horseradish peroxidase – antiborseradishperoxidase) and its use in identification of spirochaetes. J Histochemcytochem, 1970; 18:315

11.HsuSM, et al. Use of avidin –biotin peroxidase complex (ABC) in immuno ╟ peroxidasetechnique: A comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. JHistochem Cytochem, 1981; 29(4:)577

12. 方利君，等. 小儿乙肝病毒相关性肾炎肾组织中乙型肝炎病毒 DNA 的存在状态. 中华肾脏病 杂志,1992; 8(2):65

13.Faulk WP & Taylor GM. An immuno colloid goldmethod for the electron microscope.Immunocytochemistry, 1971; 8:1081

14. NoelLH, et al . Glomerular and serum immunoglobulin G subclasses in membranousnephropathy and anti – glomerular basement menbrane nephritis. Clin Immunol Immunopathol, 1988;46:186

15.RoncoP, et al. Characterization of monoclonal antibodies against human Tamm – Horsfallprotein. Kidney Int ,1985; 28:694

16. RobertH, et al. Tamm -Horsfallglycoprotein and renal allograft rejection . Transplantation,1973; 16:83

17.FairleyJK ,et al. Protein composition of urinary casts from healthy subject and patients withglomerulonephritis. Brit Med J, 1983; 287:1838

18.BernikMB, et al. Contractile activity of human glomeruli in culture, Nephron, 1969; 6:1

19.FishAJ , et al. Human glomerular cells in tissue culture. Lab Imvest, 1975; 33:330

20.KreisbergHI, et al. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells invitro. Kidney Int , 1978; 14:21

21.StrikerGE, et al. Isolation, Characterization and propagation in vitro of humanglomerular endothelial cells. J Exp Med, 1984; 160:323

22.AtkinsRC, et al. Tissue culture of isolated glomeruli from patients with glomerulonephritis. KidneyInt , 1980;17:515

23.YoshiokaaK, et al. Glomerular localization ofType III collagen in human kidney disease. Kidney Int, 1989;35:1203

24. 周希静, 等. 免疫球蛋白轻链在肾小球疾病中的分布. 中会肾脏病杂志,1991; 7(4):214

25.FloegeJ, et al. Increased synthesis of ECM in mesangial proliferativeglomerulonephritis. Kidney Int,1991; 40:477

26.KerjaschkiD, et al. Initial events in the formation of deposits in passive Heymann nephritis.J Exp Med, 1987;166:109

27. 王海燕, 等. 免疫电镜技术及其在肾脏病领域中的应用. 中华肾脏病杂志,1991;7(5):312

28.JacobChurg & LH Sobin. Renal disease classification and Atlas of glomerular diseases.Igaku – Shoin. Tokyo. New York , 1982:7～17

第十五章 自身抗体的免疫组织化学检测方法和应用Friou 等（1957）首先用免疫荧光细胞化学技术检查系统性红斑狼疮病人血清中的抗核抗体后，随后，在多种自身免疫性疾病的诊断中，广泛应用了免疫细胞化学方法，为这类疾病的诊断和研究提供了重要的依据。

所谓自身免疫性疾病是指自身免疫反应引起组织损伤的疾病。在临床方面，有的自身免疫性疾病已明确是自身抗体直接作用于自身抗原产生的自身免疫应答所致；有的则难以证实自身免疫应答是组织损伤的原因。但是，在自身免疫疾病患者中能查出自身抗体，这一点却是一致的。至今，已无人对自身免疫现象及自身免疫性疾病的存在发生怀疑。

Mackay 和 Bune 从临床角度提出六点作为自身免疫性疾病的特征：①血清免疫球蛋白在 1.5g/100ml 以上；②有自身抗体；③病变部分有免疫球蛋白的存在；④病变部位有淋巴细胞和浆细胞浸润；⑤用肾上腺皮质激素治疗有效；⑥在同一个体与其他自身免疫疾病共存。

根据上述标准将自身免疫疾病归纳为如下三类：①全身各脏器组织发生广泛性进行性病变，并可查出自身抗体的疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）（抗核抗体），类风湿关节 炎（类风湿因子）等；②对特定脏器发生局限性自身免疫疾病，并可检查出特定脏器组织细胞抗体的同时，出现局限性病变的疾患，如自身免疫性溶血性贫血（抗红细胞抗体），桥本氏病（抗甲状腺抗体）等；③一过性自身免疫疾病。如咽喉，扁桃体感染在远离病灶的器官，由于自身免疫机制而引起一过性病变，如肾小球肾炎，风湿热等。

不论从临床诊断，治疗和预后随访，或是对自身免疫疾病的机理研究，自身抗体及其检查方法的研究是一个重要的问题。目前，对于自身抗体的研究越来越广泛，现在已有多种自身抗体被发现。用免疫荧光细胞化学方法，检查自身抗体已广泛应用于临床检验中，并已列入某些疾病的常规检查项目。用免疫荧光技术间接法检查病人血清中对自身某种成分的抗体，其突出的优点是抗体和相应组织成分结合后，通过观察发现明亮荧光的组织成分的形态特征而直接查出相应自身抗体，对于自身抗体的定性和定位同时进行，这种准确简便和快速性是其它方法难以达到的。早年在报告检查自身抗体多用人体组织作抗原切片，后来发现一些动物组织如小白鼠和大白鼠的器官组织，也可以和人血清中某些自身抗体结合，用动物组织代替人类组织作抗原更有利于这一检查方法的开展。现在，更进一步制备多种器官和组织的复合抗原切片标本，可以同时检出数种自身抗体，如慢性肝炎病人血清同时查出抗核抗体（ANA），抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体等自身抗体。这样更有利于过筛初检，方便病人和检查人员。

在荧光抗体检查阳性结果的基础上，许多实验室进一步作自身抗体的滴度检查，对诊断和鉴别诊断，疗效和病情随访都有一定的意义。荧光定量法可能具有更好的效果。目前，少数报告用显微分光光度计测定细胞的荧光量获得成功，这项技术和设备将促进荧光抗体技术向更精确的新阶段发展。

用荧光抗体法检查自身抗体的免疫球蛋白属性的工作已较普遍开展，对于所得阳性结果多数实验室是先用人 γ - 球蛋白或 IgG 荧光抗体检查所得，随后再分别用抗人 IgA、IgM、IgD、IgE 等单价荧光抗体检查，鉴别确定自身抗体免疫球蛋白属性。

第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法1．

（1）取大白鼠的肝、肾、心、小白鼠胃，人甲状腺，横纹肌等单独或制成复合冰冻切片（4～5μm，）。其中 1 片用 56℃甲醇固定 3min，另切一片不固定，分别放入湿盒中。

（2）将病人血清用 0.01mol/l Ph7.2～7.4 磷酸缓冲盐水（PBS）作 1：5 稀释，滴加覆盖抗原切征，置湿盒中，37℃，30～60min。

（3）切片用 PBS 洗 2 次，每次 5min。用电磁搅拌或振荡帮助洗净不参与反应的血清蛋白。吹干。

（4）滴加抗人 IgG 或 γ - 球蛋白荧光抗体（用 0.01% 伊文氏蓝稀释）覆盖切片，37℃中放置 30min。

（5）用 PBS 洗 2 次，方法同步骤（3），随后，再用蒸馏水洗 1min。

（6）缓冲甘油（pH9.0～9.5,PBS 或碳酸盐缓冲液 1 份和 1 份甘油混合）封片。

2．对照试验可作空白，替代，一步法抑制或吸收等对照，以证明阳性结果的特异性。

3．荧光显微镜检查阳性荧光呈明亮的黄绿色荧光，抗原组织成分呈现出阳性荧光时，即证明病人有对该组织成分的自身抗体，如细胞核呈明亮的黄绿色荧光即报告抗核抗体阳性。对阳性结果根据需要可进一步作滴度检查。

近来一些报告认为用培养细胞作某些自身抗体检查，可以取得良好的效果。

在检查自身抗体中常常可出现某种非特异性荧光，如粘液腺分泌物，粘液细胞，白细胞，胃粘膜表现的食物残渣，心肌异嗜性抗体反应等，以及有时用大白鼠胃组织切片出现的壁细胞非特异荧光等，容易引起混淆。这些问题都可通过对照试验（包括用正常人血清）和观察者的经验加以排除。

4．结果报告根据荧光显微镜观察的结果一是形态特征，二是荧光的亮度。在报告时先报告阳性荧光的形态名称加抗体如抗核抗体，再描述荧光亮度，主要靠观察者的主观目测，可分阴性和阳性两种结果，阳性又可分“+”为可见较弱的荧光，“++”为明亮的荧光，“+++”为耀眼的荧光。虽然这样的目测记录精确度可能在不同观察者之间有差别，但经过训练和有较多的观察经验后，这种方法基本上是可靠的，也便于推广应用。

近年使用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测方法，结果比较客观，将结果打印报告更适合于临床诊断和科学研究，应争取采用这些先进仪器和方法，改进结果的判断，记录和报告。

5．免疫酶组织化学检测自身抗体方法免疫酶组织化学间接法可以代替免疫荧光法用于自身抗体的检测，但尚未普遍采用。其优点是可以用普通显微镜观察结果，更适合于基层实验室使用，标本也可长期保存。

（1）抗原（与免疫荧光法相同）。

（2）操作方法：

①抗原切片先用 0.01mol/L pH7.4PBS 洗 1 次，吹干，放入湿盒中。

②滴加 1：5 稀释的待检血清，37℃，30min。

③PBS 洗 2 次，每次 5min，吹干。

④滴加适当稀释的酶标记 A 蛋白或抗人 IgG 抗血清，37℃，30min。

⑤用辣根过氧化物酶底物显色（同前述免疫酶法），室温 10min。

⑥水洗。

⑦0.1% 伊文氏蓝或苏木精染色 5min。

⑧水洗，常规酒精脱水，透明封片。

结果：阳性为棕色，阴性为蓝色。在第 3 步之后可用 1%H2O2作用 15min 消除内源酶干扰。

6．自身抗体的联合检测方法在血清中存在的多种自身抗体，可用多种组织抗原组合制作成复合抗原检测。抗原组成可包括以下组织：

（1）肝脏：①检出抗核抗体；②抗肝细胞膜抗体；③抗胆管上皮细胞抗体；④抗核仁抗体等。可用大鼠或小鼠肝组织。

（2）胃：①检出胃壁细胞抗体；②平滑肌抗体；③抗核抗体。必须用小鼠胃组织。

（3）甲状腺组织：①检出甲状腺球蛋白抗体；②检出甲状腺微粒体抗体；③检出抗第二胶质抗体；④检出抗核抗体。可用人、猴、兔等甲状腺组织。

（4）肾：①检出线粒体抗体（远端肾小管）；②抗核抗体；③抗基底膜抗体。

（5）心肌：抗心肌抗体。

（6）横纹肌：①肌无力全并胸腺瘤 A 带（暗带）抗体；②肌无力 I 带（明带）抗体和 H 带抗体；③肌无力白纤维骨骼肌抗体；④肌无力骨骼肌红纤维抗体。

（7）人结肠；抗结肠粘膜抗体。

（8）胰腺：胰腺细胞抗体。

（9）肾上腺：肾上腺皮质细胞抗体。

（10）神经组织：根据需要将多种抗原组合。

按间接法进行检测，如发现某种自身抗体，再作滴度测定，这是一种联合筛选试验，十分简便，已作常规应用。

7．微波增敏快速自身抗体检测方法近年微波技术用于免疫组织化学检测自身抗体方法，取得了良好的效果。微波是一种高频电磁波，经微波辐射引起离子极化，旋转，分子间磨擦，使能量发生转换，产生热能而加快了抗原抗体反应的速度，适用于临床快速检验和诊断。

（1）抗原切片（同免疫荧光法）。

（2）微波增敏快速方法

①抗原切片先用 PBS 洗，吹干，放入湿盒中（用有机玻璃制作，内放少许蒸馏水）。

②滴加 1：5 稀释的待检血清，将湿盒移入微波炉内转盘上，调中档微波强度辐射 1min，放置 5min。

③PBS 洗 2 次，各 1min。

④荧光抗体反应 1min（同步骤 2），放 5min。

⑤PBS 洗 2 次，各 1min。

⑥缓冲甘油封片。荧光显微镜检测。

（3）结果：阳性为黄绿色荧光，阳性为红色。微波炉型号不同，应经预实验选定强度和时间。

第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用在自身免疫性疾病的诊断中，目前常常用免疫细胞化学技术检查相应的自身抗体作为重要诊断依据之一，并以此探讨自身免疫性疾病发生的免疫机理。

用免疫荧光法可以检查的自身抗体日益增多，具有器官特异性的自身抗体如甲状腺球蛋白抗体和甲状腺微粒体抗体，甲状腺第二胶质抗体，肾上腺抗体，胃壁细胞抗体，皮肤表皮间粘合质（Intercellular Cement of epidermis）抗体和基底细胞层抗体，唾液腺导管细胞抗体，胰岛细胞抗体，肾小球基底膜抗体，结肠粘膜上皮多糖物质抗体，精子抗体，卵巢抗体，胃 G 细胞抗体等。

用免疫荧光法可以检查出的非器官特异性自身抗体，有抗核抗体，平滑肌抗体，线粒体抗体、横纹肌抗体、神经髓鞘（外周）抗体、抗网状纤维抗体等。

还有报告用免疫荧光法检查血细胞自身抗体如抗白细胞（淋巴细胞）、红细胞，血小板抗体等。

一、抗核抗体（Antinuclearantibodies, ANA）的检测Friou 等（1957）首先用免疫荧光法检查出存在于 SLE 病人血清中的 NAN，Alexander 和 Duthie（1958）证实了 Friou 等的结果。Friou 等（1958）检查了 28 例 SLE 病人血清中有 27 例 ANA 阳性。一例阴性属临床长期不活动性病人。以后大量报告都指出用免疫荧光间接法检查 ANA 对于临床诊断 SLE 有重要价值，其阳性率在 80%～100% 之间，阳性对于 SLE 病有确诊价值，但阴性不能完全排除 SLE，因为少数活动性 SLE 其 ANA 可能维持阴性，Fessel 氏认为可能是一种亚型。正常人 0%～4%，类风湿关节 炎、皮肌炎、硬皮病、sjogeren’s 综合征，混合性结缔组织病、慢性活动性肝炎等多种疾病也呈不同程度的 ANA 阳性率，ANA 可能是一种自身免疫反应的一个重要指标。ANA 在各种疾病中的百分率见表 15-1。

表 15-1 抗核抗体在各种疾病中的百分率

临床诊断人次阳性率（%）临床诊断人次阳性率（%）SLE6198.5Grave’s 病1523.5SLE（？）1457.1风湿病3023.3DLE1952.6风湿性心肌炎5420.3类风湿病6631.8心肌炎1458.3皮肌炎2160.6病毒性心肌炎2524.0重症肌无力966.6冠心病2813.6甲状腺炎（桥本氏病）2429.1心肌梗塞1735.4亚急性甲状腺炎1540.0心肌病4216.6I130治疗后甲亢4632.6糖尿病3724.3甲状腺机能亢进（甲亢）30022.0慢性萎缩性胃炎968.3甲状腺机能低下（甲低）1723胃炎36结缔组织病1359.2胃溃疡23疑为自身免疫性疾病86923.5胃癌3511.4急性肝炎8222.7非特异性溃疡性结肠炎1154.5乙型肝炎8265.8十二指肠溃疡837.5慢性肝炎（HBsAg）13227.3HBsAg 带菌者234.3慢性活动性肝炎977.7慢性气管炎79120.8慢性迁延性肝炎4419.1过敏性紫斑3肝硬化6127.3烧伤12胆汁性肝硬化3高脂血症6肝癌1827.7Adison’s 病3肝黄萎缩2718.5雷诺氏病3 2 例阳性地方性甲状腺肿2128.6扁平苔藓11地方甲状腺肿手术后25正常对照2815.3Hargraves 对狼疮细胞（1948）已进行了大量的研究，证明引起狼疮细胞发生的因子，为抗核成分的抗体。抗核抗体是一组对细胞核内 DNA，RNA 或组蛋白、或这些物质的分子复合物的自身抗体，目前发现至少有十七种。这些抗核抗体对于结缔组织病的致病病因的探讨和临床诊断均有重要帮助。这些结缔组织病各有不同的抗核抗体谱（Antinuclear Antibodies profile）。

目前，国内已建立了 11 种测定方法，提高了结缔组织病的诊断水平。

用作检查 ANA 的抗原很多，如鸡的红细胞核，人白细胞，皮肤，甲状腺、脾脏、淋巴瘤、胸腺、肾、羊膜细胞、颊细胞等，还有 Hela 细胞，大小白鼠的肝和肾冰冻切片（4～6μm）等，以成年小白鼠的肝切片最为常用。用动物细胞核作抗原，可以避免血型的干扰因素。Konice 氏等（1978）报告用马疫锥虫（Trypanosoma equiperdum, TE）作抗原测定 SLE 病人血清中抗双链 DNa（dsDNA）因 TE 的核和动基体为不含蛋白的纯 dsDNA，抗原性纯一，特异性强，不需提纯，为天然的 dsDNA 底物，据认为抗 dsDNA 抗体为 SLE 所特有，一些研究指出 dsDNA 抗体与 SLE 病情活动及狼疮肾炎的发病机理有密切关系，持续高滴度的抗 dsDNA 抗体是狼疮肾炎的不祥之兆。

1．抗核抗体的荧光形态及临床意义ANA 的荧光形态和其相应抗原有密切关系，ANA 的抗原性质和自身免疫性疾病有关，所以，观察荧光形态与临床诊断可能有一定联系。

（1）周边型（或称核周型）：可见荧光以核边缘强，核轮鲜明，靠核膜的荧光呈绒毛状，核中心荧光弱或无。这是天然 DNA 或去氧核糖蛋白的抗体产生的一种荧光形态，肝细胞核，肾小管上皮细胞核和鸡红细胞核较典型。常见于活动性系统性红斑狼疮病人血清中。药物引起的狼疮样综合征也常出现。这些病人病情严重，肾受累的约占 56%，与疾病进行性发展和狼疮细胞现象密切相关。

（2）均质型（或称弥散型）：可见全核呈均匀一致的黄绿色荧光，核轮廓明确。血清中这种抗体用脱氧核糖蛋白吸收可以消除。证明是由核蛋白抗体（主要是 IgG 类）与核中脱氧核糖蛋白反应的结果。此种荧光形态常见于活动性系统性红斑狼疮病人，偶见于恶性病或结缔组织病。滴度多在 1：160 以上。如将血清适当稀释即可出现其它染色形态，证明其中尚有其他荧光形态的抗体混在其中。弱阳性均质型意义不明，供血员有 3%～10% 的阳性。

（3）斑点型（或称小结型）：核轮廓不鲜明，核内呈斑点状荧光。由核内 Sm 抗原引起的一种抗体，包括 IgG、IgM 或 IgA 三类抗体。当用原血清染色时，斑点呈大团块状，稀释血清时变为分散的斑点状。主要见于硬皮病及肢端动脉痉挛病（雷诺氏病），也见于系统性红斑狼疮。

（4）核仁型：仅是核仁呈现黄绿色荧光，血清中此类抗体较少见。用肝细胞核和培养细胞作抗原可以检查出来。因血片中粒细胞及正常淋巴细胞中缺乏核仁抗原，检查不出此抗体。此型抗体可有 IgG、IgM 或 IgA 类。最常见于系统性硬化症、硬皮病、皮肌炎和 sjogren’s 综合征，其他胶原病很少见。

其次，还可见核膜型、结节 样网状型等，没有明确的诊断意义。ANA 的相应抗原和荧光类型见表 15-2。

表 15-2 ANA 的相应抗原和荧光类型

相应抗原荧光类型抗 DNA 抗体dsDNA周边型SSDNA周边型dsDNA+SSDNA周边型抗核蛋白抗体脱氧核蛋白均质型组蛋白均质型可溶性核抗原（ENA）斑点型抗核仁抗体低分子 RNA核仁型核糖体系 RNA核仁型2．ANA 的滴度与病情的关系Tablonska 等的研究认为活动期红斑狼疮 ANA 的滴度在 1：160 或更高，国内的报告滴度在≥1：80 则显示病情的活动性，滴度高是系统性红斑狼疮诊断的依据之一，高滴度与病情活动性相平行。高俊达（1979）对于 ANA 滴度变化的临床意义研究指出，60 例系统性红斑狼疮病人血清中 ANA 滴度的变化与病情活动性、脏器损害、预后和其他化验指标的关系如下：

（1）ANA 滴度在 1：80～160 以上有 80.5% 属临床活动性，有 89.5%～97.8% 缓解期病人在 1：160 以下。

（2）ANA 滴度变化与临床症状是一致关系，但先于疾病的活动而升高，后于症状的缓解而下降。

（3）ANA 滴度变化与狼疮细胞、血沉、尿蛋白和血清 γ 球蛋白含量异常一致。

（4）ANA 滴度可作强的松用量的选择参考，ANA 滴度在 1：160 以上者要加紧积极治疗，1：40 以下者可减至维持量。

ANA 的免疫组织化学检查对于诊断没有皮肤损害的红斑狼疮病帮助更大，取病人的皮肤作冰冻切片，用 ANa IgG 荧光抗体直接法染色，可见在表皮与真皮连接处显示荧光带。Tuffanelli 报告病人有皮肤损害，直接免疫荧光检查 ANA 的阳性率为 90%，在正常皮肤中红斑狼疮病人 ANA 的阳性率可达 56%，而后者在其他疾病极少见，因而有较大的诊断意义。

二、双链 DNA 抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用目前的研究指出，用免疫细胞化学检查病人血清中的 dsDNA 抗体为作为系统性红斑狼疮的诊断依据之一。佐佐木毅等和徐世玉等发现一些临床症状和血清学检查不典型的红斑狼疮病人，在发病早期就出现抗 dsDNA 抗体，认为这可能有助于早期诊断。

1．用马疫锥虫抗原检测抗 dsDNA 抗体方法

（1）底物制备：用马疫锥虫感染小鼠 2～4 天后，取小鼠的外周血，按血液细胞计数法作马疫锥虫计数，达到 4.3×106～5.6×106时即采尾血涂片，空气干燥后直接使用或 4℃保存备用。

（2）方法和结果：血涂片加入少量水溶去红细胞，待干。加入一滴被检血清于其上，移湿盒中，在室温中 30～40min，用 0.01mol/lpH7.4PBS 洗 5～10min，取出吸干，加兔抗人 IgG 荧光抗体，在湿盒中染色 30～45min，再按上法洗片，待干，荧光显微镜检查。阳性者可见锥虫的核及动基体发出明亮绿色荧光。

2．用短膜虫抗原检测抗 dsDNA 抗体方法

（1）底物制备：用北京生物制品研究所制备的短膜虫涂片标本作抗原。

（2）方法和结果：用上述马疫锥虫抗原的间接免疫荧光染色法。短膜虫是一种血鞭毛虫，动基体中含纯净的 dsDNA 可作为抗原，阳性结果可见虫体近尾或中部有一致密荧光亮点，为动基体，近头部有一淡绿色亮点，为细胞核。阴性结果动基体上无荧光。阳性血清自 1：5 稀释，测定效价。

3．用酸洗脱鼠肝细胞抗原检测抗 dsDNA 抗体方法（参考 Ta 的方法）

（1）底物准备：将 6 个月小白鼠剪断上腔静脉，立即用 0.01mol/l pH7.4 的 PBS 从门静脉灌洗至鼠肝发白，取出肝组织剪成接触面为 0.15cm×0.5cm 的小块，印片，空气中干燥后用丙酮固定 10min，再空气干燥。浸入 0.1mol/l HCl 中洗脱 30min，并轻轻的摇动，随后，再用 0.15mol/l PBS pH7.4 洗 2 次，每次 10min，再用 0.01mol/l pH7.6 的 PBS 洗 5min，空气干燥。即可用或在 4 ℃中贮存。

（2）方法和结果：用间接免疫荧光法检测，阳性结果可见细胞核呈黄绿色荧光。用酸洗脱鼠肝细胞标本作抗原与马疫锥虫、短膜虫法比较结果，和马疫锥虫法符合率达 93%，其中马疫锥虫法 4 例阳性，为系统性硬皮病，而此法为阴性，说明此法较马疫锥虫法更特异。此法与短膜虫法比较，符合率为 95%，P>0.05，说明二法无显著差别。其中此法阳性而短膜虫法阴性的 3 例，均符合系统性红斑狼疮诊断，并均有肾损害。短膜虫法阳性而此法阴性的 6 例均为待查病例，不能证实为系统红斑狼疮诊断，说明此法在特异性方面更佳。

三、抗核仁抗体的检测法用 HEP- 2 细胞或大鼠肝细胞作抗原，作间接免疫荧光染色。结果可见细胞核核仁呈现明亮的黄绿色荧光。抗核仁抗体在硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等中最多见。

四、抗组蛋白抗体的检测方法1．组蛋白的提取方法取大白鼠肝 40g 加入 160ml0.01mol/l Ph7.4 Tris HCl 缓冲液，制成匀浆后进行浓度梯度离心（27000rpm×60min），沉淀物中加入蒸馏水 90ml，再以超声粉碎仪将细胞打碎，离心（3000rpm×15min）取上清液，再加入一定量的 1mol/l 硫酸，使硫酸的最终浓度为 0.2mol/L, 混匀后，离心（3000rpm×15min），取上清液，加入 4～5 倍体积的无水乙醇，置于 -20℃冰箱 3 天后，离心（3000rpm×15min）以乙醚洗涤沉淀，真空干燥，储存于 -20℃冰箱中备用。

2．酸处理的鼠肾底物 鼠肾冰冻切片（厚度 4μm），以丙酮固定后吹干，密封，在 -20℃冰箱中储存备用。用前再于 0.1mol/ L 盐酸中浸泡 30min，然后再置于 0.01mol/l pH7.4PBS 中浸泡 2 次。

3．组蛋白重建的鼠肾底物在上述酸处理的鼠肾底物上加入 30μl 乙制备好的组蛋白，稀释浓度为 25μl/ml，在室温中湿盒内孵育 30min 后，以 0.01mol/l p7.4PBS 浸 2 次。

4．检测方法用组蛋白重建的鼠肾底物，做间接免疫荧光测定。

5．结果 1960 年 Kunkle 首先在 SLE 中发现抗组蛋白抗体（Antihistone antibody ,AHA），是诊断药物性 SLE 的一项较好的指标。在活动期 SLE 中 AHA 可达 90%。

五、抗着丝点抗体的检测方法1．HEP- 2 细胞涂片的制备 HEP- 2 细胞系人喉癌上皮细胞，在完全 Eagle 培养液中，37℃，二氧化碳孵育 48～72h，使细胞生长达到一定数量，约 1.2～1.5×106/ml，经胰酶消化后，可以传代或分装到置有玻片的培养皿中，继续用 Eagle 液培养及上述条件孵育，48h 细胞不仅贴附于玻片上并已长成单细胞层。取出玻片用丙酮固定 15min，自然干燥后待用，或保存于 -20℃或 4℃中。

表 15-3 各种抗核抗体及临床意义

抗体名别名临床意义抗 Sm 抗体SLE 标记抗体，阳性率 15～28%，常伴抗 RNP 抗体，有补体减少及肾受累抗 RNP 抗体抗 U1-snRNP 抗体抗 MO 抗体各种自身免疫病均可出现，单独高效价见于混合结缔组织病（MCTD）。抗 SS- B 抗体抗 La 抗体干燥综合征的标记抗体（27%）抗 Ha 抗体SLE 5%，同时抗 SS- A 阳性抗 SS- A 抗体抗 RO 抗体干燥综合征为 78% 阳性，SLE49% 系统性硬皮病 23%抗 Scl-70 抗体抗 Og 抗体系统性硬皮病的标记抗体 44%抗 Scl-86 抗体抗 Scl- 抗体阳性系统性硬皮病进行性。局部者阴性。抗 Ki 抗体SLE 特有 12% 阳性。抗 PCNA 抗体抗 Ne 抗体SLE 阳性 1%。抗 JO- 1 抗体多发性肌炎的标记抗本（24%），阳性者多有肺病变抗 KO- 1 抗体多发性肌炎 60%抗 PM- 1 抗体多见于系统性硬皮症（55%）抗 Ma 抗体分类不明的胶原病抗 MOS 抗体同上抗 RANA 抗体抗 SS- C 抗体类风湿性关节 炎 80%～90%抗 dsDNA 抗体SLE 所特有 60%抗 ssDNA 抗体见于各种胶原病注：Sm（Smith）；RNP：核糖核蛋白；Sn：为小核；SSB：干燥综合征 B；SS-A：干燥综合征 -A，Scl-70：硬皮病 70，抗原分子量 70000；PCNA：增殖细胞抗原；PM-1：多发性肌炎 -；RANA：类风湿性关节 核抗原；dsDNA：双链 DNA；ssDNA：单链 DNA。

2．染色方法用间接免疫荧光法。

3．结果着丝点抗原是紧附于染色体着丝点的 DNA 蛋白质，当与相应抗体结合后荧光图型为约 46 个圆的荧光亮点。国际上多用 HEP- 2 细胞，因这种细胞核大，分裂相旺盛，着丝点容易显露，这种抗体在进行性系统性硬化症（PSS）中阳性率可达 31%～98%，是 PSS 的 CREST 型的标记抗体，CRESF 是指具有软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张的 PSS 患者。

六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法Roitt 等（1956）和 Witebsby 等（1957）就发现桥本氏病人血清中有对甲状腺提取的抗体活性，后来 White（1957）首次用间接免疫荧光染色方法研究桥本氏病人血清存在对甲状腺胶质（thyroidcolloid）的抗体获得成功。此后，Landing 等（1958）和 Holbrow 等（1959）以不固定的甲状腺切片作抗原。检查出慢性甲状腺炎（Chronie thyroiditis）病人血清中有和细胞浆结合而呈现明亮染色的抗体。Blizzard 等（1960）,Doniach 等（1960）发现第二胶质抗体，血高 γ 球蛋白，沉淀素阴性，鞣酸细胞血凝试验阴性，抗甲状腺微粒体补体结合试验阴性。Balfoour 等（1961）用免疫荧光法研究一些甲状腺病人时总结指出：甲状腺胶质抗体有三种不同的荧光形态：一种是呈三维状云絮状，是一种血清沉淀素阳性产生的抗甲状腺球蛋白抗体。另一种是胶质部分荧光呈裂纹形，胶质无明显阳性荧光，而胶质边缘和裂纹处呈明亮荧光，鞣酸化细胞血凝反应阳性，沉淀素反应阴性。第三种即上述的胶质呈均匀荧光形状，证实这是一种称第二胶质的抗体。近 30 多年的研究证明免疫荧光方法检查甲状腺自身抗体是一个特异、敏感、简便的方法，对于临床诊断和治疗，随访和预后，甲状腺某些疾病的自身免疫性质的发病机理研究等，都有一定的实用价值。我们 20 年大量研究结果也证明确实如此。用免疫荧光法检查甲状腺自身抗体已成为许多国家中，诊断甲状腺疾病的常规检查项目之一。

检查这种抗体的免疫荧光方法要求取正常人的甲状腺或手术摘出的甲状腺组织，用冰冻节 片（3～6μm）用作甲状腺球蛋白抗体检查切片需要经 56℃纯甲醇固定 3min；用作甲状腺微粒体抗原切片无需固定处理，因固定会破坏微粒体的抗原性。按常规间接方法进行。

关于甲状腺抗体的研究已报告有甲状腺球蛋白抗体，微粒体抗体，第二胶质抗体，甲状腺刺激免疫球蛋白抗体，甲状腺激素 T 4及 T 3抗体，细胞表面的促甲状腺激素受体的抗体等。

表 15-4 不同甲状腺疾病甲状腺自身抗体的阳性率（%）

诊断甲状腺上皮微粒体抗体（%）甲状腺球蛋白抗体（%）甲状腺抗体总阳性率（%）LATS（%）桥本氏病897898-Graves’s 病37855380原发性甲低575275-正常对照576-七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测Johnson（1965）首次用免疫荧光组织化学间接法在狼疮样肝炎病人血清中发现了 SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham 用病人自身平滑肌作抗原，证实了 SMA 的自身免疫性。狼疮性肝炎或慢性活动性肝炎病人血清中 SMA 的阳性率可达 80% 以上。Donidht 和 Whitehouse 先后报告了急生病毒性肝炎病人血清中 SMA 为 IgM，而慢性活动性肝炎病人血清中 SMA 在发病初期（1～4 期）为 IgM，而后为 IgG。Anderson 利用纯化肌浆蛋白为抗原与肝炎病人血清中分离的 IgM 和 IgM 类 SMA 进行吸收试验，证明了 SMA 的特异性。Holborrow Gamel 和 Renbe 先后观察了 SMA 与鼠肝细胞，肾小球及人的甲状腺上皮细胞和血小板等组织为抗原的免疫荧光染色结果，证明这些组织的抗原性均与平滑肌肌动蛋白有着共同性抗原。

现在多以大白鼠胃壁和肾组织血管壁平滑肌的 4～6μm 冰冻切片和抗原，附贴在干净的盖玻片上，电扇吹干，放入 4 ℃干燥剂中保存，用前可固定于 95%（4℃）酒精中 1min，或不固定进行间接免疫荧光检测。

染色结果可见胃壁平滑肌，粘膜肌层和肌丝，小血管壁平滑肌等呈现出明亮的黄绿色荧光。有人用荧光检查急性期甲、乙二型肝炎暂时出现 SMA 的阳性率达 80%，稀释血清应在 1：10 以上的确定为阳性，一般认为，肝细胞表面存在肌动蛋白样物质。慢性活动肝炎患者滴度在 1：80 以上，急性肝炎患者 SMA 属 IgM 类，滴度 1：25 以上，慢性迁延性肝炎患者 SMA 也常阳性，滴度 1：25 左右。使用皮质激素者 SMA 转阴或滴度降低。健康输血员用原血清或 1：5 稀释，常有 9%～18% 的低滴度 SMA 阳性，似无诊断意义，SMA 与性别，年龄无关。

非肝病的 SMA 阳性者，主要见于传染性单核细胞增生症，类风湿性关节 炎，支原体感染疣，恶性肿瘤（如乳腺癌）。除传染性单核症滴度可达 1：320 外，一般常≤1:25，其血清与非肌性结构细胞不产生反应。

平滑肌抗体是抗肌球蛋白和肌纤维收缩蛋白的抗体，当肝细胞损害时，释放抗原引起的自身免疫反应。已证实慢性活动性肝炎病人血清中平滑肌抗体是具有特异性的血清学标志，但必须是高效价（1：80）以上，因在人群中常见低效价（1：10～1：20）。临床的研究指出，平滑肌抗体与生化指标改变程度相关，说明高效介平滑肌抗体与肝脏损害有关。Kurki 等研究 SMA 在慢性活动性肝炎等的意义。

Middelton 等报告检查了 70 例肾衰病人自身抗体，肾移植后 3 个月平滑肌抗体 IgM 类阳性率占 76%，而移植前 14%。SLE 常是 SMA 呈阴性结果，可作鉴别诊断参考。

八、肝细胞膜抗体（Antibodyto the hepatocyte membrane, HMA）的检测Lee 等用 Rouin 氏液固定的大白鼠肝切片作抗原，作间接免疫荧光（IIF）检查，在慢性活动性肝炎（CAH）病人血清中成功的发现了 HMA，肝细胞膜呈现黄绿色荧光，12 例 CAH 中 11 例 HMA 阳性（93%）10 例原发性胆汁性肝硬化（PBC）全部阳性，20 例胶元 - 血管疾病 1 例阳性（5%）7 例非免疫肝病中 1 例阳性（14%），正常人 22 例中仅 1 例阳性（5%）。

Bouin 氏液固定大白鼠肝冰冻切片和 IIF 检查 HMA 的方法很简便，特异，对于诊断 CAH 和 PBC，研究病因是很有价值的。

免疫荧光方法：取 Wistar 大白鼠复合组织（胃窦、肾皮质和髓质和肝）用恒冷箱冷冻切片机作冰冻切片，4μm 厚，贴于玻片上，在空气中干燥至少 30min。在室温中用 Bouin 氏液（75ml 饱和苦味酸溶液，24ml 甲醛，19ml 冰醋酸）固定 10min。切片在 pH7.40.01mol/LPBS 中洗 3 次，15min，同时搅拌，切片在空气中干燥后立即应用，或存放在 -20℃备用。作间接免疫荧光染色。

表 15-5 平滑肌抗体在不同疾病中的百分率

临床诊断例数%SLE619.8急性肝炎15026.9慢性迁延性肝炎1464.28慢性活动性肝炎5080.2肝硬化3234.3肝黄萎缩4(全部阳性)慢性肝炎15454.2HBsAg 阳性携带者1241.7甲状腺机能亢进11418.4慢性萎缩性胃炎3713.5慢性气管炎38215.7类风湿性关节 炎1211.1皮肌炎1136.4肝癌911.1肾小球肾炎1822.0心肌炎10718.7冠心病24710.1糖尿病3727.1甲状腺炎（桥本氏）837.5正常对照2369.7九、线粒体抗体（Mitochondrial antibody, AMA）用人肾（新鲜手术或尸检 6h 以内）采用肾皮质或大白鼠肾脏冰冻切片不需任何固定，作检查 AMA 抗体的抗原底物，间接免疫荧光结果可见远端肾小管上皮细胞浆呈现均匀的荧光。Walker 等（1965）首先用此法在原发性胆汁性肝硬化，隐原性肝硬化和慢性活动性肝炎中发现 AMA，以原发性胆汁性肝硬化（158 例 /188 例）阳性率最高（84%），由于阻塞性肝胆疾病不产生这种抗体，可作鉴别诊断的指标。

这种抗体可以是 IgG，IgM 及 IgA，无组织和器官特异性。

Klarskin 等（1972），Walker 等（1970，1972），对于这种抗体的临床应用进一步作了证实。AMA 对疾病的发生的作用尚不明确，有人认为不起作用，有人则认为是造成肝细胞胆小管细胞进行性破坏的自身免疫过程的一个标志。而这两种细胞受累的程度将决定性地导致原发性胆汁性肝硬化。慢性活动性肝炎和隐原性肝硬化 33 例中阳性率为 60%，233 例门脉性肝硬化和 332 例病毒性肝炎中未查出 AMA。Vandell 等对 106 例 B 型萎缩性胃炎患者检查 AMA 全部阴性。我们很少见到 AMA 阳性的原发性胆汁性肝硬化病例。

表 15-6 AMA 亚类及其临床意义

AMA 亚类临床意义抗 M 1梅毒抗 M 2PBC（原发性肝硬化）混合型 CAH（慢性活动性肝炎）-PBC抗 M 3假性红斑狼疮综合征抗 M 4混合 CAH-PBC抗 M 5原发性非肝性自身免疫性疾病抗 M 6异烟酰异丙肼所致肝炎由表 15- 6 可以看出，AMA 不同亚类所对应的抗原存在的差异，其病理意义也各不相同。原发性胆汁性肝硬化患者血清中主要检出抗 M 2型 AMA，抗原位于线粒体内膜。

十、胃壁细胞抗体（Gastricparietal cell antibodies, PCA）的检测Taylor 等（1962）和 Iruine 等（1962）同一年发现 PCA，以恶性贫血病人血清中阳性率最高（90%～100%）。慢性萎缩性胃炎国外报告阳性率 20%～60%，伴有恶性贫血者可达 90%。其次，甲状腺疾病，糖尿病、肾上腺皮质机能减退及缺铁性贫血等疾病，常伴有 PCA 阳性。我国恶性贫血发病率低，PCA 阳性率在 15%～25% 之间，正常人 2%～5%，60 岁以上可高些（16%）。Strickland 等（1973）称 PCA 阳性萎缩性胃炎为 A 型胃炎，胃窦炎的发病率低，大部分为胃体广泛性萎缩病变，发展后果为恶性贫血。B 型患者 PCA 阴性，胃窦炎的发病率高，胃体部仅有局限性萎缩病变。各种疾病 PCA 检出阳性率见表 15-7。

表 15-7 各种疾病 PCA 检出阳性率

疾病阳性率（%）恶性贫血90～100慢性萎缩性胃炎 A 型90缺铁性贫血36甲状腺功能亢进24甲状腺功能低下55糖尿病18肝炎37Odger 等（1968）发现恶性贫血病人胃粘膜内含 IgA 细胞减少到正常的 10%，IgM 细胞减至 50%，而 IgG 细胞则增加至 15%，后者选择性的出现在残余的壁细胞周围。Baur 等（1968）用人胃粘膜匀浆中微粒体部分标记荧光素和 9 例恶性贫血病人胃粘膜切片反应，其中 7 例 PCA 阳性者的胃粘膜因有层见特异性吸附荧光的浆细胞，证实 PCA 是炎性浸润的浆细胞所产生。

十一、胃泌素细胞抗体（GastrinCell antibodies, GCA）的检测慢性表浅性胃炎病人有 33% 血清中 GCA 阳性，慢性萎缩性胃炎病人也有 32% 阳性。提示慢性表浅性胃炎与慢性萎缩性胃炎可能是相同本质的病变，可能有着共同的自身免疫反应的背景和发病基础。

GCA 的检查方法，杀死雄性小白鼠后立即取胃窦组织，固定于 4%MFF 液中 3 天（MFF 液的配法：在 60℃的蒸馏水 25ml 中加入 4g 多聚甲醛，加 4 滴 1N NaOH，再用 NaOH 或 Na2HPO4调 ph 至 7.4 后，再加入 0.1mol/lPB Ph7.4 25ml）。组织脱水后，用 56℃石蜡包埋，切片 3～5μm。56℃烤干，脱蜡至水洗，取病人血清滴加在切片上，37℃45min，用常规间接免疫荧光法染色。荧光显微镜观察，可见 G 细胞浆呈黄绿色荧光，即是 GCA 阳性。

十二、胰岛细胞抗体（Isletcell antibady, ICAb）的检测Bottazzzo（1974）用人胰腺，近年有人用兔胰腺的冰冻或石蜡切片抗原，间接免疫荧光法检测糖尿病人血清中有 ICAb，发现约在 60%～70% 的新诊断的胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）病人不论年龄大小，其 ICAb 均呈阳性。ICAb 对胰岛四种细胞均起反应，一般是暂时性的。只有约 20% 或更少的 ICAb 阳性者可持续 2～5 年。而单纯饮食控制的非胰岛素依赖型糖尿病阳性率很低，和对照组相似（约 0.05%）。在 IDDM 病人中，有 85% 的糖尿病人于症状发作后，立即出现 ICAb，并随病程的持续而减少。Leudrum 等（1976）报告用间接免疫荧光细胞化学发现 ICAb 在依赖胰岛素的糖尿病人中阳性率为 38%（319/829）。而非依赖胰岛素的糖尿病人中阳性率只有 1.7%（3/177）是 ICAb 阳性。

ICAb 是针对胰岛细胞细胞质成份的抗体，或许是在症状发生之前，紧接着细胞损害而出现的。提示 IDDM 的发病可能具有自身免疫反应的免疫病理机理。

十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测免疫病理证明基底膜抗体是引起肺出血肾综合征即 Goodpasturesymdrome 的主要病因。需要取病人的痛和肺穿刺活检组织，作冰冻切片，用直接免疫荧光细胞化学方法检测 Igg，IgM 和 C 3等在基底膜上沉着的情况。在肾小球和肺组织基底膜上呈线形荧光分布。在人急性肾小球肾炎中可见呈线形荧光，而膜性肾小球肾炎中，抗原抗体复合物沿肾小球基底膜呈结节 状沉积，藉以诊断和鉴别诊断。

1．抗原切片取病人肾穿刺或肺穿刺组织，作冰冻切片，厚 4～6μm，不固定。肾切片应先在显微镜下选取有肾小球的用作免疫荧光染色。

2．直接法免疫荧光细胞化学染色方法分别用抗人 IgG、IgA、IgM 和补体 C 3荧光抗体染色。同时作对照试验。

3．荧光显微镜检查肺出血肾综合征病人的肺泡基底膜，肾小球基底膜上都呈现明亮的线形荧光。主要是 IgG 类抗体，补体 C 3荧光也呈线形，沿基底膜线形弥散分布。

十四、抗皮肤成分自身抗体的检测抗皮肤成分的自身抗体在疱疹性皮肤病中具有诊断和鉴别诊断意义，寻常性天疱疮具有鳞状上皮细胞间隙抗体，类天疱疮具有基底膜带抗体。这种自身抗体无种属特异性。用直接免疫荧光法检测皮肤活检组织，间接法可用以检测病人血清中的抗皮肤成分抗体。

1．抗原切片直接法免疫荧光细胞化学检查，可以取病人皮肤活检组织作冰冻切片。

间接法检查常用大白鼠，豚鼠的食道上 1 / 3 部分作冰冻切片。也有人曾用猴、人、小白鼠和兔的食道上皮组织，人的正常皮肤，大白鼠、猴、豚鼠和兔唇和舌等作冰冻切片。认为人正常皮肤，小白鼠食道和大白鼠舌，可作为常用抗原，材料来源方便，经济，易推广应用。

2．免疫荧光细胞化学染色方法

（1）直接法：取病人皮肤活检组织一部分作常规石蜡切片，HE 染色，作常规病理组织学诊断，一部分作冰冻切片的直接法免疫荧光染色。荧光抗体用抗人 IgG、IgA、IgM 和补体 C 3分别染切片。同时作对照试验。

（2）间接法：用病人血清与食道等抗原切片反应后，分别用抗人 IgG、IgA、IgM 荧光抗体染色阳性结果，可以进一步作滴度检测。同时作对照试验。

3．荧光显微镜检查直接法检测结果可见疱疹性皮肤病中各有一定的荧光形态，可见免疫球蛋白的沉积。

刘荣卿等（1987）用直接免疫荧光组织化学方法，对临床拟诊为天疱疮或大疱性类天疱疮病例进行检查，活检取病变附“正常”皮肤标本，用羊抗人 IgG、IgM、IgA 及 C 3荧光抗体染色，结果可见天疱疮 9 例中，取自“正常”组织标本均见表皮细胞间有 IgG 沉积，1 例并有 IgM、IgA，2 例有 C 3，7 例毛囊上皮和（或）汗腺上皮细胞间有 IgG、IgM、IgA、C3沉积。用间接免疫荧光检测 8 例均阳性，大疱性类天疱疮 8 例中，取自“正常”皮肤标本均阳性，主要为基底膜出现 IgG（7 例），C3（8 例），1 例为 IgM，1 例伴有 IgA。天疱疮及大疱性类天疱疮均为自身免疫性疾病，皮肤及血液中分别存在抗表皮细胞表面抗体、天疱疮抗体及抗基底膜抗体 - 类天疱疮抗体，这些自身抗体结合在皮肤、粘膜的相应部位。

不同疱疮性皮肤病的间接荧光图形如表 15-8

表 15-8 皮肤抗体阳性荧光分布

上皮区上皮基底膜表皮核寻常天疱疮+--类天疱疮-+-疱疮性皮炎---多形性大疱性皮炎---红斑性天疱疮+-+（Clinical Immunology P146, 1971）

十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测在诊断 Sjogren’s 综合征时检测唾液腺外分泌导管上皮细胞抗体具有重要意义，阳性率达 65%，用人或猴唾液腺组织（O 型）不固定的冰冻切片，间接免疫荧光细胞化学法检测，可见导管上皮细胞浆呈黄绿色荧光。

十六、抗横纹肌自身抗体的检测抗横纹肌自身抗体出现在 50% 以上的肌无力症和胸腺瘤病人，正常人未发现。属 IgG 类抗体，用间接免疫荧光法检测此抗体，准确简便。

1．抗原切片取人或大白鼠骨骼肌，沿肌纤维平行方向作冰冻切片，不固定。

2．间接法免疫荧光染色方法染色的方法步骤与其他自身抗体间接法相同，但在荧光抗体染色之后，要延长 PBS 洗涤时间，3 次 PBS 洗涤，每次 30min。封裱切片。

3．荧光显微镜检查可见横纹肌 A - 带呈阳性荧光，无例外的都是胸腺肿瘤病人。单纯肌无力病人主要与 I 带和 H 带呈现阳性荧光有关。某些肌无力病人血清只含与“白纤维反应抗体，另一些只含有与”红纤维反应的抗体，呈斑点状荧光。横纹肌抗体和胸腺髓细胞、心肌呈一定程度的交叉反应。当血清稀释至 1：60 时，可获得更清晰的横纹荧光图像。

十七、肾上腺自身抗体的检测抗肾上腺自身抗体是对肾上腺皮质细胞浆成分的一种器官特异性抗体。主要见于慢性肾上腺皮质功能减退症（阿狄森氏病）病人。用间接免疫荧光法检测，阳性率约 50%，其他自身免疫病阳性率 2%～5%。

1．抗原切片抗原用新鲜肾上腺尸检或手术切除标本，常用皮质醇增多症（柯兴氏病）病人手术切除的肾上腺。或取猴肾上腺组织，作冰冻切片。不需固定。

2．间接免疫荧光检查方法

3．荧光显微镜检查可见特异性荧光在皮髓质连接区最清晰，定位于皮质网状带细胞胞浆，髓质细胞不与抗体反应。

十八、类风湿因子（Rheumatoidfactor）的检测类风湿因子是一种抗轻度变性的 IgG 的自身抗体，可与人或动物的热聚合 IgG 或抗原结合的 IgG（即免疫复合物中的 IgG）反应，而不与正常 IgG 反应。类风湿因子为 IgM 类抗体。主要见于类风湿性关节 炎产现人血清和组织中。

1．直接法

（1）用病人关节 滑膜或淋巴结，冰冻切片，冷丙酮固定 10min。

（2）标记变性 IgG 或球蛋白：取人血清提取的 γ 球蛋白（20～25mg/ml），按常规法标记 FITC，去游离荧光素后，将标记溶液置 63℃水浴加热 10min，使 γ 球蛋白热变性。加入 40%2.17mol/ L 硫酸钠使热聚合体沉淀，置冰箱 4h（4℃），然后在低温下离心 30min（10000rpm）。取沉淀以预冷至 4℃的蒸馏水溶解至原体积半量。用蒸馏水透析 24h（4～6℃），再用 pH7.6 生理盐水透析 24h。高速离心（12000rpm）30min 除去不溶性聚合物，取上清分装，-20℃保存备用。

（3）直接免疫荧光染色：切片分别用以下染色试剂处理

①加标记变性 γ 球蛋白溶解。

②加标记抗 IgM 或 γ 球蛋白荧光抗体。

③加未标记变性 γ 球蛋白，作用切片后，洗涤，再加标记变性 γ 球蛋白。

①，②在适当稀释的试剂染色后呈特异性荧光，大多数活动性类风湿性关节 炎，可见阳性荧光的浆细胞堆集。③阴性或荧光显著减弱。

2．间接法 用以检出病人血清中的类风湿因子。

抗原：用溶血素致敏的绵羊血细胞涂片。丙酮固定 10min。

常规间接法染色。病人血清中有类风湿因子，与绵羊红细胞上的溶血素（变性 IgG）结合，再加入 γ 球蛋白荧光抗体，与类风湿因子结合。因而红细胞呈现亮明的荧光，即证明类风湿因子阳性。

十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体（Anti-eutrophilcytoplasmic autoantibody ANCA）Davies 等（1982）首次报告在坏死性肾小球肾炎患者血清中发现 ANCA。Hall 等（1984）在 4 例系统性血管炎中也发现 ANCA，其中 3 例表现为坏死性肾小球肾炎。Vander woude 等（1985）报告血清中 ANCA 的滴度与诊断活动性 Wegener 氏肉芽肿的病情有密切关系，随着病情缓解，ANCA 的滴度逐渐降低，所以认为是诊断 Wegener 氏肉芽肿很敏感的指标。随后一些研究表明检查 ANCA 对诊断结节 性多动脉炎和特发性新月体肾炎均有较高的敏感性。1989 年和 1990 年分别召开了第一和第二届国际 ANCA 专题研讨会，引起了国际上的广泛重视。

ANCA 抗原存在于中性白细胞的胞浆颗粒中，分子量为 29kD，已证实是一种丝氨酸蛋白酶，与存在于中性白细胞嗜天青色颗粒中的丝氨酸蛋白酶 - 蛋白酶 3（PR3）十分相似。所以，胞浆型 ANCA（C-ANCA）能与 PR3发生特异性反应。另一型称核周型 ANCA（P-ANCA）的主要抗原成分是髓过氧化物酶（MPO），在坏死性肾小球肾炎和系统性血管炎患者，约 90% 的 P -ANCA 能与 MPO 发生特异性反应。由于有时 P -ANCA 同时伴有细胞核荧光，为排除假阳性，必须证明是 MPO-ANCA。ANCA 可以为 IgG、IgM、或 IgA 类抗体，在不同疾病时三者的出现机率不同。

间接免疫荧光检查 ANCA：用肝素抗凝血分离中性白细胞，以 0.01mol/l Ph7.4 PBS 洗细胞 3 次，制涂片，吹干。无水酒精固定 5min。加待测血清，37℃孵育 40min，PBS 冲洗。加 1：10 稀释的抗人 IgG-FITC 荧光抗体，37℃孵育 30min，PBS 洗 3 次，每次 3min，磷酸缓冲淮甘油封片。荧光显微镜观察。

ANCA 的荧光可表现为 C -ANCA 和 P -ANCA 二种类型：C-ANCA 荧光在胞浆中，分叶核之间有强的弥散性荧光、核无荧光。P-ANCA 的荧光集中核周围，形成环状或不规则块状。

ANCA 的致病机理：ANCA 能使中性白细胞活化，发生呼吸爆炸，释放胞浆中的多种水解酶，氧自由基等活性物质而导致组织损伤。由于 PR3和 MPO 都带正电荷，它们能与肾小球基底膜结合，PR3-ANCA 和 MPO-ANCA 与之发生免疫反应导致肾小球基底膜损伤，另外，沉积在基底膜上的 PR3和 MPO 还能通过介导细胞免疫，参予肾组织损伤。

二十、增殖细胞核抗原抗体（Proliferativecell nuclear antigen antibody, PCNA）培养细胞经促细胞分裂剂刺激，核内 DNA 开始合成 G 期，到最大增殖期（S 期），细胞核特异的出现 DNA 的复制，利用这一特点，制成抗原 DNA 聚合酶 S 的辅助蛋白。取培养细胞或人末稍血淋巴细胞经 PHA，ConA 刺激后涂片，间接免疫荧光检测。结果可 PHA 刺激后 48hDNA 合成开始的 S 期出现很强的斑点型荧光，（G）期细胞无反应。

在 SLE 病人血清中出现有特异性诊断价值，出现率为 3%～5%。

二十一、抗类风湿关节 炎相关核抗原的抗体（Antirheu-matoidarthritis associated nuclear antigen antibody, RANA）又称 SSC 抗体，RAP，可有免疫荧光间接法检测，用人二倍体 B 细胞（Wil-2）或 Raji 细胞为抗原片，细胞滴片吹干，37℃干燥固定，因丙酮，乙醇等可使 RANA 失活。荧光阳性呈核内斑点型。对诊断类内湿关节 炎和伴有口眼干燥综合征的病人有参考意义。近年发现其他结缔组织病和正常人出率也很高，其特异性尚待进行深入研究。

二十二、抗精子抗体（Anti-spermantibody, ASA）在正常情况下由血睾屏障将精子抗原与免疫系统隔离，当此屏障发生破坏，精子抗原通过副睾间隙组织的淋巴管或毛细血管而进入免疫系统，就会引起自身免疫反应，产生自身抗体。抗精子抗体也可在一些女性体内产生。男性不孕症患者血中可检出很高阳性率的 ASA。女性不孕症也可因 ASA 引起精子运动障碍，导致不孕。

抗精子抗体的作用是：①ASA 可使精子运动障碍不能通过子宫颈管；②精子顶体酶活性被 ASA 抑制，使精子不易穿透包绕卵细胞的卵丘，放射冠和透明带；③抑制了精子与卵细胞膜的融合；④导致胚胎死亡和流产。⑤ASA 的作用可使精子发生凝集，制动和结合三类。凝集抗体有精子头对头，尾对尾及混合型三种。

荧光抗体法和固相酶染色法常用于检测抗精子抗体。

固相酶免疫细胞化学方法：液化新鲜精液离心弃上清，沉积的精子用 PBS 洗 3 次，加 0.5ml 小牛血清混匀，校正精子浓度为 5×107ml，涂于载玻片上，室温自然干燥，甲醇固定 10min，PBS 洗 2 次，吹干，加被检血清，37℃湿盒，30min，PBS 洗 3 次，每次 3min，加酶标记抗人 IgG 抗体，免疫荧光法则加抗人荧光抗体，37。 C 湿盒 30min，PBS 洗 3 次，每次 3min（或荧光显微镜检查），用 DAB-H2O2显色（同前述免疫酶细胞化学方法）。常规脱水、透明树胶封固。油镜观察结果。阳性反应精子呈棕黄色，阴性兰色（用伊文思蓝复染）。阳性可见在精子顶体、中体，后核帽、中片、尾及尾尖等。

二十三、其他自身抗体的检测目前已发挥许多自身抗体，如抗胆小管抗体，见于原发性胆汁性肝硬化病人，阳性率达 75%。用大白鼠肝的胆小管作抗原，间接免疫荧光染色阳性荧光定位于胆小管上皮细胞，呈均匀荧光。抗生殖细胞的自身抗体除精子外还有卵巢细胞抗体，常见不孕症患者。

心肌抗体常见于心脏手术后综合症和心脏移植的受体。

结肠粘膜抗体可见于溃疡性结肠炎患者的血清中，还有抗网织纤维抗体等。

近年对垂体细胞自身抗体研究发现，在多内分泌自身免疫疾病中存在抗促乳素细胞抗体，生长激素细胞抗体，ACTH 细胞抗体等。

在神经系统中抗神经髓鞘成分的自身抗体，常见于神经脱鞘性疾病。

在一些眼科疾病中存在的自身抗体如抗晶体成分抗体，抗眼肌抗体等。

用大白鼠组织作抗原检查自身抗体，在心肌间质，肝枯否氏细胞，平滑肌和横纹肌模，胃及肾、肝的间质，肾小管近曲管刷状缘等出现阳性荧光，这是所谓异嗜性抗体（Heterophile anti-body），它和自身抗体易发生混淆，必须注意区分。

免疫细胞化学技术在自身免疫性疾病诊断中以免疫荧光技术应用最广泛，但应用免疫酶技术和免疫金 - 银技术也可以取得良好结果，作用用葡萄菌 A 蛋白的辣根过氧化物酶标记物代替荧光抗体作自身抗体检测，所得到的结果可用光学显微镜检查，适于在没有荧光显微镜的实验室应用。

第三节 自身抗体产生的机理关于自身抗体产生的机理众说纷纭，十分复杂，免疫细胞化学和其他方法的结合，有助于从形态、功能和代谢三个方面深入探讨。根据目前研究的情况，有以下几种学说。

一、自身淋巴细胞免疫调控反应紊乱学说Opelz 等将 T 细胞与先经放射线照射的自身非 T 细胞共同培养时，发现了 T 细胞的增殖反应（3H-TdR 渗入增加）。这是 T 细胞识别非 T 细胞单核 - 巨噬细胞、B 细胞、Null 细胞上的自身 HLA-DR 分子而发生的反应，即在无非已抗原的参加下，只通过识别自身万分就可诱导产生 T H、TK功能。其反应过程中，首先 OKT4+的 T H与单核 - 巨噬细胞上的 DR 分子相互反应，一方面导致 T H活化，细胞膜上出现白细胞介素 -1（IL-1）受体，另一方面也导致单核 - 巨噬细胞释放 IL-2，IL-2，再刺激某一 OKT4+TH亚群产生辅助 B 细胞的 B 细胞生长因子（BCGF）和 B 细胞分化因子（BCDF），同时也刺激已活化的 OKT4+细胞分化，增殖抑制或杀伤功能，对 B 细胞和 T H细胞实施抑制。自身淋巴细胞间的免疫调控反应，对于维持免疫系统的自身稳定十分重要。当机体的某种自身成分受到化学或生物因素的修饰成为自身抗原时，在正常的这种调控反应下，将自身抗原成分清除。若此控调反应发生紊乱，IL- 2 生成受阻，自身抗原成分不能被清除和形成长期的刺激 T H及 B 细胞失控，导致产生大量的自身抗体，引起机体发生自身免疫反应和发生疾病。因此，在自身免疫性疾病的病变和血清中可查出自身抗体。

二、T 细胞旁路（t cell by – pass）学说免疫系统对自身抗原产生免疫耐受的机制，与抗原决定簇结合的载体分子的特异性有密切关系。各种多糖、脂类、核酸、蛋白质等形成的自身抗原，以各自的抗原决定簇与不同的载体即自身各种组织成分结合后，以不同的方式达到了自身免疫耐受。一旦这种自身免疫耐受机制破坏，即可导致自身免疫反应，产生自身抗体。T 细胞旁路学说认为，高浓度的自身抗体可使 T 4和 B 细胞免疫耐受，低浓度的自身抗原只使 T H产生耐受。后者 B 细胞虽未致耐受，但因缺乏 T H的辅助作用，也不能接受自身抗原的刺激而产生自身抗体。当自身抗原被修饰后而产生新的抗原决定簇，或与药物等半抗原结合获得新的抗原决定簇，或当病原体感染，外来抗原如同时载有外来的和自身的或模拟自身的抗原表位（epitopes）时，TH的耐受状态可以解除，恢复对 B 细胞的辅助作用，B 细胞活化而产生自身抗体。

三、独特型 - 抗独特型网络缺陷学说独特型（idiotype）是存在于抗体或淋巴细胞受体上的独特型抗原决定簇，即同一个体内不同的抗体形成细胞所产生的免疫球蛋白具有各自不同的抗原特异性。此种抗原特异性受各自细胞内的基因控制，故又称个体基因型。独特型存在于抗体分子的 Fab 段。

独特型的抗体即称抗独特型。独特型与其抗独特型网络的免疫调节 学说认为，当抗原刺激免疫系统时，随即出现有个体型决定簇的 T H和 T S细胞，它们调控 B 细胞产生特异性抗体（Ab1）,Ab1分子上的个体型决定簇对机体又是一种新抗原，就可以诱导出抗独特型抗体（Ab2）及带有 Ab2个体型的 T H和 T S细胞；Ab2能抑制 Ab2的生成，并能诱导出产生 Ab3和带有 Ab3个体型的 T H、Ts细胞。Ab3能抑制 Ab2生成并解除 Ab2对 Ab1生成的抑制。从而形成独特型 - 抗独特型网络。

Zanetti 提出有关独特型 - 抗独特型网络参与自身抗体产生的可能途径：①独特型抗体直接活化载有互补独特型的自身反应性 B 细胞克隆。②独特型抗体具有自身抗原相关表型的影像功能（影像效应）。③独特型抗体具有双功能分子的作用，即带有可刺激载有互补独特型的克隆，也带有起影像效应的独特型，可活化有自身抗原受体的克隆。④抗无关外源性抗原（细菌、病毒、药物等）的抗体（Ab1b）可能与抗特定自身抗原的抗体（Ab1a）偶然地有共同的独特型，因而抗 Ab1b的独特型抗体（Ab2b）可特异性刺激载有互补交叉反应性独特型受体的 B 细胞，引起自身抗体的产生。

四、遗传因素自身抗体的产生和遗传因素关系密切。Bell 等的研究发现，全身性红斑狼疮患者抗 SS- A 抗体阳性患者，HLA-B8抗原出现率为 81%，HLA-DR3出现率为 100%。显着高于抗 Ro 与抗 nRNP 阴性或 nRNP 阳性的患者。

自身抗体的产生机理是十分复杂的问题，尚待深入探讨，使各种学说综合统一还要进行大量的实验研究，明确自身抗体在发病机理中的作用，对诊断和治疗自身免疫性疾病有重要意义。

参考文献1．王伯沄. 自身抗体的免疫荧光检查法. 汪美生主编”免疫学基础”. 陕西科学技术出版社,1981;290～294

2.WangBaoyun (王伯沄)&Hu Shaowen (胡绍文).Prelimary study of certain autoantibodiesin thyroid diseases. Chinese Med J.1990; 93:717

3. 王伯沄. 正常人和病人血清中某些自身抗体的发生率. 第四军医大学学报,1981; 1:30

4. 王伯沄. 国人疾病和正常人抗核抗体 (ANA) 的阳性率-3884 人次 ANA 检查结果. 第四军医大学学报,1981;2:135

5.WangBaoyun(王伯沄).Incidences of certainautoantibodies in sera of human normals and patients (By immunofluorescenttechnique).Printed by Miles Laboratories Inc in USA. 1982; P506～519

6. 王伯沄.A 蛋白在免疫细胞化学中的应用—检查病人血清自身抗体 IgG(ANa , PCA)免疫细胞化学方法. 第四军医大学学报,1982;1:42

7. 王伯沄. 自身抗体的免疫荧光检查方法及其在研究和临床诊断中的应用. 中国免疫学杂志,1985; 1:60

8. 潘伯荣. 抗核抗体的研究及其临床应用. 医学文摘,1986;3:1

9. 唐福林, 等. 抗 Sm 抗体的测定及对系统性红斑狼疮 (SLE) 的诊断价值. 中华内科杂志,1983;22:488

10.sharpGC. Anti- RNP & anti –Sm antibodies .Arthritis Rheum. 1982; 25:757

11. 唐福林, 等.ENA 的提取及 RNP 抗体:Sm 抗体的测定. 中华医学检验杂志,1983; 6:169

12.Gaudreau A, et al. Clinical significance of antibodies to solubleextractractable nuclear antigen (AntiENA).Ann Rheu Dis, 1987; 37:321

13. 王伯沄. 自身抗体的免疫荧光检查法和临床应用. 陕西医学检查,1987;291:63

14.WickyG. et al. clinical significance of Immunofluorescence Technoklogy: selectedAmsterdamIP151～155,248～251.1982

15. 刘彦仿, 等. 免疫荧光法检查自身抗体中非特异性抗体. 第四军医大学学报,1982;2:104

16. 蒋明, 等. 系统性红斑狼疮血清抗组蛋白抗体测定的初步观察. 北京医学,1986;8:87

17. 胡大文, 等. 短膜虫 (Crithidia luciliae) 免疫荧光法对血清抗体双链 DNA 抗体的测定及临床应用. 中华内科杂志,1983;2:336

18. 戴玉琳, 等. 丙酮盐酸处理肝切片间接免疫荧光法检测双链 DNA 抗体. 中华医学杂志,1984;64:203

19. 刘荣卿, 等. 天疱疮及大疱性类天疱疮外观正常皮肤的免疫荧光检查. 中华皮肤科杂志,1987;20:138～140

20.Macisaac AI, et al. Antie neutrophil cytopklasm antibody (ANCA)associatedvasculitis. Clin Nephrol,1990; 34:5

21. 刘志红 黎磊石. 抗中性白细胞胞浆抗体相关性肾脏病 - 肾脏病的一处新概念. 中华肾脏病杂志.1992,8(3):180～182

22. 潘根娣, 等. 间接免疫荧光试验检测肝细胞膜抗体. 临床检验杂志,1986;4(2):80

23. 王慧珍. 自身抗体免疫荧光图形手册. 香港: 香港桑亚出版社,1992

第十六章 病原体的免疫细胞化学快速检查方法和应用用免疫细胞化学方法可以检测任何一种细菌和病毒，其突出的优点是快速、敏感、简便，又能同时进行形态学鉴定。此外，它还可更广泛地使用已知抗原间接法检查血清中抗体帮助诊断。更多地应用单克隆抗体进一步提高特异性和应用的广泛性。

第一节 在细菌学中的应用免疫细胞化学在细菌学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。细胞都各自有其特异性抗原，应用特异性抗体的荧光素或酶标记物，可以鉴定任何一种细菌。已经成功地用于鉴定几乎所有致病菌的纯培养。尤其是应用免疫荧光技术具有较其他血清学方法简便、快速和敏感等优点，并能直接进行细菌形态观察。可用于鉴定的材料也比较多样，如培养物、感染组织、病人分泌排泄物，外环境中采集材料（土壤、水、杂物等）。由于此法对某些传染病原能较常规方法作出更快速的诊断，因而具有特殊意义。

免疫细胞化学方法用于研究细菌抗原结构和形态学观察，由于单克隆抗体的应用，比其他方法更为有效。

图 16-1 免疫荧光在病原细菌诊断程序中的应用时机

从患者咽部粘膜用棉拭子取标本，作涂片用甲组溶血性链球菌荧光抗体染色，能够很快作出诊断。对于痢疾杆菌、霍乱孤菌、布氏杆菌、炭疽杆菌和脑膜炎双球菌、肺炎双球菌等的实验诊断均有较好的效果（如表 16-1）。

利用间接免疫荧光或酶标记抗体法，检测患者血清中的抗体更有价值，广泛用于临床诊断和流行病学研究。

表 16-1 免疫荧光细胞化学方法在细菌诊断中的应用评价

菌种疾病标本方法敏感性特异性意义甲组链球菌急性咽峡炎猩红热咽部培养物DIF高高诊断急性风湿热乙组链球菌新生儿败血症阴道拭子DIF高中快速脑膜炎临床标本鉴定牛型乳腺炎培养物致病性大肠杆菌婴儿腹泻大便DIF高中过筛杆菌伤寒沙门氏菌肠伤寒大便DIF高高诊断沙门氏菌肠炎大便DIF高高诊断（大多数血清型）肠热脑膜炎食品过筛环境标本培养物志贺氏菌属宋内氏菌菌痢大便DIF高高快诊福氏菌菌痢大便DIF高高快诊百日咳杆菌百日咳鼻咽涂片DIF高高快诊流感嗜血杆菌细菌性脑膜炎脑脊髓DIF高高快诊肺炎球菌细菌性脑膜炎脑脊髓DIF高高快诊脑膜炎球菌细菌性脑膜炎脑脊髓DIF高高快诊出血点（差）军团菌病小叶肺炎痰，肺渗出物DIF高高诊断肺组织切片IIF快诊李氏菌李氏单核细胞体液涂片DIF高高诊断增多症组织切片布氏杆菌布氏症胎盘DIF高高诊断（牛、羊、猪型）（人、畜）病理组织培养物DIF高高诊断结核杆菌结核病痰及其消化液DIF高高诊断胎儿孤菌孤菌病子宫阴道粘液DIF高中诊断类丹毒菌动物感染血液、组织、培养物DIF较高高诊断放线菌放线菌病扁桃腺病理排泄物DIF高高诊断钩端螺旋体钩体病尿沉渣，新鲜组织刮片或切片培养物DIF中高诊断奈瑟氏淋球菌淋病结膜、皮肤破损，关节 液DIF较高中过筛绿脓杆菌肺炎病理组织DIF较高中诊断类鼻疽杆菌类鼻疽排泄物DIF高高诊断病理组织DIF中高诊断马疽杆菌鼻疽排泄物DIF高高早诊病理组织脆弱类杆菌败血症血及其他有关临床标本DIF高较高诊断黑色素源标菌牙周病物病变部位分泌物DIF高高辅诊脏器脓肿梭状芽胞杆肉毒中毒食物DIF菌属动物黑腿病变部组织羊炭疽大便等DIF高较高辅诊或诊断气性坏疽破伤风结肠炎等沙眼衣原体沙眼结膜刮片DIF高高诊断（引自，黄策：免疫荧光和荧光免疫。1983）

一、甲组溶血性链球菌的快速检查法（一）试剂制备

用抗甲组溶血性链球菌的抗体，以 FITC 标记，制成荧光抗体，再用 C 和 G 链球菌充分吸收；或用抗 I 型链球菌 M 蛋白成分的血清，标记后吸收，都有可靠的特异性。

（二）检查方法

（1）以棉拭子擦拭患者咽部粘膜，取标本。

（2）将拭子浸入 1ml 肉汤小试管内，37℃培养 2～3h。

（3）取出棉拭了作分离培养，常规鉴定。将肉汤液离心 3～4min,3000r/min, 弃上清，沉淀加 0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗涤，再离心沉淀，弃上清。

（4）以沉淀涂片，直径约 1cm, 涂两个圆形区。

（5）将标本放入 95% 酒精中固定 1min，然后浸入 PBS 中洗 1 次，取出室温晾干。

（6）直接法染色，左侧标本作对照，加非溶血性链球菌荧光抗体染色。右侧加甲组溶血性链球菌荧光抗体染色。置湿盒中孵育 20～30min，再用 PBS 洗 2 次，每次 5min，振动洗涤，滤纸吸干标本周围的水。

（7）加缓冲甘油封裱，立即荧光显微镜观察。

免疫荧光检出的阳性率较培养法为高，因为前者可以检出抗菌素治疗后的死菌。二者符合率达 95%。

二、脑膜炎双球菌的快速检查法（一）制备荧光抗体

可用多价和 I、II、III、IV 型单价的脑膜炎球菌抗血清，分别制备多价和单价荧光抗体。

（二）检查方法

用患者咽拭子，脑脊液或培养标本制备涂片，晾干，火焰或乙醇固定，37℃中染色 30min，荧光显微镜检查。

抗脑膜炎双球菌的荧光抗体有很高的特异性，可以快速检出和鉴定脑膜炎双球菌。有人应用免疫荧光检查 267 例脑膜炎病人脑脊液中脑膜炎双球菌，阳性率 73.4%，培养和普通染色则只分别为 41.9% 和 34.4%。

三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法霍乱和副霍乱是严重的传染病，快速诊断才能及早防治。取病人粪便标本直接涂片荧光抗体染色检查，与常规培养法比较，具有快速特异和检出率很高的优点。尤其适用于急性期病人的诊断。

四、鼠疫杆菌的快速检查法鼠疫是烈性传染病，快速及时的诊断对于控制流行和救治病人有决定性意义，免疫荧光快速诊断方法是一种特异和敏感的手段。直接法和间接都可应用，以直接法更简便。

五、炭疽杆菌的快速检查法炭疽也是一种烈性传染病，早期快速诊断对救治病人有决定性意义。免疫荧光检查方法对炭疽杆菌的检出率很高。应用抗夹膜荧光抗体检查炭疽杆菌有十分确定的诊断意义。也可用间接法检测血清中抗夹膜抗体。

六、致病性大肠杆菌的快速检查法（1）制备当地常见的致病性大肠杆菌荧光抗体。

（2）取病人大便标本或直肠拭子以生理盐水搅和涂片，晾干，火焰固定。

（3）直接法免疫荧光染色，立即荧光显微镜检查。

由于本菌较其他非致病性大肠杆菌组有特殊的抗原，不易发生强交叉反应。所以，在儿童肠炎和引起人群暴发性肠炎时更准确、快速和简便。

七、结核杆菌的快速诊断方法结核杆菌感染机体后可以诱导产生抗体，可用间接法检查血、胸腹水和脑脊液中的抗体。

也可用抗结核杆菌的荧光抗体直接法检查抗原。

八、其他细菌的快速检查方法对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断，效果良好。

九、钩端螺旋体的检查法（1）根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记 FITC 制成荧光抗体。

（2）检查方法：

①血液标本的检查：取发热期的病人或发病动物的血液约 2ml，制取血浆，并加入钾明矾（0.058g/ml），振荡混匀后置室温 10～15min，然后中速离心沉淀，取沉渣涂片，晾干，95% 酒精固定。免疫荧光染色，镜检。

②尿液标本检查：取病人或动物尿液约 2～3ml，高速离心，取沉渣涂片，无水乙醇固定，免疫荧光染色，镜检。

③脏器标本的检查：取发病动物的肾脏皮质部分，以刀片切出整齐断面，滤纸吸去血液，再以洁净载玻片压印制片，晾干后以丙酮在 4℃固定。经 10% 甲醛固定的组织可作冰冻切片，依丙酮 - 乙醇 - 甲醇的次序固定，荧光抗体染色前以 3% 表面活性剂如 Tween20 处理切片，据称，这样可使荧光强度增加 4 倍。

④培养液检查：同尿处理。

⑤特异性抗体的检查：用适当血清型的钩端螺旋体作抗原，用间接法检查病人血清中的特异性抗体，可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。

本法诊断钩端螺旋体，一般只具有属的特异性，鉴定抗体则可能达到型的特异性。

十、梅毒螺旋体的检查法免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70 年代应用 PAP 法又将敏感性提高了许多倍，此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可 PAP 法，取已知梅毒螺旋体作抗原，检查病人血清中的特异性抗体。

（一）抗原制备

以标准株（如 Nicol 株）梅毒螺旋体感染家兔睾丸，约 1 周后待睾丸产生明显炎症，剖腹将睾丸摘除，仔细清除精索、附睾和包膜，然后以灭菌器械将其剪成薄片，置于烧瓶内，加入 20ml 生理盐水，振荡 30min，使螺旋体逸出，2000r/min 离心 10min 以除去组织碎块和血细胞，将上清高速离心（10,000r/min）30min，去上清，沉淀以 5ml 生理盐水洗涤，再高速离心，洗涤，反复 3 次以上，以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白，最后以 pH7.2PBS(内含 0.01% 硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含 10，000，000 螺旋体的悬液，置 4℃保存备用。有效期约半年。

（二）荧光抗体

用抗人 IgG 和 IgM 荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒，必须用抗人 IgM 荧光抗体。

所有稀释用 PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/lNaCl Ph7.2 含 1%Tween-80。

（三）间接免疫荧光染色方法（FIA 试验）

1．定性检查先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片，每片涂 4 个点，在室温中晾干，丙酮固定 10min。各点分别加-1：50 稀释待检血清；②-1：200 稀释阳性血清；③-1：50 稀释阴性血清；④-PBS。放入湿盒，在 37℃或室温中放置 20min，用 PBS 振荡洗涤 10min，再加适当稀释的抗人 IgG 和 IgM 荧光抗体，再同上条件下放置 20min，水洗，封裱，镜检。结果如①、②荧光阳性，③、④阴性，待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光，亦有人将待检血清稀释 1：200 作定性检查，这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应，此法又称 FTA-200 试验。

2．滴度测定如定性检查阳性，则被检血清应进一步稀释成 1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600……以定出染色滴度，滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。

（四）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称 FTA-ABS）

FTA-200 试验敏感性较差，有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA-ABC 试验不但敏感性高，而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体 Reiter 株的培养液于 121℃高压加热 10min，然后高速离心、沉淀，取其上清浸液作为吸附剂，并用以稀释病人血清（1：5），然后如上法（FTA 试验）进行染色检查。

FTA-ABC 所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原，推荐置 1.0% 清蛋白、0.0375mol/ l 葡萄糖、0.01mol/ L 二氯化镁和 0.85% 氯化钠溶液（用 0.1mol/ L 磷酸钾缓冲液 pH6.8 配制）中冰冻干燥保存，其中清蛋白起保护剂的作用，葡萄糖可增加折光率，二氯化镁维持螺旋体的形态学，缓冲液稳定 pH。

（五）梅毒螺旋体的直接检查法

取梅毒局部硬结渗出液涂片，用直接法或间接法免疫细胞化学染色，更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用 RB200 标记牛清蛋白作初染色，图像更为清晰。

第二节 在病毒学中的应用免疫细胞化学在病理学中的应用最为广泛，并取得了很大成果。

一、病毒抗原定位免疫细胞化学技术十分适合于病毒和病毒抗原在组织培养和机体细胞内的生长繁殖定位的观察。

1．

2．先核后浆定位水痘、流感（甲、乙）、鸡瘟、假狂犬病、单纯疱疹、腺病毒 2，3，4，5，7 型，多型瘤、劳斯探氏肉瘤病毒，先在核复制，随后在胞浆中定位。

3．先浆后核定位痘苗、脊髓灰质炎、麻疹等病毒是先在浆中复制，后进入细胞核。

4．

5．胞浆内定位腮腺炎、新城疫、仙台病毒、流感、口蹄疫、鹦鹉热、狂犬病、小鼠脱足病、痘苗、墨内山谷脑炎、马脑炎、埃及 101 病毒、黄热、乙型脑炎、痘病毒、天花等病毒。

二、病毒感染过程用免疫细胞化学方法可以看到病毒从宿主的细胞到细胞，丛一个部位到另一个部位的扩散过程，如用免疫荧光技术看到了犬肝炎病毒的血行扩散；犬瘟热病毒的淋巴和血行扩散。免疫荧光双重染色法用以观察双重病毒感染，如蜱传染毒（TBE）和麻疹病毒同时感染羊胚肾细胞，看到双重感染细胞中病毒抗原和核酸的分布不同于单种病毒感染者。

三、肿瘤与病毒用免疫细胞化学可以观察肿瘤病毒和细胞，病毒抗原和肿瘤抗原之间的互相关系。如在不能查出传染病毒的肿瘤细胞中发现了病毒抗原；在典型的肉瘤细胞胞浆中发现了劳斯（Rous）氏肉瘤病毒；对 EB 病毒与非洲淋巴瘤、鼻咽癌和白血病等的关系进行了有价值的研究，并发现了与 Eb 病毒感染有关的两类抗原，调查了某些疾病病人和正常人血清中抗 EB 病毒抗体的分布情况。王文亮等在原发性肝癌细胞中发现了乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）和核心抗体。

四、病毒计数五、病毒的快速诊断

免疫细胞化学为病毒感染性疾病的快速诊断开创了一个广阔的道路（参见表 16-2），最先用免疫荧光法作流感病毒快速诊断，证明有较高的特异性。随后，对流行性乙型脑炎，脊髓灰白质炎、呼吸道和肺炎腺病毒、疱疹病毒等进行了临床快速诊断，提高了诊治效果。近年，利用免疫细胞化学方法检测 EB 病毒 IgA 抗体诊断鼻咽癌取得突破性成果，对于早期诊治鼻咽癌作出了重大贡献。在早期诊断流行性出血热方面，免疫细胞化学方法更显示了其优越性，利用感染流行性出血热病毒的细胞培养标本，可以在发病的早期查出 IgM 抗体，作出早期快速诊断。检测患者血清中的抗体和效价，更有利于病毒感染性疾病的防治，也可直接检查病变中的病毒。

表 16-2 免疫细胞化学在病毒学的应用

疾病检出对象标本方法敏感性特异性意义各种立克次体病抗体血清IIF高高诊断抗原病变组织DIF中～高高流病调查呼吸道病毒感染抗（IgM，IgG，IgA）病毒（RS，流感甲、乙副流感 1，3，4，6b，腺病毒组、麻疹、腮腺炎、风疹）血清、脑脊液、其它体液、鼻咽部洗液、呼吸道分泌物、病变组织、活检及尸检材料、组织培养材料IIF高高诊断IIF中～高中～高同上DIF诊断病毒性肝炎HBsAg血清、组织DIF高高辅诊HBVIIFHBcAg血清、组织IIF高高辅诊DIFHAVHA Ag肝活检IIF高高研究疱疹病毒感染单纯疱疹抗原皮肤刮屑IIF高高诊断巨细胞病毒感染抗体血清IIF高高诊断ACIF带状疱疹抗体血清IIF ACIF高高辅诊EB 病毒感染抗体血清IIF高低辅诊狂犬病抗原犬脑DIF高高受伤人确诊抗体血清IIF中中诊断虫媒病毒感染抗体血清IIF高高诊断和流马脑炎病调查登革、黄热圣路易脑炎抗体血清IIF高中同上乙型脑炎抗体血清IIF高高诊断无菌性脑炎抗体血清IIF高高诊断出血热、拉赛热抗体血清IIF高高诊断流病AIDS 病毒抗体血清IIF高高调查注：ACIF：抗补体免疫荧光法：DIF：直接免疫荧光；IIF：间接免疫荧光（引自：黄策：免疫荧光和荧光免疫，1983）

作者等用免疫荧光和 ABC 法在人肾组织中发现了流行性出血热病毒抗原。

免疫荧光细胞化学技术为病毒感染的快速诊断开辟了一条很有希望的道路，一方面可用于病原体检出，另一方面可用于抗体的检出。

（一）病毒的检查

1．原发感染材料的直接制片检查取病人或感染动物的末梢血液、尿、大便、脊髓液，咽喉鼻腔拭子、含嗽液、表皮病变渗出物、以及尸检材料等。进行直接法免疫荧光染色检查。可在 2～3h 以内得出初步结果。

2．组织培养物检查将取自病人或感染动物的材料感染培养细胞，待病毒在细胞内发育繁殖到一定程度后才能作免疫荧光检出，一般需 10h 以上。

3．接种动物感染材料检查将取自病人的感染材料接种实验动物如小鼠、鸡胚，使其发病，然后以免疫细胞化学方法检查实验动物的各种感染标本。

（二）抗体的检查

用已知病毒感染的细胞培养物为抗原，现酮固定 10min，用病人待检血清与抗原反应 20min，再用抗人 IgG 和 IgM 荧光抗体分别染色 30min，按常规洗涤、裱封、镜检。一般需在发病过程中，前后两次检查（急性期和恢复期各一次），证明被检血清的染色强度有 4 倍以升高时，方能确定诊断。它比常规血清学方法操作简便，对有些病毒感染敏感性较高。张新生等利用金黄色葡萄球菌表面蛋白 A（SPA）能与 IgG 的 Fc 段结合这一特点，用全菌体作为标记靶吸附病毒，形成花环状结构，再用 2% 磷钨酸负染色后在电镜下观察，操作简便，易于推广。

（三）常见病毒的快速检查方法

1．乙型肝炎病毒抗原的快速检查方法作者用免疫荧光间接法，PAP 法和 ABC 法分别对人活体肝穿刺组织和尸检的肝炎、肝硬化和肝癌组织、先用 10% 甲醛固定、石蜡包埋切片，进行了乙型肝炎病毒 HBsAg、HBcAg 和 HbcAb 的检查，在肝细胞、胆管上皮细胞和癌细胞内发现了这些抗原或抗体，对诊断和发病机理研究有重要意义。

2．狂犬病毒的快速检查方法可直接检查活检和尸检材料或查角膜印片中的狂犬病毒抗原，用直接法最成功。也可用间接法检测 IgM 抗体进行早期诊断。最好用免疫荧光法。

3．疱疹病毒的快速检查方法疱疹病毒（HSV）的抗原用直接免疫荧光检查，常取眼结合膜细胞，皮肤刮片，活检和尸检材料。

4．巨细胞病毒的快速检查方法用抗补体荧光抗体方法作此病毒抗原的特异性检查，常取尿沉渣中的细胞涂片标本进行检查。

5．流感病毒的快速检查方法最早用免疫荧光法检查流感病毒，一般采用直接法检查鼻咽部脱落细胞涂片中的病毒抗原。也可用间接法检测抗体，必须使用单价特异性羊抗人 IgG 荧光抗体，以避免与上皮细胞上的 IgA 发生非特异性荧光。

6．麻疹病毒的快速检查方法检查麻疹病人出疹前后的鼻咽部分泌物和眼结合膜中的细胞可快速检出病毒抗原。也可用尿沉渣细胞标本直接法检出抗原。用间接免疫荧光法可检出病毒抗体作快速诊断。

7．流行性出血热病毒快速检查方法直接法检查白细胞中的抗原，单克隆抗体可制备高效价的荧光抗体。用间接法可快速检出病人 IgM 抗体，对病人进行早期诊断是我国的创新，世界卫生组织向各国推荐。

8．爱滋病病毒抗体免疫荧光检查方法目前常用以下方法检查患者血清中的 AIDS 病毒抗体，对高危人群和可疑患者进行病毒抗体检查具有重要的意义。

抗原片：将 AIDS 病毒感染的 Hu-T-78 细胞用 PBS 制成悬液，滴于玻片上，吹干，丙酮固定，装入塑料袋中，密封，-40℃保存。阴性对照用 Hu-T-78 细胞，同上法滴片处理。

间接免疫荧光检查法。

（1）先将待检血清用 PBS 作 1：16 稀释，取 30μl 滴加在抗原片上，放入湿盒，37。C30min。

（2）用 0.01mol/L,PBSPh7.0 洗涤 2 次，每次 3min。

（3）滴抗人 IgG 荧光抗体，湿盒 37℃3min。

（4）PBS 洗 2 次，每次 3min。

（5）缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。

结果：抗原片细胞浆内出现弥散荧光，阴性对照无荧光。

9．其他病毒的快速检查方法腺病，带状疱疹病毒，付流感病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸道细胞病毒，风疹病毒，肠道病毒，乙脑病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒等已有报告用免疫荧光法检查抗原或抗体作快速诊断。

第三节 在寄生虫学中的应用在寄生虫学中应用免疫细胞化学方法，对于人体大多数寄生虫都较其他血清学方法敏感。图象鲜明，易于观察。在诊断方面，免疫荧光间接法最常用于检查宿主的抗体。抗原制备容易，只需要作成切片、涂片或压印片标本，不需提纯可溶性抗原；有些可溶性抗原固定于醋酸纤维滤纸上，反应后以荧光计读数，可以定量。

但是，对于血中缺乏抗体的寄生虫如皮肤利什曼病，则难以诊断。还有些寄生虫（如扁形蠕虫）抗原性的变化，则需制备多种抗原。丝虫等有较强的抗原交叉性，解释结果必须慎重。

一、血吸虫病（一）抗原

可用尾蚴成虫。

1．尾蚴抗原将每毫升 300 条左右的尾蚴悬液与等量 20% 福尔马林混合。作用 5min 后，用 PBS 洗涤离心 2 次，取尾蚴沉淀备用。在 4 ℃保存。

2．成虫抗原 可将成虫制成切片，甲醇固定 10min，低温保存备用。

（二）待检血清

可按常规静脉采血分离血清，也可自指尖或耳垂微量采血（约 0.05ml），滴于优质滤纸上干燥，试验时用生理盐水浸取可溶性免疫球蛋白成分。干燥于滤纸上的血样，在室温中（22～26℃）或普通冰箱中保存 3 个月以上，可以邮寄。

（三）荧光抗体

可用抗人 IgG 或 IgM 荧光抗体，其特异性需经免疫电泳鉴定。

（四）检查方法

1．尾蚴染色法可将抗原沉淀以白金耳挑取涂片，干燥后以甲醇固定 10min。然后按常规间接法染色。

2．成虫染色法同一般切片间接法。

据报道，此法敏感性可达 80%～98%。

二、疟疾免疫荧光间接法用于研究人和实验动物对疟原虫感染的免疫反应，疟疾流行病学调查和临床诊断有很大的实用价值。

1．抗原标本人疟原虫标本制备：采用多种疟原虫混合抗原，制作涂片，甲醇或丙酮固定。要每个高位中视野含裂殖体总数约 15 个即可。或用易感猴的各种疟原虫感染的红细胞。

鸡疟原虫抗原标本制备：取感染疟原虫后第 9～11 天之间的鸡血制备血膜，贮于 4℃或 -20℃下，用前丙酮固定 10min。

2．待检血清采血方法同血吸虫法。

3．荧光抗体常用抗人 IgG 荧光抗体。

4．检查方法待检血清以 1：20 起始稀释，按间接法染色，镜检。

5．结果判断阳性结果，人类疟原虫包涵体呈现明亮的黄绿色荧光。鸡疟原虫抗原主要显示胞浆染色。1：16 或 1：20 稀释待检血清阳性时，可以继续稀释作滴度检查。低于 1：20 的结果无意义。用人类疟原虫多种混合抗原和单抗原，病人抗体染色效价可达 1：65536，1：1024～1：4096 者占 1 /3。以鸡疟原虫作抗原，效价最高 1：640，以恶性疟最高为 1：150，间日疟为 1：40。

三、阿米巴病用间接免疫荧光方法检查阿米巴肝腔肿病人血清抗体，阳性率可达 90%～100%。血清抗体滴度在 1：80 或 1：160 有诊断意义。治疗后抗体滴度下降。肠道阿米巴疾病阳性率较低（59%～91%）。

四、锥虫病用间接免疫荧光方法检查各种锥虫病患者血清抗体，对于恰加斯氏病（克氏锥虫所致）的血清抗体诊断，有高度的敏感性和特异性。用于检查非洲锥虫病的阳性率为 85.9%（WHO，1976）。冈比亚锥虫和罗德西亚锥虫所致非洲昏睡病的血清抗体诊断，在检测特异性抗体时，同种抗原比异种抗原好，可达到最高的敏感性。

五、丝虫病应用丝虫成虫冰冻切片抗原作间接免疫荧光检查适用多种丝虫病免疫诊断。很有价值。如魏氏棘唇线虫抗体阳性率可达 905。用作流行病学调查，可反映流行的准确情况。已用于盘尾丝虫、班氏丝虫、犬恶丝虫、广州管圆线虫等抗体的检测。

六、弓形虫病已证实免疫荧光间接法检查弓形虫抗体，是一种诊断弓形虫病的特异和敏感的方法，阳性率可达 98%。用死虫体作抗原很简便，检查 IgM 抗体可诊断新生婴儿先天性感染。

七、旋毛虫病用旋毛虫冰冻切片作抗原，间接免疫荧光方法检查病人血清抗体，很敏感、特异和经济，节 省时间。

八、其他寄生虫病已用间接免疫荧光方法对蛔虫病，弓蛔虫病，钩虫病，线虫病，吸虫病（肺吸虫和肝吸虫）、绦虫病（包括囊虫病和牛肉绦虫以及猪肉绦虫）等进行快速诊断，取得较好的结果。

第四节 在真菌学中的应用真菌感染的疾病包括白念珠菌病，曲霉菌病和新型隐球菌病。常规镜检和培养，检出率低，早期诊断困难。免疫细胞化学检查方法可能具有一定的快诊价值，正在研究改进中。新型隐球菌抗体的免疫荧光检测取得良好的结果，阳性率可达 79%。

参考文献1．许屏，荧光和免疫荧光染色技术及应用. 人民出版社，1983：100～102

2．Nairn RC, Fluorescent proteintracing. F & S .Living stone LTD. Edinburgh and London. Third Edition. 1969：152～246

3. 王文亮，等. 肝癌及其周围组织内乙型肝炎表面抗原(HBsAg). 中华肿瘤杂志,1979；1：101

4.Yan Pei– song, et al. Pathologic renal changes in epidemic hemorrhagic feveraccompanied by chronic renal failure in one case.Chin Med J, 1986；996：503～506

5. 五九一七五部分. 荧光显微术. 上海科学技术情报研究所,1976：244～288

6.CoonsAH, et al. The demonstration of pneumococal antigen in tissue, by the use offluorescent antibody. J Immunol, 1942；45：159～170

7. 谭承项, 等. 乙型肝炎组织内 HBcAg 的免疫组织化学研究. 中华病理学杂志,1987；16(2)：90

8. 晏培松, 等. 流行出血热肾小球的光学显微镜, 电镜及免疫荧光观察. 第四军医大学学报,1982；1：15

9. 黄策. 免疫荧光和荧光免疫. 北京：全军三防医学会议大会论文报告,1983

10. 张新生, 等. 具有标记靶作用的固相免疫电镜快速诊断法. 电子显微学报,1985；4(4)：14

11.LiuYanfang , et al. Intrauterine infection of epidemic hemorrhagic fever (EHF)viaplacenta. Chinese Med J, 1987；100(9)：756

12. 杨守京, 等. 流行性出血热患者组织中红细胞病毒抗原、抗体及补体的原位检测. 中华微生物学和免疫学杂志,1993；2(2)：130～135

第十七章 免疫细胞化学在皮肤病学的应用免疫细胞化学技术已被广泛应用于皮肤科学领域，尤其在皮肤科的自身免疫性疾病如天疱疮、大疱性类天疱疮、红斑狼疮的诊断、病情和疗效判定及发病机理的研究方面，起着重要作用。现将免疫细胞化学在皮肤病学的应用简要介绍如下。

第一节 角朊细胞一、对角质层抗原与角质层自身抗体、角蛋白抗原的研究角朊细胞从上到下可分为角化（质）层、粒层和基底层。角质层位于表皮外层，是一种特殊的结构，由许多已角化的扁平细胞组成。电镜下仅见增厚的胞膜和紧密排列的张力微丝。角质层很少或根本不与免疫系统相通。应用免疫荧光技术表明，所有正常人血中都含有低滴度的抗角质层自身抗体，免疫荧光呈局灶状或颗粒状分布于角质层内。在体外，角质层抗体与其产生者自身的角质层发生反应，因而证明是自身抗体，但在正常人体内不发生反应。下列两种情况可使其在体内与角质层发生反应：①外伤；②银屑病鳞屑内。银屑病人血清中的抗角质层自身抗体与正常人无差别，但在银屑病的鳞屑浸出物中发现有 Ig。这种抗体是能与补体结合的 IgG 和 IgM 型抗体。

角质层抗原与角化细胞的细胞膜或 / 和细胞间质有关，近年来通过对角蛋白多肽的研究发现至少一些角质层的自身抗体是针对角蛋白的。

抗角质层自身抗体的应用：抗角质层自身抗体存在于正常人血清中，但并不引起疾病。该种抗体可能对于清除损伤了的表皮细胞有一定的作用，银屑病中角朊细胞的过度增生可能与这种抗体的沉积有关。与抗角质层自身抗体有关的疾病尚有类风湿关节 炎、关节 病型银屑病、外伤等。

制备的抗角蛋白抗体：近 10 年来，应用免疫动物的方法制备了多种抗角蛋白多抗或单抗，可以针对不同分子量的角蛋白成分。角蛋白是上皮细胞的中间丝成份，抗角蛋白抗体可以作为上皮组织和由上皮组织起源的肿瘤的有用标记之一。

二、对天疱疮的研究天疱疮是一类自身免疫性疾病，其临床特点为皮肤和粘膜的自发性的、松弛性的水疱形成，病理特点是由棘层松解引起的表皮内水疱。临床上可分为寻常型（PV）、红斑型、落叶型（PE）、增殖型、疱疹样型五型。

1．免疫荧光检查应用 IIF 检查，天疱疮病人中 85%～90% 血清中有抗表皮棘细胞间抗体（Pab）存在，活动期更高。血清中 Pab 滴度与病情严重程度相平行。免疫荧光图形是棘细胞间均一的线型。作 IIF 检查时，底物很重要。Michael 等比较猴食道及豚鼠食道上皮作为 PV 和 PF 的底物情况，发现 PV 以猴食道上皮作底物较好，而 PF 则以豚鼠食道上皮作底物较好。唐书谦等认为作 IIF 时首选人表皮和猴食道上皮，而小白鼠食道及大白鼠舌粘膜亦可作为一般常用的底物。我们的经验是，-20℃保存 1 年的冰冻人包皮切片作底物时，其抗原性无明显减弱，但时间过长，则要影响其滴度；冰冻切片后的皮肤暴露于室温（20℃±）3h 即可完全破坏其抗原。

取天疱疮皮损周围皮肤作 DIF，对天疱疮的诊断更有意义。如天疱疮的皮损广泛，也可取外观“正常”的皮肤，而不一定要取皮损边缘的皮肤，但皮损边缘的皮肤荧光抗体稀释度较“正常”皮肤者为高。

2．免疫荧光显示的部位在 PV 中，免疫球蛋白附着的部位一般在基底细胞上棘细胞下层；而在 PF 中，免疫球蛋白附着的部位在较上层的棘细胞间。与 Pab 结合的天疱疮抗原位于表皮细胞表面，其细胞间的荧光是细胞表面荧光的延伸。免疫电镜证明天疱疮抗原可能与桥粒列明显关系。

除用免疫荧光法可证明有 Pab 存在外，目前也用酶标法、ABC 法等。

天疱疮抗体主要为 IgG，也有部分为 IgM 和 IgA。应用 DIF 检查时，也发现有 C 3沉积，但目前认为可能是继发于 Ig 的沉积。

3．天疱疮抗体与天疱疮的关系可由以下几方面来证明①DIF 证明天疱疮病人皮损周围及“正常”皮肤处有 IgG 的沉积，且其荧光强度与病情的严重程度相平行；②血清中的 Pab 滴度与病情的严重程度相平行；③进行皮肤器官培养时，加入纯化的 Pab 可导致天疱疮样的棘层松解；④用血浆交换法去除 Pab 可导致天疱疮的缓解。

天疱疮抗体是针对表皮细胞膜多糖萼的抗体，其在体内与表皮细胞膜结合后可能使表皮细胞释放蛋白溶解酶如 u –PA,u-PA 在天疱疮发病机理中的作用：1）角朊细胞培养时加入 Pab 后，上清液中 u -Pa ↑；2）抗 u -PA 抗体可阻止棘层松解发生；3）u-PA 的抑制剂如 α 2- 巨球蛋白、STBI 以及合成抑制剂 Foy、Foy-305、FUT-175、止血芳酸等均能在一定程度上抑制 Pab 导致棘层松解的产生。

4．天疱疮样抗体与血型抗体 Ahmed 及 Workman 检查 1500 份正常血清，发现 14 例有低滴度的抗表皮细胞间抗体，但无天疱疮的临床表现，其中 9 例用 A、B 型血型物质吸收后荧光消失，说明其可能为 A、B 血型抗体，A、B、H 血型抗体存在于正常皮肤和口腔粘膜的棘层和颗粒层，但不存在于基底层和角化层，其分布同天疱疮抗原。药疹、烧伤等可有天疱疮样抗体，其与 Pab 的区别在于前者稀释度较低，荧光染色图形为粗颗粒状、不均一，且部分可用 A、B 血型物质吸收，而 Pab 的荧光图型为连续均一的线型，用 A、B 血型物质吸收后滴度不变。

三、HLA-DR 抗原人类有核细胞均存在 MHC- I 类抗原（HLA-A、B、C），表皮中下层亦有表达，但角质层阴性，其与皮肤病的关系有较多的报道。但本文只就角朊细胞表达 HLA-DR 抗原（在鼠为 Ia 抗原）作一简述。

人类 MHC-II 类基因位点主要有 HLA-DR、DQ、DP 三种抗原。HLA-DR 抗原常存在于免疫活性细胞上，与抗原提呈给 CD4+辅助 T 细胞有关。

1981 年 Lampert 等首先报道在移植物抗宿主反应（GVHD）中角朊细胞有 HLA-DR 抗原存在。HLA-DR 的图型为粗网状。后来人们发现，皮肤中有显著淋巴细胞浸润的疾病如 GVHD、MF、湿疹、DLE、扁平苔藓时角朊细胞能表达 HLA-DR 抗原。白兆霞等对尖锐湿疣皮损组织进行免疫学检查，发现尖锐疣组织中 HLA-DR（3/4）阳性，HLA-DQ（1/15）阳性，HLA-DP（3/14）阳性，而正常皮肤不表达 HLA-DR 抗原。

正是因为有了角朊细胞能表达 HLA-DR 抗原的证明（另一个证明是角朊细胞能产生一些细胞因子），现代皮肤病学家才不仅仅瓜皮肤作为一个单纯的物理屏障和湿度调节 器，皮肤免疫系统（Skin immune system, SIS）的概念才得以形成。SIS 的细胞成份包括：角朊细胞、肥大细胞、树枝状抗原提呈细胞、组织中的巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、内皮细胞、T 细胞等；体液成份包括：抗微生物多肽、补体、免疫球蛋白、细胞因子、纤溶素、花生四烯酸、神经肽等。

四、凝集素受体随着表皮细胞分化从基底层进到角化层，基细胞表面的糖链亦有改变。在新生兔表皮中，rittonla simplictolia Isolectin1-B4(GSI-B4与 α-D-galactopyranosyl 残基结合)与基底层结合较强，而与棘层结合较弱，不与粒层、角南层结合。UEA（与 α-L-fucose 残基结合）与棘层、粒层下部结合，但不与基底细胞层和角质层结合。Con-A：基底细胞荧光较棘层弱，用 96% 乙醇固定皮肤时，荧光大为减弱，10% 福尔马林固定则使荧光完全消失，Con- A 的免疫荧光图型同 Pab, 但 Con- A 也使基底膜带和真皮胶原着色，Pab 与 Con- A 的荧光在角朊细胞时能相互阻滞，因而认为天疱疮抗原可能是表皮细胞膜上能与 Con- A 结合的一个多糖萼成分。PNA 在猪表皮中使表皮各层活细胞（即角质层除外）着色，而在人组织则仅使基底层上活细胞着色。

表皮细胞癌变过程中，表面多糖类也发生改变：可表现为①正常寡糖基增加或丢失；②正常糖基分布改变；③出现一些未成熟的或新的寡糖基而成为与肿瘤相关的决定簇。我们的研究认为 PNA、BSL、UEA 在生殖器疣，尤其到 PIn III/CIN III 及生殖器癌阶段时染色显著增强，而 LCA 则无明显改变，DBA 在 PIn III/CIN III 时阳性率最高，到癌变时又下降，其原因尚不清楚。

凝集素受体主要为细胞浆着色，但有部分可使细胞膜着色。

五、其它用人工制备的抗桥斑、桥糖蛋白抗体，抗细胞粘附分子、转铁蛋白、表皮生长因子、糖皮质激素等抗体，也发现了皮肤角朊细胞上有这些物质的受体存在。应用免疫组化和相关的技术，将会进一步明确它们的作用及其与皮肤病之间的关系。

第二节 黑素细胞及其肿瘤一、正常黑素细胞人类黑素细胞主要分布于表皮基底层。表皮黑素细胞起源于神经嵴。HE 染色的切片中，黑素细胞核小浓染，胞浆透明，约 10 个基底细胞中可见一个。能确定黑素细胞的方法有透射电镜观察及多巴染色。免疫细胞化学染色目前仅以抗 S -100 蛋白抗体着染有一定参考意义，根据其位于基底层一般可判断其系黑素细胞，但有时 Langerhan 氏细胞也可存在于基底层，而且我们在应用中还发现，不少皮内痣未累及表皮的黑素细胞作 S -100 蛋白染色时，表皮基底层未能显示阳性的黑素细胞。中间丝系列中，黑素细胞波形纤维蛋白阳性。此外，黑素细胞尚可表达黑素小体相关抗原（HMSA）、一些神经苷酯、P97 等黑素瘤相关抗原，但极微弱。

二、色素痣色素痣可表达与黑素细胞相同的抗原，且通常较强。1987 年 Nakanish 等曾克隆出一析仅与色素痣而不与正常黑素细胞及黑素瘤细胞反应的单抗 TNKH1，由于未见进一步的研究，尚不能认为色素痣中存在一种特异抗原。

三、恶性黑素瘤恶性黑素瘤主要起源于表皮黑素细胞，少数起源于色素痣、真皮等。在黑素细胞及其肿瘤中，表皮黑素细胞最为成熟，除分化抗原外，表达的抗原少，色素痣特别是交界痣处于较低的增殖状态，表达的抗原较多，恶性黑素瘤分化最低，增生活跃，除能表达正常黑素细胞及痣细胞所表达的抗原外，尚能表达一些特殊的黑素瘤相关抗原，或表达强度远高于正常黑素细胞及痣细胞。

近 10 余年来，已克隆出许多株黑素瘤相关抗原的抗体，但至今尚未发现一种真正的黑素瘤特异抗原，有的单抗虽具有很高的特异性及敏感性，如两伯称 2 -139- 1 及 6 -26- 3 的单抗，黑素瘤阳性率 26/26，呈强阳性或中度阳性，22 例色素痣仅 1 列交界痣可疑阳性，然而近 10 年的文献跟踪未见进一步的深入研究。

在众多的黑素瘤相关抗原中，以 P97、神经节 苷酯、HMB45研究得较深入。诊断应用中应用最多的是 HMB45,Gown 等以 ABC 法观察了 60 例恶性黑素瘤，仅 2 例阴性，交界部痣细胞阳性 6 例，皮内痣及 30 种 168 例非黑素细胞性肿瘤全部阴性。最近的免疫电镜观察显示，HMB45抗原定位于黑素化不完全的黑素小体或称异常黑素小体上。由于大样本量的电镜观察发现少数先天性痣的皮内痣中可以有异常黑素小体，另一方面少数黑素瘤中不一定存在异常黑素小体，所以应用 HMB45时，除需注意交界部的阳性对黑素细胞肿瘤的良恶性鉴别无意义外，皮内损害中的阳性与阴性亦应结合 HE 切片进行分析。

神经节 苷酯（Ganglioside）是一类带唾液酸的鞘糖酯，按糖基中唾液酸的数目分为单、二、三、四唾液酸神经节 苷酯，分别简称 GM、GD、GT 和 GQ，每种神经节 苷酯还可根据薄板层析迁移率 Rf 值的大小再分几个亚类，如 GD1、GD2、GD3等。神经组织、黑素细胞等含很微量神经节 苷酯，细胞恶变过程中往往伴有神经节 苷酯的改变，其改变程度与肿瘤的恶性程度和转移有关。黑素瘤细胞表达大量 GD3、GM3，25% 原发和 50% 转移性黑素瘤还表达 GD2。研究表明，恶性黑素瘤与正常黑素细胞所表达的神经节 苷酯的结构是相同的，一些神经节 酯的单抗只与黑素瘤结合，不与正常黑素细胞、神经组织结合，可能是由于含量的差异所致，另外可能与神经节 苷酯在细胞表面的暴露程度有关。GM3已被称为黑素瘤的跨种抗原，但 GD3较 GM3更具特异性，因两者在正常黑素细胞中的比值 GM3：GD3为 18：1，在黑素瘤中 GM3：GD3为 1：15。

目前针对神经节 苷酯的单抗有数 10 株，各株的抗原结合特性有一定差异，较早的一株名为 R 24的抗原为 GD3，除与黑素瘤、星形细胞瘤反应外，与其它一些恶性肿瘤及少数正常组织亦有反应。国内引进的一株名为 Mel3的杂交瘤所针对的抗原为 GD2、GT3、GD3、GQ16，10 例黑素瘤组织细胞 100% 强阳性或中度阳性，4/ 7 例色素痣的部分细胞弱阳性或中度阳性，4/14 例表皮黑素细胞呈极弱反应，胎肝以外的其它胚胎组织阴性。田芳等用该单抗所染结果与前述相类似。

P97抗原是一膜结合的转铁蛋白样分子，黑素瘤细胞膜上含量很高。现已克隆出 P 97分子 cDNA 并制备成分子疫苗，但应用前景尚不明。对 P 97的研究主要是应用放免法，很少应用免疫组化方法。

S-100 蛋白、波形纤维蛋白虽不象一些黑素瘤相关抗原那样具有高特异性，但其应用范围广，易获得，所以此二种蛋白的抗体在黑素瘤鉴别诊断中应用最普遍。我们对 68 例病理确诊或疑诊的黑素瘤组织进行染色，结合抗角蛋白抗体标染，HE 切片观察等，否定了 11 例的诊断，余 57 例 S -100 蛋白及波形纤维蛋白均阳性。根据此观察，笔者认为：在 HE 切片观察基础上，排除一些神经性肿瘤、组织细胞增生症 X、色素痣，S-100 蛋白及波形纤维蛋白均阳性，能肯定恶性黑素瘤诊断，两抗体均阴性能否定诊断。

NSE 在黑素瘤中的表达率较低，染色弱，在黑素瘤鉴别诊断中实用意义不大。

第三节 Merkel 细胞一、免疫细胞化学在 Merkel 细胞起源和功能认识中的作用Merkel 细胞系 1975 年 Merkel 在真皮交界处发现的一种比周围基底细胞淡染的细胞，此种细胞与神经髓鞘接触，认为是触觉细胞，并发现其能促进所有特化的感觉功能所接受和传导，这种功能不需触觉小体或环状小体介导。后来在电镜下观察到 Merkel 细胞内含神经内分泌颗粒，组织化学和免疫组化观察到其含有与神经组织有关的酶如特异性乙酰胆硷酯酶三磷酸核苷酶、神经特异性烯醇化酶（NSE）等，出已将此种细胞归类于 APUD 细胞，但其它应具备的 APUD 细胞生物学特征 Merkel 细胞似乎还不具备，许多试图证明单胺代谢的努力均未获结果。

对 Merkel 细胞的起源，曾疑为源于神经嵴，认为系胚胎发生期伴随神经的伸展而移至皮肤。近年的研究发现，Merkel 细胞能表达多种低分子量细胞角蛋白，如 CAM5.2、CK5、AN3等及上皮膜抗原。发生时间上，胚胎等 12 周表皮开始出现单个 CAM5.2、CK5、EKH5等低分子角蛋白阳性的细胞（表皮细胞不表达这些低分子量角蛋白），到 15 至 23 周，真皮浅层亦出现散在的低分子角蛋白阳性细胞，这些细胞 NSE 也呈阳性，以神经纤维蛋白标记显示，胚胎等第 12 周时，皮肤中的神经束位于真皮中部，第 16 周时向表皮延伸，第 20 周达表皮下并延至表皮[2]。这些研究及另外的工作表明，Merkel 细胞系由角朊细胞分化而来，发生于小汗腺嵴。

对 Merkel 细胞的功能，免疫细胞化学研究结果给人们提出了新的思考：表皮 Merkel 细胞为什么要进入真皮？进入真皮后为什么又要数周内即消失？研究表明，真皮内的 Merkel 细胞表达的神经生长因子受体（NGF-R）强于表皮 Merkel 细胞，角蛋白的表达也有差异；Merkel 细胞进入真皮的时间与皮肤的末梢神经形成的时间正好吻合，真皮内 Merkel 细胞减少消失的时间正好是真皮浅表神经未梢与表皮 Merkel 细胞形成接触的时间，提示真皮 Merkel 细胞起着引导形成末梢神经网的作用，当完成引导神经定位的功能后即逐渐消失，这一功能可能是先靠其表达的大量 NGF- R 完成的。小汗腺嵴中的 Merkel 细胞可能起着引导形成导管周分泌神经丛的作用，成人汗腺中不含 Merkel 细胞，可能是在完成神经丛的定位后消失。此外，立毛肌中的肾上腺能神经可能也是由毛盘外的 Merkel 细胞引导的。皮脂腺无神经支配，可能与皮脂腺胚芽中未出现过 Merkel 细胞有联系。

二、Merkel 细胞癌的免疫细胞化学诊断Merkel 细胞癌的组织病理诊断较困难，虽然电镜下所见的神经内分泌颗粒对诊断颇有价值，但需事先留取标本。应用免疫细胞化学技术则可于 HE 切片鉴别有困难后再切片染色。低分子角蛋白如 CAM5.2、CK5等及上皮膜抗原呈阳性，NSE、Synaphysin Chromogranin A 等阳性表明系神经内分泌肿瘤。通常以 CAM5.2及 NSE 两种抗体一起应用，阳性即可作出诊断。与其它大多数 APUD 肿瘤相同，S-100 蛋白呈阴性。

第四节 郎格罕细胞郎格罕细胞（Langerhans cell, LC）是起源于骨髓和脾脏的一种树枝状细胞。LC 主要存在于表皮和毛囊上皮内，通常位于表皮基底层上方。但真皮内，口腔、扁桃体、咽部、食管和阴道的粘膜中以及淋巴结、脾脏和胸腺等部位也可见 LC。表皮内 LC 可以游走、穿越其基底膜。皮肤移植时，移植物中大部分原有的 LC 可迅速被宿主 LC 所替换，只有一小部分 LC 能存在很久。

LC 在超威结构上的特征性表现为 Birbeck 颗粒，亦称郎格罕颗粒。其断面呈网球拍状。LC 内无张力细丝及黑色素小体。LC 也无桥粒，其树枝状突起与黑素细胞、神经及其它 LC 也未见直接的联接。

LC 在体表的分布密度因部位、性别与年龄而有一定差异。正常成人中，面颈最多，躯干、四肢及头顶为次，骶尾及掌跖较少。口腔粘膜的 LC 也较少。

根据 LC 的表面标记可识别 LC，并进一步研究其功能特性。人 LC 的主要表面标记有 FC-IgG 受体、LKT6（Leu6,DAKo -6）抗原，S-100 蛋白、M241 抗原、T200 抗原、Hle- 1 抗原、ATP 酶、Vimentin、非特异性酯酶、Leu3(OKT4)抗原（微弱）。上述许多表面标记除 LC 有外，还可见于其它一些组织和细胞中。但人 LC 是正常皮肤内唯一能与 OKT6结合的细胞，这为皮肤 LC 的研究提供了一个独特的标记。由上述表记可看出，LC 的表面标记与巨噬细胞颇为相似。此外小鼠也是研究 LC 的一种常用实验动物，其 LC 的许多表面标记与人 LC 相似。

现今认为，皮肤是一个具有独特免疫功能的器官，与机体免疫系统密切相关。而 LC 有多种免疫功能。除上述与免疫相关的一些表面标记外，LC 能摄取，提呈抗原，具有同种异基因刺激作用，还可分泌白介素 1 等细胞因子。LC 在接触性变态反应和移植排斥过程中均起重要作用。

免疫细胞化学技术在与 LC 相关研究中的应用。

一、研究 LC 自身的表面标记应用免疫细胞化学技术进一步研究 LC 表面受体或表面分子，以加深对 LC 功能特性的认识。通过单克隆体免疫细胞化学及 RT-PCR(reverse transcriptase –ploymerase chain reaction) 技术证实，新鲜分离的人 LC 能显示 2 种 FcεRII：一种是膜相关型，可用单抗 CD12检出；另一种为可溶性分泌型，可用 RT-PCR 证实。近年还报告，在异位性皮炎皮损中 LC 能显示高亲和力 IgE 受体（FcεRI）。

人 LC 还能表达 β 1整合素（β1integrin），后者能介导与板层素和纤维粘连蛋白的粘附。培养的 LC 还可表达白细胞功能相关抗原 3 型（leukocyte functio –associated antigen –3 ,LFA-3）和细胞间粘连分子 - 1 型（intercellular adhesion molecule –1），而新鲜分离的 LC 则不能显示。

抗 CD1单抗（如 OKT6、Leu6）是显示 LC 最常用的。目前已知 CD1可分为 CD1a、CD1b、CD1c三种，正常表皮 LC 为 CD1a(+)。在异性皮炎及蕈样肉芽肿的 LC 可异常显示 CD1b及 CD3b。组织细胞增生症 X 的 LC 尚可同时显示 CD11b。

二、研究皮肤病中 LC 数量、密度及结构的改变应用免疫酶和免疫电镜等技术检查 LC 数量、密度以及结构的变化，可探讨 LC 与皮肤病的关系以及外界因素对皮肤 LC 的影响。包括：

1．观察外界因素对 LC 的影响观察化学因素（如氮芥）、紫外线、X 线及冷冻等因素对 LC 密度和结构的影响。

2．观察疾病情况下 LC 的数量和密度变化如蕈样肉芽肿、扁平苔藓、玫瑰糠疹、硬化萎缩性苔藓、疣状皮结核、白癜风和斑秃等皮肤病中 LC 增加。原发刺激性接触性皮炎中 LC 数量减少，而变应性接触性皮炎中 LC 数量增加。皮损内 LC 减少的疾病有：麻风、红斑狼疮、结节 病、AIDS、移植物抗宿主病，皮肤癣菌病等。此外，银屑病皮损处，LC 分布不均，甚至聚集成群，治愈后可恢复有规则的分布。

免疫细胞化学技术将有助于进一步了解众多皮肤病中 LC 数量或密度的改变，同时也将加深对 LC 本身表面标记的全面认识，从而有助于全面认识 LC 的功能特点以及与淋巴细胞、角朊细胞及肥大细胞等细胞成分的相互影响。

第五节 真皮与表皮交界真皮与表皮交界不平。真皮乳头与表皮的突起部分（即表皮突）互相镶接。

一、基底膜带（一）基底膜带（basementmembrane zone, BMZ）的结构

基底膜带位于表皮真皮连结处，用 PAS 染色光学显微镜下所见为 0.5～1μm 厚的均匀一致的紫红色带，称为表皮下基底膜带。

1．BMZ 的超威结构在电镜下观察，BMZ 由表皮侧至真皮侧可分为四层结构：

（1）基底细胞的胞浆膜（plasmamembrane）及膜内侧的半桥粒（hemi – desmosome）。

（2）透明板（透明带，laminalucida），位于胞浆膜下方，约 35～40nm 厚，其中包括基底层下致密板，为 7～9nm 厚的电子致密片，距胞浆膜约 10nm；锚丝（anchoring filament, 直径约 5～7nm）从半桥粒穿过基层下致密板而固定于致密板上。

（3）致密板（laminadensa）：厚约 80～200nm，又分为三层：①内层，厚 10～20nm，电子密度低；②中层，厚约 50～150nm，电子密度高，即狭义的基板（basal lamina）；③外层：厚 10～20nm，电子密度低。

（4）基底膜下纤维带有：有 3 种纤维结构：①锚纤维（anchoring fibril），直径为 20～60nm，从致密板伸向真皮；②微原纤维；③胶原纤维。

（二）病变部位于基底膜带的几种大疱性皮肤病

病变部位于基底膜带的几种大疱性皮肤病常见的有以下几种：①大疱性类天疱疮（Bullous Pemphigoid, BP）；②疤痕性类天疱疮（Cicatrical pemphigoid, CP）;③妊娠疱疹（Herpes Gestations, HG）;④疱疹样皮炎（Dermatitis Herpetiformis）；⑤成人线状 IgA 大疱性皮病（Linear IgA Bullous Dermatosis ofAdult, LADA）；⑥儿童良性慢性大疱性皮病（BenignChronic Bullous Dermatosis of Childhood, BCBDC）；⑦获得性大疱性表皮松解症（Epidermolysis Bullosa Acquisita, EBA）。

1．大疱性类天疱疮（BullousPemphigoid, BP）本病是一种慢性全身性表皮下大疱性皮肤病。直接免疫荧光（DIF）检查：90% 以上患者的皮损及皮损周围正常皮肤基底膜带可见到 IgG 及 C 3呈线状排列，有时 IgA 亦为阳性。在远离皮损的正常皮肤及皮损已消退者亦可有 IgG 及 C 3沉积于基底膜带。免疫电镜定位 IgG 和 C 3沉积于基底细胞膜下方的透明板内。

70% 左右患者 IIF 法可检出血清中有抗 BMZ 抗体，主要为 IgG，其滴度水平与病情活动度无相关性。

BP 抗原分子具有异质性，BP 主要抗原为-230kD 的蛋白质分子，少部分 BP 抗体尚能与其它一些不同分子量的蛋白质相结合。

2．疤痕性类天疱疮（CicatricialPemphigoid, CP）本病又称良性粘膜类天疱疮（Benign mu-cosal Pemphigoid），是一种好侵犯粘膜尤其是眼结合膜的慢性水疱性皮肤病，DIF 检查皮肤和粘膜受损处的基底膜带有线状 IgG 和 C 3沉积，IIF 可查得少数患者血清中有抗 BMZ 抗体。免疫电镜观察 IgG 和 C 3沉积在透明板和基底细胞膜下方，致密板真皮侧也有部分沉积。

3．妊娠疱疹（HerpesGestation, HG）该病为妊娠期发生的痛痒性大疱性皮肤病。皮损及外观正常皮肤 DIF 检查基底膜带有 C 3和 IgG 呈线状沉积，病人血中也可查到抗 BMZ 抗体。免疫电镜发现 IgG 和 C 3沉积在整个透明板内。

4．疱疹样皮炎（DermatitisHerpetiformis, DH）DH 是一种慢性良性复发性皮肤病。DIF 检查显示皮损和正常皮肤真皮乳头有 IgA 呈颗粒状沉着。血清中 IgA 抗肌内膜循环抗体及抗谷胶蛋白抗体。国内患者作此诊断应慎重，确诊需作 DIF 检查。

免疫电镜发现紧贴在基底膜板下方有 IgA 沉着，并与锚原纤维、微原纤维结合，部分 Ig 可沉积在基底膜下透明板内。

5．成人线状 IgA 大疱性皮病（Linear IgA Bullous Dermatosis of Adult, LADA）该病临床表现和组织病理改变类似疱疹样皮炎或大疱性类天疱疮，现已确定是一独立的疾病。DIF 检查示非皮损区基底膜带有线状 IgA 沉积，少数患者可查到循环 BMz IgA 抗体。免疫电镜观察 IgA 沉积于基板下区和 / 或透明板内。

6．儿童良性慢性大疱性皮病（BenignChronic Bullous Dermatosis of Childhood, BCBDC）

该病又称儿童型线状 IgA 大疱性皮肤病，其免疫病理变化与 LADA 相同，现倾向于认为 BCBDC 是 LADA 的儿童型，但尚有争论。

LADA 与大疱性类开疱疮和疱疹样皮炎相鉴别见表 17-1。

表 17-1 LADA 与 DH、BP 的鉴别

DHBPLADA免疫电镜（IEM）IgA 沉积于远离基板下真皮乳头区域IgG 和 C 3沉积于透明板内，基底细胞半桥粒表面IgA 沉积于基板下区和 / 或透明板内皮损周围皮肤 DIF真皮乳头颗粒状 IgA 沉积，BMZ 颗粒状沉积BMZ 为线状 IgG、C3沉积BMZ 均质线状 IgA 沉积，部分可有 C 3及其它型 Ig 沉积IIF无抗 BMZ 抗体大部分有抗 BMZ、IgG 型抗体部分有抗 BMZ 的 IgA 型抗体7．获得性大疱性表皮松解症（Epidermolysisbullosa Acquisits, EBA）现认为该症可能系自身免疫性疾病。DIF 检查 BMA 有 IgG 及 C 3呈线状沉积。IIF 检查血循环中有抗 BMZ 抗体。EBA 应注意与 BP 相鉴别，可用 IM 氯化钠液分离真表皮，以此作底物用 IIF 法检查 EBA 和 BP 病人的血清，EBA 病人的 BMZ 抗体沉积于真皮侧，而 BP 病人的 BMZ 抗体沉积于表皮侧。此外 EBA 与 BP 的鉴别还可通过电镜、免疫电镜及抗原分子量分析等进行，二者的区别见表 17-2。

表 17-2 EBA 与 BP 的区别

BPEBA电镜水疱位于基底膜的透明板水疱位于基底膜的透明板以下免疫电镜（IEM）免疫球蛋白沉积在透明板及基底细胞浆膜的半桥粒IgG 沉积于基底膜致密板及下方的锚状纤维IIF（1mol/l NaCl 分离皮肤为底物）大部分病人循环 BMZ 抗体阳性，IgG 位于表皮侧的基底膜部分病人的循环 BMZ 抗体阳性，IgG 沉积于真皮侧的基底膜抗原蛋白的分子量BP 主要抗原蛋白分子量为 230kD，次要抗原为 160kD，抗原存在于表皮浸出物中抗原蛋白分子量为 290kD，抗原存在于真皮浸出物中用 1mol/L NaCl 分离皮肤的基底层，其分离部位位于基底板上方，即基底板留在真皮侧，透明板附着在表皮侧。

二、狼疮带试验（LupusBand Test, LBT）狼疮带试验是检查系统性红斑狼疮（SLE）病人外观正常皮肤表皮真皮交界处免疫球蛋白沉积的一种试验，常用皮肤冰冻切片直接免疫荧光法检测。

1．

①必须要有免疫球蛋白沉积；②荧光图型规则：颗粒或线状；③荧光明亮。

2．特异性

（1）阳性率：如表 17- 3 所示。此外，人体不同部位“正常”皮肤阳性率不同：肩、三角肌部位 85%～90%，前臂和上臂伸侧 60%～70%，背、臂 50%～60%。我们检测重庆地区 SLE 病人上臂中段外侧 LBT 阳性率为 75% 左右。

表 17-3 LBT 阳性率

疾病皮疹部“正常”皮肤暴露部位隐蔽部位DLE>90%SLE>90%70%～80%50%混合性结缔组织78%50%33%（2）假阳性：较低，SLE 病人亲属和配偶，密切接触者可阳性，常为 IgM。

（3）假阴性：病程四个月以内者及治疗后（多为青年 SLE 病人）可阴性。

3．临床用途

（1）鉴别 SLE 和 DLE（盘状红斑狼疮）：DLE 和 LBT 阴性。

（2）鉴别 SLE 和其它 ANA 阳性疾病：其它 ANA 阳性疾病 LBT 常阴性。

（3）有助于判断病情和预后：病情严重者不仅沉积的 Ig 类别多，而且荧光强，有 IgG、IgA 沉积者比仅有 IgM 沉积者病情重，Ig 类别和荧光强度与肾病的关系尤为明显。

（4）可能有助于估价疗效。

第六节 免疫细胞化学技术在真皮纤维化性疾病研究中的应用真皮结缔组织由数量不多的细胞和丰富的细胞外基质组成。细胞成分包括成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞和少量淋巴细胞等。细胞外基质包括：①胶原：真皮中胶原纤维由 I 型和 II 型胶原构成，成熟真皮中 I 型胶原约占胶原的 85%，越年幼的皮肤含 III 型胶原的比例越高。②弹性蛋白。③非胶原糖蛋白：如纤维粘连蛋白。④蛋白聚糖：为氨基聚糖（亦称糖胺聚糖）与核心蛋白质构成的共价化合物。其中氨基聚糖可分为透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和硫酸乙酰肝素等。

真皮纤维化是以胶原为主的细胞外基质成分在真皮中过度积聚的结果。它既见于硬皮病等皮肤病中，还见于皮肤创伤愈合过程中发生的肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩中。现将免疫细胞化学技术在上述常见的真皮纤维化性疾病研究中的应用简介如下：

一、确定细胞外基质成分在真皮的分布利用各种细胞外基质的抗体，借助免疫细胞化学技术对细胞外基质在真皮中的分布进行定位，尚可经图像分析系统对染色强度等参数定量化，所获得数据经统计学处理能更准确地反映细胞外基质分布和含量上的量化差异程度。用 ABC 法显示，硬皮病真皮中 III 型胶原大量沉着，其分布方式与免疫电镜所见相符，即标记 III 型胶原抗体的细纤维大量聚积于真表皮交界处基底膜下；而在真皮深部，这种细纤维与标记 I 型胶原抗体的粗纤维相间分布，形成光镜下所见的粗大纤维束。纤维粘连蛋白也可大量沉积于硬皮病真皮深层胶原纤维束之间，但有些文献报道的结果并不一致。免疫荧光法显示，纤维粘连蛋白在肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩中量沉积，呈线状或卷曲排列，其分布符合组织学上所见结节 性结构的特点。近来用不同蛋白聚糖的单克隆抗体，借助 APAAP 法发现，肥厚性瘢痕组织中含有大量 4 - 或 6 - 硫酸软骨素，只有少量硫酸皮肤素。其中血管周围浸润的 T 淋巴细胞与 4 - 硫酸软髓素密切相关。

二、研究纤维化皮损中细胞的表型特征和（或）功能状态（一）成纤维细胞

1．合成功能活跃除了上述对已形成胶原的分布进行观察外，利用抗体 I 型前胶原氨基末端的单克隆抗体，可确定新合成未加工的 I 型前胶原。正常人皮肤显示了真表皮交界部 I 型前胶原的灶性沉着。而硬皮病皮损及其未受累皮肤中，真皮上部有连续广泛的 I 型胶原着色。这反映了硬皮病成纤维细胞活跃的合成功能。

2．HLA-II 类抗原的表达正常皮肤及正常瘢痕的成纤维细胞并不表达 HLA-II 类抗原。但在硬皮病、瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕中，可见许多表达 HLA-II 类抗原的成纤维细胞。由于 HLA-II 类抗原为递呈特定抗原触发免疫应答所必需，推测在上述疾病中，表达 HLA-II 类抗原的成纤维细胞参与了局部免疫反应。

3．细胞间粘连分子 1 型（ICAM-1）的表达硬皮病炎症期皮损中可见一些成纤维细胞样细胞上有 ICAM- 1 的表达。流式细胞仪检测发现，与正常成纤维细胞相比，体外培养的硬皮病成纤维细胞中高水平表达 ICAM- 1 的细胞比例增 ICAM- 1 与淋巴细胞功能相关抗原 1 型（LFA-1）是一对配体受体系统，它们可介导成纤维细胞与 T 细胞结合。高水平表达 ICAM- 1 的成纤维细胞可促使拥有 LFA- 1 的 MHC-II 类限制性 T 辅助细胞的活化。推测由此产生能促进成纤维细胞合成细胞外基质成分的细胞因子。

（二）肌纤维母细胞

在肥厚性瘢痕以及其它一些病理情况下，存着一种具有成纤维细胞和平滑肌细胞超微结构特征的细胞，即肌纤维母细胞。其起源尚不明确。利用不同细胞骨架蛋白（波形纤维蛋白、结蛋白、α- 平滑肌及 α - 横纹肌肌动蛋白、非肌性及平滑肌肌球蛋白）的抗体，对肌纤维母细胞的表型特征进行了研究，证实了异质性纤维母细胞群的存在。其一部分显示成纤维细胞的特征，而其余的则显示有不同程度的平滑肌分化的特征。

（三）单一核浸润细胞

在硬皮病、瘢痕疙瘩及肥厚性瘢痕中，常有不同程度单一核浸润细胞增加，弥散分布或位于血管周围。应用淋巴细胞和单核细胞的单克隆抗体检测发现，主要为 T 淋巴细胞和巨噬细胞。这些细胞可能通过释放某些与纤维有关的细胞因子而参与真皮纤维化的发生。此外还发现，硬皮病皮损中血管周围浸润细胞处有 ICAM- 1 和整合素（integin）β1和 β 2（细胞外基质在细胞表面的受体）的免疫染色强度增加。这些细胞粘连分子在淋巴细胞迁移、定位以及粘附在细胞外基质上起重要作用。

（四）内皮细胞和肥大细胞

硬皮病皮损中，内皮细胞上 ICAM- 1 和内皮细胞白细胞连分子 1 型（ELAM-1）免疫染色阳性。这两种分子的表达是内皮细胞活化的表现，它们可能与淋巴细胞附着在活化的内皮细胞上有关。硬皮病、瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕中，肥大细胞与纤维化也有密切关系。肥大细胞（MC）根据它所含中性蛋白酶的组成和含量可分为两型，一种含类胰蛋白酶（tryptase），而胃促胰酶（chymase）含量极少，即 MCT；另一种则含这两种酶，即 MCTC。应用这两种酶的单克隆抗体，对硬皮病皮损区 MC 的数量、表型和分布进行研究，结果提示 MC 参与了该病的发生。

三、检测与纤维发生有关的细胞因子转化生长因子 β（TGF-β）和血小板衍生的生长因子（PDGF）与纤维化发生密切相关。用免疫细胞化学技术，在硬皮病皮损中检出了 PDGF 及其 β 型受体和 TGF- β 的存在，在瘢痕疙瘩皮损中也检出了 TGF- β 的存在。

四、其它免疫荧光法是检测自身抗体的常用方法。系统性硬皮病患者血清中常存在多种自身抗体。在瘢痕疙瘩患者中也发现了抗成纤维细胞的抗核抗体。免疫荧光法还显示，瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕组织中 IgM、IgG 和 IgA 水平增高。瘢痕疙瘩与免疫的关系已引起注意并有待进一步研究。

第七节 真皮浸润细胞免疫表达一、T 淋巴细胞及其亚群的免疫表达CD3（OKT3，Leu4）对 T 细胞特异，正常或肿瘤性 B 细胞不表达 CD3；CD4RO（UCHL1）大多数 T 细胞和 T 细胞淋巴瘤呈阳性表达，能用于石蜡切片中。二者是常规筛选 T 细胞的良好标记物。成熟 T 细胞可分为表达 CD4（OKT4、Leu3a）T 辅助（TH/I）细胞、CD8（OKT8，Leu2a）T 抑制（TS/C）细胞二种亚群。

在炎症性皮肤病中，红斑狼疮可能与 T 淋巴细胞介导的细胞免疫有关，红斑狼疮皮损浸润细胞大多为 T 细胞，最初报告 T H、TS比率接近，有些报导浸润细胞多为 T H；也有 T S稍占优势者。大多数结果显示 T S细胞较正常增加，TH和 T S数较接近。因此 T S细胞可能与皮损的发病机制方面有关。在扁平苔藓中浸润细胞主要是 T 淋巴细胞，早期 T H细胞增加，而晚期，病程较长或未经治疗者 T S细胞升高，TH/TS比率下降。在银屑病、尖镜湿疣、异位性皮炎皮损中，真皮浸润细胞多为 T 淋巴细胞，以 T H为主，TS仅占少数，TH/TS比率显著增高。而银屑病、尖锐湿疣 T S为主。

皮肤 T 细胞淋巴瘤（CTCL）具有特征性临床表现和病理变化，免疫标记显示肿瘤细胞特异性表达 CD3，同时可表达 CD4和 CD8二种 T 细胞亚群标记。通常情况下肿瘤细胞以 T H细胞表型为主，TS仅占少数，如蕈样肉芽肿，Sezary 综合症等。由于病情的变化还可表现为 T H和 T S比率的改变呈 T S表型为主；某种 T 细胞标记的缺失，如 T S阴性；TH和 T S标记在不成熟的 T 细胞中共存，呈双标记；出现不成熟的细胞标记和一种新的标记，如 CD38；或不成熟细胞标记的肿瘤细胞数量增多。在诊断中 T 细胞标记物不能特异性区分正常和肿瘤性 T 细胞，在 T 或非 T 细胞性肿瘤中常出现许多反应性 T 细胞，而 T 细胞性肿瘤的组织形态可表现为多形性，在诊断阳性细胞是肿瘤性成为反应性 T 细胞会发生困难。由于 T 细胞性淋巴瘤有异常免疫表型，常缺失或不表达某一种 T 细胞亚群抗原，可用来鉴别肿瘤性与反应性 T 细胞亚群，但有时也不可能完全达到理想的诊断目的。

二、B 淋巴细胞和免疫球蛋白的表达CD19（B4）、CD20（B1）、CD22（Leu14）：三种抗体能检测前 B 细胞和 B 细胞的表面抗原，但不能检测浆细胞；L26：与大多数 B 淋巴细胞反应，特异性强并能用于石蜡切片。B 细胞在分化的大多数阶段表面有免疫球蛋白（SIg）分子，每个正常 B 细胞在分化的不同阶段或同一阶段上可产生几种不同类型的重链 IgM（μ）、IgD（δ）、IgG（γ）、IgA（α），B 细胞成熟为浆细胞则失去 SIg 出现胞浆内免疫球蛋白（CIg），但轻链都为同一型，κ 或 λ。SIg、CIg 和 κ、λ 可作为进一步免疫表型分析。在正常 B 细胞群体中轻链 κ 和 λ 比例为 2：1。在皮肤 B 细胞淋巴瘤（CBCL）中，不同的肿瘤细胞产生的 SIg 不同，每种 B 细胞可产生一种或两种重链，但只产生一种轻链，呈单克隆性。如在 SIg 中可见 IgM 和 / 或 IgG，以其中一种阳性为主，但只有一种轻链 κ 或 λ 阳性出现，或占绝对优势。在淋巴组织反应性增生时各种 B 淋巴细胞都增生，呈多克隆性，可产生两种轻链和一组重链。因此，Ig 能证实 B 细胞来源，并根据不同表达可作进一步分型。而用轻链的单一型标记可鉴别 CBCL 和淋巴组织反应性增生。

三、其它CD11b(OKM1)、CD14（OKM2）、CD15（LeuM1）：存在于单核细胞内；MAC387：能用于石蜡切片，单核巨噬细胞系统中许多细胞，如反应性组织细胞，上皮样细胞和巨细胞；肿瘤中浸润的巨噬细胞等均能表达 MAC387，如组织细胞性淋巴瘤中瘤细胞阳性。溶菌酶：存在于单核-巨噬细胞和粒细胞中的溶酶体酶。不存在于 B 或 T 细胞。可作为真性组织细胞性淋巴瘤的标记物，但需注意在以上标记物中，肿瘤中反应增生的组织细胞可呈阳性反应，因此在判别阳性细胞是肿瘤性组织细胞还是反应性细胞，需结合形态和其它标记物予以鉴别。

第八节 汗腺及汗腺肿瘤的免疫细胞化学特点目前已有多种 PcAb 和 McAb 用于汗腺及汗腺肿瘤的研究，这些不同的抗体对汗腺的不同部位有特异性反应，主要用于探讨汗腺肿瘤的组织发生，分化特点以及诊断及鉴别诊断。同时也可用于外科手术切除时，迅速判断肿瘤是否切除干净。现将不同的抗体分述如下。

1．癌胚抗原（CEA）出已证明在大小汗腺的腺体及导管部均有 CEA。在各种汗腺的良恶性肿瘤中也有不同的表达形式。CEA 在汗腺肿瘤导管样腔隙内及其附近染色最强，汗管瘤及多形性汗腺瘤通常含有丰富的 CEA，而实体性肿瘤，例如小汗腺孔瘤、螺旋腺瘤及圆柱瘤中则仅见稀疏灶状沉积，多种汗腺起源的恶性肿瘤中也见灶状 CEA 沉积，但 CEA 不能区别是起源于大汗腺或小汗腺。CEA 染色不仅可研究肿瘤的发生，还可用于显微镜下的外科手术，用以快速判断肿瘤组织是否切除干净。因 Paget 细胞也含有 CEA，因此也是鉴别 Paget 氏病的 Paget 细胞与皮肤原位癌中 Paget 样细胞以及恶性黑色素瘤中的 Paget 样瘤细胞的一种简单易行的方法。此外，CEA 也存在于胎儿的小汗腺中，因此，可作为汗腺分化的最早标志。

2．S-100 蛋白在皮肤病中，可用以检测 Schwann 氏细胞、皮肤神经黑色素细胞、痣细胞以及来源于这些细胞或组织的肿瘤。因此可用以区别梭形细胞恶性黑色素瘤与梭形细胞鳞状细胞癌以及恶性纤维组织胞瘤，用以鉴别神经来源的肿瘤与其他纤维性肿瘤，近来也有报告用 S -100 蛋白染早期麻风皮损中的神经组织，以了解神经的破坏，对麻风的早期诊断有一定的帮助。在小汗腺腺细胞及郎格罕氏细胞，S-100 也为阳性，但小汗腺导管及大汗腺则无 S -100。因此可以通过 S -100 染色了解汗腺肿瘤的起源，同时也有助于明确诊断。最近报告汗囊瘤中部分细胞 S -100 阳性，也说明这些肿瘤的组织发生与小汗腺中含有 S -100 蛋白的细胞有关。

3．角蛋白在大小汗腺的导管、腺体以及汗腺肿瘤中均有角蛋白存在。但对不同分子量的角蛋白则有不同的染色形式。近来报告，用识别分子量 56kD 的 Dako-CKl 及识别分子量 39、43 用 50kD 的 Cam5.2 二种抗体检测多种汗腺肿瘤，包括汗孔瘤、透明细胞汗腺瘤、螺旋腺瘤、皮肤混合瘤、圆柱瘤、生乳头汗管囊腺瘤及大小汗腺的汗囊瘤等，大多数肿瘤对这二种抗体呈阳性反应。也有用抗角蛋白抗体检测了多种小汗腺瘤的报告，结果所有的瘤均呈形式不同的呈阳性结果。但有些作者的结果表明汗管孔瘤、部分小汗腺孔瘤、螺旋腺瘤及大汗腺汗囊瘤等对抗角蛋白抗体 EKH5 呈阴性。

4．上皮膜抗原（EMA）文献报告大小汗腺的腺体部分在 EMA 抗原，而导管则无该抗原。某些汗腺来源的肿瘤对 EMA 也呈阳性反应，有报告 90% 的 Paget 氏病及乳腺导管癌 EMA 染色阳性。有人用 EMA 检测了多种小汗腺癌，包括小汗腺导管癌、透明细胞汗腺癌、乳头状汗腺癌、汗孔癌、腺样囊性癌、微囊性附件癌及小汗腺粘液腺癌等，结果均为阳性。

5．β2微球蛋白（β2MG）β2MG 在多种良恶性汗腺肿瘤中可有程度不同的阳性反应。文献报告大汗腺囊瘤、乳头汗腺瘤、透明细胞汗腺瘤、真皮内导管瘤、汗管瘤、螺旋腺瘤及圆柱瘤均为阳性。部分小汗腺癌也含有这种蛋白。

6．巨囊病液体蛋白（GCDEP）GCDEP 主要存在于大汗腺及大汗腺来源的多种肿瘤中，例如大汗腺汗囊瘤、乳头状汗腺瘤、生乳头汗管囊腺瘤、部分圆柱瘤及皮肤混合瘤中，也用于乳房及乳房外 Paget 氏病的检测。因此，GCDFP 可以用于区别大小汗腺分化，有助于了解汗腺肿瘤的组织发生以及诊断及鉴别诊断。

7．表皮生长因子（EGF）EGF 存在于汗腺的腺体及导管部。在某些汗腺肿瘤中也有不同的分布形式。可见于透明细胞汗腺瘤的管状上皮细胞、大汗腺混合瘤的管状及导管细胞的顶端部。

8．Peptidylarginine deiminase（PD）PD 见天大小汗腺的腺体及肌上皮细胞浆中，也存在于乳房外 Paget 细胞内。认为该酶可作为汗腺肿瘤分类的新的标志。

9．碳酸酐酶（CA）存在于大小汗腺的腺体细胞及导管上皮细胞。可见于皮肤混合瘤的管状、导管样及囊状结构的管腔细胞。

10．锌 α 2糖蛋白（An2GP）An2GP 主要存在于大汗腺体及导管部，部分见于小汗腺腺体，小汗腺导管则为阴性。在某些大汗腺肿瘤中多为阳性，例如大汗腺汗囊瘤及生乳头汗和囊腺瘤等。部分螺旋腺瘤及透明细胞汗腺瘤也含有这种蛋白。Zn2GP 染色对于了解某些汗腺肿瘤的组织发生及分类有一定的帮助。

11．乳液脂肪球蛋白（MFG）MFG 位于大小汗腺的腺体，而导管则无此蛋白，有报告 90% 的乳腺导管及乳房 Paget 氏病中 MFG 染色呈阳性反应，认为 MFG 染色有助于了解某些肿瘤的组织发生。

12．转铁蛋白（Ft）小汗腺导管外层细胞存在有 FT，而末端汗管及小汗腺腺体则无此蛋白。在某些汗腺肿瘤中 FT 也有不同的分布形式，可见于汗管瘤细胞条索的外层细胞，在末端汗管瘤及某些汗腺癌中可呈弥漫性分布。

总之，可用于汗腺及汗腺肿瘤标记的分子很多，除上述之外，其他例如抗唾液腺酶、抗 α—胰酶蛋白、抗大汗腺上皮抗原（AEA）等，对于了解汗腺肿瘤的起源及分类均有一定的帮助，但目前尚没有一种标记能区别良恶性肿瘤，或区别原发及转移性肿瘤，因此对于汗腺肿瘤的诊断，分类及组织发生，还要结合常规组织病理改变及临床特点等多方面因素进行综合考虑。

皮脂腺的免疫细胞化学特点。

目前可用于标记皮脂腺及皮脂腺肿瘤的抗体或酶有多种，包括角蛋白、EMA、MFG、CA 及 AEA 等，但没有一种标记是皮脂腺所特有的。β2MG 在皮脂腺痣、皮脂腺腺瘤及皮脂腺癌中也可呈阳性反应。近来报告皮脂腺癌中也存在 OKMS 抗原、虽然其性质仍不清楚，但 OKMS 染色有助于该病的诊断。

（孙建方 曾学思 刘季和）

参考文献1．郭定九易凡，译. 皮肤免疫病理学.1980 年, 长沙

2.SerreG, Viocent C , et al. Natural IgM and Igg autoantibodies to epidermal keratinsin normal human sera：I ELISA titration immunofluorecence study. J Invest Dermatol, 1987, 88：21～27

3. 王刚, 等. 抗角蛋白自身抗体的研究进展．国外医学(皮肤病学分册),1982,18(2)：74

4. 聂祝湘, 等. 天疱疮抗体及其临床意义. 临床皮肤病科杂志,1991,20(6)：317～319

5. 聂祝湘, 等. 天疱疮治疗的某些进展. 国外医学(皮肤病学分册),1991, 17(5)：265～268

6.ThompsonC, et al. Expression of blood group antigen by cultured human epidermal cells.J Invest Dermatol, 1986, 86：394～398

7.jANdBos. sis . keratinocyte p 75, CTC Press, Inc . Florida AM, 1989

8. 白兆霞, 等. 尖锐湿疣病损的免疫组化研究. 中华皮肤科杂志,1992, 25：247

9. 赵玉铭, 等.HLA 抗原在正常皮肤中的分布. 中华皮肤科杂志,1991, 23(6)：402

10. VanLis JM , et al. Cin- Areaction with plasma membrane in human epidermsi. Am JClin Pathol, 1983, 779(1)：143～4

11.Hashimoto K, etal. A Lectin – binding glyciprotein of Mr 135000 associated withbasal keratinocyte in pig epidermis. Biochem J, 1986,237(2)：405～414

12. 唐书谦, 等. 不同底物对大疱性皮肤病间接免疫荧光的评价评价. 中华皮肤科杂志,1988,22(1)：36

13. 刘荣卿, 等. 天疱疮及大疱性类天疱疮外观正常皮肤的免疫荧光检查. 中华皮肤科杂志,1987,20：138

14. 聂祝湘, 等. 止血芳酸治疗天疱疮的实验观察. 中华皮肤科杂志,1992, 25(4)：256～258

15. WickMR and Scheithauer. Primary neuroendocrine carcinoma of the skin. In：Pathology oof Unsual MalignantCutaneous Tumors. Wick MR ed. Ne W Yorh. Marcel Dekker INC, 1985. 107

16.Narisawa Y, Hashimoto K, Bayless T, et al. Cytokeratin polypeptide Profile ofmerkel cells in human fetal and adult skin：difference of expression of cytokeratins inepidermal and dermal merkle cells. j Invest Dermatol, 1992, 98：171

17.Narisawa Y , Hashimoto K, Nihei Y, et al. Biological significance of dermalmerkle cells in development of cutaneous nerves in human fetal skin. J HistchemCytochem, 1992；40：65

18. 刘荣卿唐书谦徐洁芳, 等. 天疱疮及大疱性类天疱疮外观正常皮肤的免疫荧光检查. 中华皮肤科杂志,1987,20(3)：138～140

19. 刁庆春刘荣卿唐书谦. 天疱疮、类天疱疮自身抗体检测的临床意义。中华皮肤科杂志，1988，21（5）：283

20．朱学骏 niimi YJ Bystryn JC. 大疱性类天疱疮抗原分子异质性。中华皮肤科杂志，1990，23：291～293

21．靳培英是元甫。疱疹样皮炎在我国的发病情况及其诊断标准的商榷. 中华皮肤科杂志,1991,24(4)：232～235

22．Prost G, et al. Diagnosis of adultlinear IgA dermatosis by immuno ╟ electromicroscopy in 16 patients withlinear IgA deposits. J Invest Dermatol,1989, 92(1)：39～45

23.wojnarowska F, Marsden RA, Bhogal B, et al. Chronic bullous disease ofchildhood, childhood cicatricial pemphigoif, and linear Iga disease of adults.A comparative study demonsrating clinical and immunopathologic overlap. J AmAcad Dermatol, 1988, 19(5)：792～805

24. 朱学骏 Niimi YJ Bystryn JC. 抗基底膜带抗体阳性血清患者中获得性大疱性表皮松解症的发生率. 临床皮肤科杂志,1990,19(4)：170～173

25.Akutsu Y and Jimbow K. Immunoelectron microscopic demonstration of humanmelanosome associated antigens (HMSA) on melanoma cells：Comparison with tyrosinasedistribution. J Invest Dermatol, 1988, 90：179

26.NakanishiT and Hashimoto K. The differential reactive of benign and malignantnevomelanecytic lesions with mouse monoclonal antibody TNKH1. Cancer, 1987, 50：1340

27. ImamA, Mitchell MS, Modlin RL, et al. Human monoclonal antibodies that distinguishcutaneous malignant melanomas form benign nevi in fixed Tissue sections. JInvest Dermatol, 1986, 86：145

28. GownAM, Vogel AM, Hoak M , et al. Monoclonan antibodies specific for melanocytictumors distinguish subpopulations of melanocytes. Am j Pathol, 1986, 123：195

29.Schaumburg – Lever G, Metzler G, Kaiserling E.Ultrastructural localization ofHMB –45 binding sites. J Cutan Pathol, 1991,18：432

30. 天高文叶庆佾刘荣卿. 异常黑素小体在恶性黑素瘤诊断中的意义. 第三军医大学学报,1992,14(4)：323

31.Furukawa K and Lloyd KO. Gangliosides in melanoma. IN：Human Melanoma. From Basicresearch to dinical application. Ferrone S ed. New York Springer –Verlag, 1990：15

32.Taniguchi M, Kuwabara I, Harada Y, et al. Cross ╟ species melanoma antigen. 1990.

33.Werkmeister JA, Triglia T, Mackay IR, et al. Fluctuations in the expression ofa glyolipid antigen assocted with differentiation of melanoma cells monitoredby a monoclonal antibody , Leo Me13. Cancer Res, 1987,47：225

34. 田芳金伯泉黄传书, 等. 抗人黑素瘤单克隆抗体免疫组化的研究. 单克隆抗体通迅,1991,7：21

35. EstinCD, Plowman CD, Rose TM, et al. Characterization of P97, a humanmelanoma -associated antigen, and development of a recombinant vaccien formelanoma. In：Human Melanoma. From basic research to clinical application . FerroneSed. New York. Springer –Verlag, 1990.87

36. 高天文刘荣卿叶庆佾. 无色素性恶性黑素瘤免疫组化诊断研究. 中华皮肤科杂志,1992, 25：222

37. 刘荣卿高天文. 无色素性恶性黑素瘤的诊断探讨. 实用肿瘤杂志,1992,7：152

38.NagataH, Ueki H, Moriguchi T, et al. Fibronectin,localization in normal human skin,granulation tissue, hypertropic scar, maure scar, progressive systemicsclerotic skin, and other fibrosing dermatoses. Arch Dermatol, 1985, 121(8)：995～999

39.Linares HA. Protroglycan – lymphocyte association in the development ofhypertrophic scars. Burns, 1990, 16(1)：21～24

40.Branchet MC, Boisnic S, Bletry O, et al. Exxpression of HLA class II antigensonskin fibroblasts in scleroderma. Br J Dermatol, 1992,12(5)：431～435

41.CastagnoliC, Stella M, Magliacani G, et al. Anomalous expression of HLA class IImolecules on kerattinocytes and fibroblasts in hypdrtropgicscars consequent tothermal injury. Clin Exp Immunol, 1990, 82(2)：350～354

42.Needleman BW, Increased expression of intercellular adhesion molecule 1 on thefibroblasts of scleroderma patientl. Arthritis Rheum,1990, 33(12)：1847～1851

43.Skalli U, Schurch W, Seemayer T, et al. Myofibrollasts from diverse pathologicsetting are heterogeneous in their content of actin isoforms and intermediatefilament proteins. Lab Invest, 1989, 60(2)：275

44.Sollberg S, Peltonen J, Uitto J, et al. Elevated expressoin of β2and β2integrins, intercellularadhesion molecule 1, and endothelial leukocyte adhesion molecule 1 in the skinof patients with sysytemic sclerosis of recent onset .Arthritis Rheum, 1992；35(3)：290～298

45. GayS, Jones RE, Huang GQ, et al. Immunohistologic demonstration of platelet -derives growth factor and sis – oncogene expression in scleroderma. J InvestDermatol, 1989, 92(2)：301～303

46.Klareskog L, Gustafsson R, Scheynius A, et al. Increased expression of platelet– derives growth factor type B receptors in the skin of patients with systemicsclerosis. Arthritis Rheum, 1990, 94(2)：197～203

47.Gruschwitz M, Muller PU, Sepp N, et al. Transcription and expression oftransforming growth factor type beta in the skin of progressive systemicsclerosis：amediator of fibrosis? J Invest Dermatol, 1990, 94(2)：197～203

48.Peltonen J, Hsiao LL, Jaakkola S, et al. Activation of collagengene expressionin keloids：colocalization of type I and IV collagen and transforming growth factor–β1mRNA.J Invest Dermatol, 1991；97(2)：240～248

49.TraniAMA, Gruber BL, Kaufman LD, et al. Mast cell changes in scleroderma. ArthritisRheum, 1992；35(8)：933～939

50.Hashimoto K, et al. Anti – keratin monoclonal antibodies：production, specificities andapplications. J Cutan Pathol, 1983；6(10)：529～539

51.KallioinenM, et al. β-2-microglobulin in benign and malignant adnexal skin tumors andmetastasizing basocellular carcinoma. J Cutan Pathol, 1984；1(11)：27～34

52.Penney NS. Immunohistochemistry of adnexal neoplasms. j Cutan Pathol , 1984；(11)：357～364

53.SwansonPE, et al. Eccrine sweat gland carcarcinoma：an histologic and immunohistochemical studyof 32 cases. J Cutan Pathol,1987,2(4)：65～86

54. NodaY, et al. Immunohistochemical study of carbonic anhydrase in mixed tumors andadenomas of sweat and sebaceous glands. J Cutan Pathol, 1987；5(14)：285～290

55.NodaY,et al. Immunohistochemical localization by monoclonal antibody of humanepidermal growth factor in mixed tumors of the skin. J Cutan Pathol, 1987；6(14)：337～342

56. ZukJA, et al. Immunohistochemistry staining patterns of sweat glands and theirneoplasms using two nomoclonal antibodies to keratieos. j Cutan Pathol, 1988；1(15)：8～17

57.MazoujianG, et al. Immunohistochemistry of gross disease fluid protein (GCDFP-15) in 65benign sweat gland tumors of the skin. Am j Dermatopathol, 1988, 1(10)：28～35

58. WoodWS, et al. Mammary Paget’s disease and intraductal carcinoma：histologic, histologic,histochemical and immunocytochemical comparison. Am j Dermatopathol, 1988,10(3)：188

59.Mihara M. Chondroid syringoma associated with hidrocystoma – like changes：possible differentiation intoeccring gland：a histologic. immunohistochemical and electron microscopic study. JCutan Pathol, 1989, 5(16)：281～286

60.Penneys NS, et al. Immunohistochemistry demonstration of ferritin in sweatgland and sweat gland neoplasms. J Cutan Pathol, 1990, 1(17)：32～36

61. UranoY, et al. Immunohistochemistry demonstration of petidylarginine deiminase inhuman sweat glands. Am J Dermatopathol, 1990；12(3)：249～255

62.Mazoujian G. Immunohistochemistry of GCDFP –24 and zinic alpha2 glycoprotein inbenign sweat gland tumors. Am J Dermatopathol,1990, 12(5)：452～457

第十八章 核酸分子杂交技术概述第一节 核酸的分子结构一、核酸的化学组成组成核酸的元素有 C、H、O、N、P 等，其中 N 含量约为 15%～16%，磷含量为 9%～10%。由于核酸分子中的磷含量比较恒定，因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定磷含量代表核酸量。

核酸经水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本单位，核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多核苷酸，核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可进一步水解，产生戊糖和含氮碱。因此，核酸是由含氮碱、戊糖及磷酸三种成分组成。

含氮碱（简称碱基）：核酸中的含氮碱简称碱基，是嘌呤碱（purine）与嘧啶碱（pyrimidine）的衍生物。RNA 和 DNA 含有的共同碱基成分是腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）和胞嘧啶（cytosine, C）。二者的区别是 RNA 含有尿嘧啶（uracil,U），而 DNA 含有胸腺嘧啶（thymine,T）。嘌呤和嘧啶都有酮 - 烯醇式互变异构现象，一般生理 pH 条件下呈酮式。它们的结构如下：

有些核酸中含有修饰碱基（或稀有碱基），这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。例如有些 DNA 分子中含有 5 - 甲基胞嘧啶（m5C），5- 羟甲基胞嘧啶（hm5C）。某些 RNA 分子中含有 1 - 甲基腺嘌呤（m1A）、2，2- 二甲基鸟嘌呤（m22G）和 5，6- 二氢尿嘧啶（DHU）等。

嘌呤碱和嘧啶碱一般多不易溶于水，对 250～280nm 波长的紫外光有较强的吸收，但对 260nm 光波的吸收能力最大。由于碱基是核酸的基本组成成分，因此，所有的核酸（包括 DNA 和 RNA）其共同特点是对 260nm 处的紫外光有最大的吸收值。

核酸分子中碱基的克分子数与磷的克原子数相等，所以可根据核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值来测定核酸量。一般以每升核酸溶液中含 1g 磷原子为标准来计算核酸的吸光率，这称为克原子磷吸光率或克原子磷消光系数 [ε（p）],ε(p) 的计算式为：

ε（p）=A/Cl

A 为吸光度（光密度），1 为比色杯内径，通常为 1.0cm；C 为每升核酸溶液中磷的克原子数。

C= 每升溶液中磷重（wg）/30.98ε(p)=30.98A/wl

一般 DNA 的 ε（p）=6000～8000;RNA 为 7000～10000

现将 DNA 和 RNA 的化学组成归纳如表 18-1：

表 18-1

RNADNA嘌呤碱腺嘌呤鸟嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤嘧啶碱胞嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶（或 5 - 甲基胞嘧啶）戊糖核糖脱氧核糖磷酸磷酸磷酸二、核酸的一级结构核酸又称多核苷酸，组成 DNA 的脱氧核糖核苷酸主要为四种，即 dAMP、dGMP、dCMP 及 dTMP；组成 RNA 的核糖核苷酸主要有 AMP、GMP、CMP 及 UMP 四种。对两种核酸的组成可简写如下：

DNA=（碱基 - 脱氧核糖 - 磷酸）n；RNA=（碱基 - 核糖 - 磷酸）n

核酸中核苷酸的连接方式为：一个核苷核 C -3’上羟基与下一个核苷核酸 C -5’连接在磷酸羟基脱水缩合成酯键，称酯键称 3’5’磷酸二酯键，若干个核苷酸间依 3’5’磷酸二酯键连接成长链的大分子即为核酸。此长链称多核苷酸链，在链的一核苷酸，其 C -5’连接的磷酸只一个酯键，称此核苷酸为链的 5’磷酸未端或 5’。链的另一端核苷酸上 C -3’上羟基是自由的，对此核苷酸称为 3’羟基末端或 3’端，链内的核苷酸在 C -5’上磷酸已形成二酯键，C-3’上羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。

核酸的一级结构乃指其核苷酸链中核苷酸的排列顺序，由于核酸中核苷酸彼此之间的差别乃在于碱基部分，故核酸的一级结构即指核酸分子中碱基的排列顺序。

对核酸一级结构的描述为：将 5’磷酸末端书于左侧，中间部分为核苷酸残基，3’羟基末端书于右侧。通常用竖线表示核糖，碱基标于竖线上端，竖线间有含 P 的斜线，代表 3’,5’磷酸二酯键。此表示法及简化式如下：

三、核酸的高级结构核酸的多核苷酸链在次级键的基础上，还可形成更为复杂的二级及三级的高级结构。

（一）DNA1．二级结构 1953 年 Watson 及 Crick 在化学分析及 X 光衍射法观察 DNA 结构的基础上提出了著名的 DNA 双螺旋结构模型（double helix model）此结构是在核酸一级结构基础上形成的更为复杂的高级结构，即 DNA 的二级结构，结构如图 18-1。

图 18-1 DNA 的双螺旋结构

P：磷酸基；S：脱氧核糖；G：鸟嘌呤；

A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶 C：胞嘧啶

DNA 的二级结构即双螺旋结构，其内容可归纳为：

（1）DNA 分子为二条多核苷酸链以一共同轴为中心，盘绕成右手双螺旋结构。螺旋直径 2nm。螺旋盘绕形成链间的两种沟，即宽的大沟与狭窄的小沟。

（2）二条多核苷酸链的走向相反，通常取左侧链从上到下为 5’→3’端，右则链从下向上为 5’→3’端，这样二条链构成反平行排列的双螺旋。

（3）二条多核苷酸链借氢键而连系在一起。氢键乃一链碱基上 -NH2的氢与另一链上碱基的氧或氮形成。碱基有二个氢键，G 与 C 之间有三个氢键（图 18-3）。这种相配关系称为碱基互补或碱基配对。配对的碱基处于同一平面，此平面与双螺旋的中心轴垂直，由于二条链中碱基互补，所以二链彼此又称为互补链。

（4）碱基对之间氢键的能量为 3～7kcal/mol，由于氢键多，所以可维系 DNA 双链结构。另外碱基对彼此间距离为 0.34nm, 每一螺旋含 10 个碱基对，故螺距为 3.4nm，相邻碱基对间彼此尚有范德瓦士（van der Waals）力作用（此力量为 1～2kcal/mol, 作用范围为 0.5nm），能量虽弱但由于碱基对多，合力也就大。可见碱基对的氢键及碱基对之间的范德瓦士力是稳定 DNA 成双螺旋结构的主要能量。

上述 DNA 的双螺旋结构是溶液及活体中常见的形式，通称 B 型。当 B 型所处条件的湿度低于 75% 时，可转变为 A 型。A 型的碱基对不垂直于双螺旋的轴、倾斜约 20 度，螺距降为 2.8nm，每一螺旋含 11 个碱基对。B 型与 A 型的水合程度不同，它们是 DNA 分子在天然条件下的两种基本形式。除 A、B 型外尚发出有 C 型双螺旋，似 B 型，螺距 3.3nm，第一螺旋含 9 个碱基对。

DNA 双螺旋结构阐明的量重要意义在于第一次提出了遗传信息是以 DNA 分子中核苷酸的排列顺序为储存方式，从而说明了天然遗传信息的复制过程。

2．三级结构已发现线粒体、叶绿体、细菌、质粒及一些病毒的 DNA 双螺旋分子尚可形成封闭环状，天然状态的环状 DNA 分子多扭曲成麻花状的超螺旋结构（superhelix），这些比螺旋更为复杂的结构即 DNA 分子的三级结构。

真核生理细胞核中的 DNA 具有一种超螺旋结构，即 DNA 双螺旋盘绕在组蛋白上形成核小体（nucleosome）。核小体是染色质（chromatin）的核心小粒，由有 140 个碱基对的双螺旋 DNA 缠绕于由组蛋白（H2A、H2B、H3 及 H4 各二分子）组成的八聚体外面，这一 DNA 股由此形成直径为 9nm 的超螺旋 1.75 圈。此核小体又经 60 个碱基对的 DNA 双螺旋及组蛋白 H1 形成细丝（间隔区）与下一个核小体相连接。

核小体的 DNA 双螺旋为 200 个碱基对，长度应为 0.34nm×200=68nm，但实际长度只 10nm，说明 DNA 双螺旋链进一步螺旋化盘绕在组蛋白八聚体上，其长度压缩了 7 /8。每 6 个核小体又绕成一圈形成螺线管，外径为 30nm，螺距为 10nm。这样 DNA 分子长度被压缩了 6 /7。120 个螺线管又盘绕成直径为 400nm，高为 30nm 的超螺线管，DNA 分子长度又被压缩了 40/41，此超螺线管即染色体的单位纤维（unit fiber），长 20～60nm。从单位纤维形成染色单体（chromatid），实际长度为 2～10nm，DNA 分子长度又被压缩了 5 /6～6/7。这样从许多核小体组成的串珠样纤维经多层次螺旋化结构到形成染色单体，DNA 分子的长度已被压缩至近 1 /10000。

（二）RNARNA 分子也是由核苷酸依 3’,5’磷酸二酯键形成的多核苷酸链。RNA 总是以单链的形式存在，也有 5’磷末端及 3’羟基末端。RNA 单链的局部折叠成的某一片段的 A 及 G 分别与另一片段的 U 及 C 配对常形成发夹结构（hairpin structure）。在此结构内的碱基无需全部配对，而配对部位形成小的双螺旋区域，不能配对的碱基则连成小环从螺旋区中被圈出来。这种 RNA 单链局部小双螺旋结构即是 RNA 的二级结构。

四、基本组织由于 DNA 分子中核苷酸序列分析以及一级结构与功能相关的研究，使得人们有可能进一步了解 DNA 一级结构与基因组织的关系。已经证实，自然界极大多数生物体遗传信息贮存在 DNA 的核苷酸排列顺序中，因此，基因是 DNA 的一个片段，只有少数病毒的遗传信息贮存在 RNA 分子中。DNA 分子中不同区域有不同功能，有些区域可编码蛋白质（最终产物是蛋白质），有些区域可编码 RNA（最终产物是 tRNA 和 rRNA），有些序列则与调控有关。那么一个 DNA 分子能携带多少基因呢？如果以平均 1000 个碱基对可编码一个 3kD 的蛋白质计算，猴病毒（SV40）DNA 分子量为 3.0×105，有 5000 碱基对可编码 5 种蛋白质。人染色体 DNA 有 2.3×109碱基对，可编码 200 万以上的基因，但实际上，最多可编码基因数为 2～3 万。这是由于真核细胞 DNA 分子除编码蛋白质和 RNA 等结构基因外，有相当部分 DNA 顺序属于非编码区，而原核细胞 DNA 由于分子较小，必需充分利用有限的核苷酸序列。各种生物体内 DNA 分子的大小见表 18-2。

表 18-2 各种生物体内 DNA 分子的大小

来源分子量碱基对数目长度噬菌体фX1740.6μm腺病毒（SV40）1.6×10645001.5μm鼠线粒体3.0×106140004.9μm噬菌体 λ 9.5×1065000017μm噬菌体 T 2或 T 43.3×10720000067μm大肠杆菌染色体1.3×10845000001.5μm人染色体3.0×1091250000004.1μm1. 真核生物的基因组织根据某一段核苷酸顺序在整个 DNA 分子中出现的频率不同可分为以下几种：

（1）单拷贝顺序（singlecopy sequence）：在整个 DNA 分子中只出现一次或少数几次，主要是编码蛋白质的结构基因。除组蛋白、角蛋白和肌动蛋白以外，几乎所有的蛋白质基因都是单拷贝顺序，平均为 1000 碱基对。单拷贝基因在整个基因组织中所占比例最高。在人的细胞中约占 DNA 含量的一半。

（2）中等重复顺序（moderatelyrepetitive sequences）：有些基因如核蛋白体 RNA 基因、tRNA 基因、组蛋白基因等在 DNA 分子中可重复出现几十到几千次，约占人细胞 DNA 含量的 30～40%。以 rRNA 为例，在大肠杆菌中重复频率为 7 而果蝇中可重复千次。可见真核细胞中重复顺序比原核细胞高得多。

（3）高重复顺序（highlyrepetitive sequences）：可重复几百万次。往往是简单的重复顺序，如蟹的 T -A-T-A-T-A-T。也有的较长如非洲绿猴 DNA 是以 172 个碱基对的顺序为基础重复几万次。高重复顺序一般位于异染色质上，多数不编码蛋白质或 RNA，其功能还不太清楚，主要是起间隔作用，可能与调控有关。

在重复顺序中还有一种反转重复顺序（inverted repetitivesequences）。其特点是一段碱基呈现回文结构，即一条单链回折即可形成互补的双链，故称为回文结构（palindromicstructure）或发夹结构（hairpin structure）。这种结构对基因的复制与转录可能具有调节 控制功能。

真核细胞中单拷贝顺序和重复顺序常常是中间隔排列的。不仅如此，在一个基因内部往往被一个或几个额外的顺序分割成若干片段，这种插入到基因内部的顺序称为插入顺序或内含子（intron）。内含子是不编码的顺序，而编码的碱基顺序则称为外显子（exon）。插入顺序是真核细胞 DNA 最主要的特征。

真核生物由于存在着较多的重复顺序、特殊的插入顺序以及控制区和其它多余顺序，使得 DNA 总长度往往大于编码的结构基因，因此，实际基因数往往小于 DNA 分子。

2．原核生物的基因组织原核生物 DNA 分子较小，基因组织也较简单，一般具有以下特点：

（1）DNA 分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码部分（又称间隔区）通常包含控制基因表达的顺序。例如，噬菌体фX174 中只有 5% 是非编码区。

（2）功能相关的基因常常串联在一起，并转录在同一个 mRNA 分子中，称为多顺序反子。这种现象在真核生物中是很少见的。

（3）基因重叠：例如фX174 的 E 基因全部包括在 D 基因内，B 基因则包括在查基因内。这种现象主要发现在病理 DNA 分子中，可能是由于 DNA 分子太小又要装入相当量的基因的缘故。

第二节 DNA 的变性与复性一、DNA 变性DNA 变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），称为 DNA 变性。加热、改变 DNA 溶液的 pH、或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素的影响，均可使 DNA 变性。

通常，可利用 DNA 变性后波长 260nm 处紫外吸收的变化追踪变性过程。因为 DNA 在 260nm 处有最大吸收值这一特征是由于含有碱基组成的缘故，在 DNA 双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm 紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。见图 18-2。

图 18-2 DNA 的增色反应

如果升高温度使 DNA 变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线（见图 18-3），由图可见当温度升高到一定范围时，DNA 溶液在 260nm 处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。由此说明 DNA 变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。从而也说明当达到一定温度时，DNA 双螺旋几乎是同时解开的。通常人们把 50%DNA 分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature, Tm）。因此 Tm 是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

图 18-3 DNA 的 Tm 值

综上所述，Tm 值和增色效应是目前描述 DNA 特性所常用的两个量。假定一个 DNA 大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后消光系数上升 30% 以上；如果 DNA 原先局部就处于单链状态（例如在分子末端），则变性后上升较少。增色效应的大小是 DNA 性质的一个简单指标，与分子量无关。Tm 不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH、离子强度和 DNA 的碱基比例。随着溶剂内离子强度上升，Tm 值也随着增大。在某一离子强度（～10-3M）以下，无需加热就使溶于其中的 DNA 出现不可逆变性。与 A - T 碱基配对比较，DNA 双螺旋内的 G - C 配对更为牢固。在相同条件下，DNA 内 G - C 配对含量高，其 Tm 值也高。

假定在一个双链 DNA 分子内某些片段含有较多 G - C 碱基对，根据它们局部 Tm 值差，用电子显微镜就可以观察和测量到这些片段，如在 DNA 某一片段内含有较多的 A - T 碱基对，在某一个温度时就可能出现双链解离的现象。但在同一温度下，含 G - C 对较多部分仍然保持双链结构。这是一种非常有用的技术。

DNA 的 Tm 值与以下因素有关：

（1）DNA 的均一性：均一 DNA 如病毒 DNA，解链发生在很窄的范围内，而不均一的 DNA 如动物细胞 NDA 其 Tm 值的范围则较宽。

（2）DNA 分子中（G+C）的含量：一定条件下 DNA 的 Tm 值，由 G + C 含量所决定，因为 G + C 之间有 3 个氢链，因此 G + C 含量较高的 DNA，Tm 值较高，二者的关系可用以下经验式表示：

%（G+C）=（Tm-63.0）×2.44

实验表明 DNA 分子中（G+C）克分子含量百分比的大小与 Tm 值的高低呈直线关系，见图 18-4。

图 18-4 DNA 和 Tm 值与 G - C 含量的关系

（3）溶剂的性质：Tm 不仅与 DNA 本身性质有关，而且与溶液的条件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm 值较低，融点范围也较宽，离子强度增高时，Tm 值长高，融点范围也变窄。因此，DNA 制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在 1mol/l NaCl 溶液中较稳定。

二、复性变性 DNA 只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。通常 DNA 热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比 Tm 低 25～30℃左右时，变性后的单链 DNA 即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。复性后的 DNA，理化性质都能得到恢复。倘若 DNA 热变后快速冷却，则不能复性（图 18-5）。

图 18-5 热变性过程和两种冷却过程示意图

影响复性速度的因素很多，同样条件下，DNA 顺序简单的分子复性很快，如 polyd[T]和 polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的 DNA 分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解 DNA 顺序的复杂性。DNA 片段的大小也影响变性的速率，因为 DNA 片段愈大，扩散速度愈低，使 DNA 片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将 DNA 切成小片段，再进行复性。同样条件下，同一种 DNA 浓度愈高，复性速度也愈快。溶液的离子强度对复性速度也有影响，通常盐浓度较高时，复性速度较快。

Doty 研究小组是最早对 DNA 变性过程进行深入研究的。它们所获得的结果表明，在达到 Tm 值时，两条 DNA 单链分离开。如果在加热之后慢慢地冷却，则出现部分复性，即 DNA 的一部分回复到双螺旋结构。复性的程度取决于 DNA 浓度及信息含量的多少。病毒 DNA（信息含量少）比哺乳动物 DNA 容易复性，而 DNA 浓度较高时，有利于复性，快速冷却使 DNA 仍然处于变性状态，这时自由单链成链线团结构。对这种情况，人们称之为螺旋 - 线团转化过程（helix-coil-transition）。快速冷却时消光系数固然有所下降，但比天然 DNA 的数值始终要大。

细胞核 DNA 复性的动力学研究指出，DNA 内很少片段有重复的或很相似的碱基顺序（所谓重复 DNA）。DNA 复性的程度和过程与其信息含量的多少等有关；因而病毒 DNA 比细菌 DNA 复性得快。Britten 发现一种测定和观察复性过程的方法。X 轴表示变性 DNA 原始浓度（Co）和保温时间的乘积，纵轴表示 DNA 复性部分（重新作为双螺旋结构出现）。DNA 比例可以用羟基磷灰石柱的办法加以确定，因为这种柱能够使单链和双链 DNA 分离开来。DNA 复性曲线呈 S 形，随着信息含量增加，此形状相同曲线往往较高 Co.t 值处移动。奇怪的是，从细胞核来的 DNA 在复性时显示出完全不同的情形：这些 DNA 中的一部分异常快地复性，而另一些 DNA 只有在极高的 Co.t 值时才出现预期的复性。对快速复性可以作这样的解释，即在某一 DNA 之内同时有几个相同或很类似的顺序存在，因而找重复顺序比找 DNA 内唯一顺序要快得多。后者含有特殊的遗传信息，常被称为独特 DNA。与之相反是重复 DNA 片段。

真核 DNA 自发复性的一种特殊途径是通过发夹结构。对单链而言，要生成这种发夹结构，要求一种特定的碱基顺序，这种顺序称作回文（正读反读都相同）结构。为了构成回文结构，DNA 片段的碱基顺序必须在互补链内找到相反的顺序；在具有相反碱基顺序的两个 DNA 片段之间，显然常常出现短的中间片段由于存在这样的核苷酸顺序，在复性时就能形成发夹结构。

如果存在很多重复回文结构，在部分复性时就能通过形成 DNA 侧链而出现十字结构。DNA 回文结构使 DNA 片段出现回旋对称性。这种结构常常出现在 DNA 和蛋白质之间相互作用的地方，特别是后者起控制作用时。

第三节 分子杂交一、概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA 与 DNA、RNA 与 RNA 或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于 DNA 一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链 DNA 分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高 pH 值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。

核酸杂交技术基本上是 Hall 等 1961 年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton 等 1962 年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为 DNA- 琼脂技术。变性 DNA 固定在琼脂中，DNA 不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短 DAN 或 RNA 分子与胶中 DNA 杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。60 年代末，Britten 等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中 DNA 的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离 DNA，用水压器剪切成长约 450 核苷酸（nt）的片段。剪切的 DNA 液（含 0.12mol/ L 磷酸盐缓冲液或 0.18mol/l Na+），经煮沸使 dsDNA 热变性成 ssDNA。然后冷至约 60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的 UV260nm 的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。通常该实验可比较不同来源生物 DNA 的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。

60 年代中期 Nygaard 等的研究为应用标记 DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的 DNA 序列奠定了基础。如 Brown 等应用这一技术评估了爪蟾 rRNA 基因的拷贝数。RNA 在代谢过程中被 3H 尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组 DNA 杂交，继而用 RNase 处理，消化非特异性结合的 RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量 DNA 杂交的 RNA 量即可评估 rRNA 基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。

进入 70 年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如，对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的 Poly U –Sepharose 和寡（dT）- 纤维素使人们能从总 RNA 中分离 PolyA+ RNA。用 mRNA 的经纯化技术可从网织红细胞总 RNA 中制备 α - 和 β - 珠蛋白 mRNA 混合物。这些珠蛋白 mRNA 首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备 cDNA 探针很繁琐，所获得 cDNA 的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。

70 年代末期到 80 年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体 DAN 载体的构建，使特异性 DNA 探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组 DNA 文库和 cDNA 文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针 DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异 DNA 探针。

由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备 18～100 个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和 Southern 印迹技术，用数微克 DNA 就可分析特异基因。特异 DNA 或 RNA 序列的量和大小均可用 Southern 印迹和 Northern 印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。

尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使 DNA 探针实验做到简便、快速、低廉和安全。

二、探针 - 靶反应从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。抗原 - 抗体、外源凝集素 - 碳水化合物、亲和素 - 生物素、受体 - 配基（ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针 - 靶分子反应。蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水、离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结合。因为有机溶液可降低杂交体的稳定性，所以，疏水反应对互补核酸链的结合也有一定的作用，但对其特异性影响甚微。

核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍可能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰的性质。这一特性有助于理解非放射性核酸探针标记物的设计和 125I 与 DNA 探针的化学结合。能与核酸结合的单一原子有银、溴和碘等，这些元素可与嘧啶（胸腺嘧啶除外）环的 C - 5 位或嘌呤环的 C - 8 位反应而不影响氢键的形成。溴亦可与胸腺嘧啶的 C - 6 位结合。而胞嘧啶的 C - 4 和腺嘌呤的 N - 6 就不能被修饰，否则会影响碱基配对，尽管 C 的 N - 4 位和 A 的 N - 6 位参与了氢键形成，但它们也是标记位点。这是因为标记的探针每 1kb 只掺入 10～30 个修饰碱基，即仅 4%～12% 的单个碱基被修饰的类似物取代了。尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个杂交分子的稳定性影响很小。防止氢键破坏的一种方法就是修饰探针，即探针克隆入 M13 载体中，只修饰载体区而不修饰插入片段。当用放射性同位素 32P 和 35S 标记核酸时，由于同位素是掺入核酸骨架的磷酸二脂键中，因此碱基未发生任何修饰。在 5’端的磷酸基团上可进行化学修饰，这是标记寡核苷酸探针的有效方法。因为这种方法是在一个探针分子上标记一个检测的基团，所以，对长的克隆探针不适用。

此外，还可利用修饰的碱基来增加杂交的稳定性和特异性。2- 氢基腺嘌呤可替代寡核苷酸探针中的腺嘌呤通过形成 3 个氢键以增加杂交体的稳定性。另外，在 G - C 丰富的 RNA 探针中，可用次黄嘌呤代替鸟嘌呤以获得特异的杂交。因为次黄嘌呤和鸟嘌呤间只形成 2 个氢键，有效地降低了杂交体的 Tm 值，这样，Tm 值与杂交温度更接近，杂交的严格性就增加了，因此，也就增加了特异性。

很显然，结合位点的不同和可检测基团与检测系统的不同，可派生出很多核酸探针标记方法。这是由核酸的化学结构和性质所决定的。只有在对核酸分子的探针 - 靶反应的化学本质有了深入了解之后，才能更好地理解后面的章 节 内容。

三、核酸探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA 探针，RNA 探针，cDNA 探针，cRNA 探针及寡核苷酸探针等几类，DNA 探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。

（一）DNA 探针DNA 探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链 DNA 或单链 DNA 探针。现已获得 DNA 探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞 DNA 探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些 DNA 片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类 Alu 探针。这些 DNA 探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之 G + C 百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约 5×106bp，约含 3000 个基因。各种细菌之间绝大部分 DNA 是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组 DNA 文库的办法，即将细菌 DNA 切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的 DNA 作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性 DNA 片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经 DNA 序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性 DNA 探针，常常是比较繁琐的。探针 DNA 克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建 DNA 文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。

对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在 DNA 文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞 DNA 组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于 cDNA 探针。

DNA 探针（包括 cDNA 探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA 探针不易降解（相对 RNA 而言），一般能有效抑制 DNA 酶活性。③DNA 探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR 标记法等，能用于同位素和非同位素标记。

（二）cDNA 探针cDNA（complementary DNA）是指互补于 mRNA 的 DNA 分子。cDNA 是由 RNA 经一种称为逆转录酶（reverse transcriptase）的 DNA 聚合酶催化产生的，这种逆录酶是 Temin 等在 70 年代初研究致癌 RNA 病毒时发现的。该酶以 RNA 为模板，根据碱基配对原则，按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA（其中 U 与 A 配对）。这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称反向转录或逆转录。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒 RNA 在逆转录酶的催化下转化成双链 cDNA，并进而整合人宿主细胞染色体 DNA 分子，随宿主细胞 DNA 复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制，如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变，后来发现逆转录酶不仅普遍存在于 RNA 病毒中，而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以 dNTP 为底物，RNA 为模板，tRNA（主要是色氨酸 tRNA）为引物，在 Trna3’-OH 末端上，5’-3’方向，合成与 RNA 互补的 DNA 单链，称为互补 DNA（cDNA），单链 cDNA 与模板 RNA 形成 RNA-DNA 杂交体。随后在逆转录酶的 RNase H 活性作用下，将 RNA 链水解成小片段。cDNA 单链的 3’末端回折形成一个小引物末端，逆转录酶又以第一条 cDNA 链为模板再合成第二第 cDNA 链，至此，完成逆转录全过程，合成双链 cDNA。

逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化，最常用的有 AMV 逆转录酶。利用真核 Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于 mRNA 的 cRNA 链，然后再用 RNase H 将 mRNA 消化掉，再加入大肠杆菌的 DNA 聚合酶 I 催化合成另一条 DNA 链，即完成了从 mRNA 到双链 DNA 的逆转录过程。

所得到的双链 cDNA 分子经 S1 核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头（linker），再经特定的限制酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是 λ 噬菌体 DNA，如 λgt，EMBL 和 Charon 系列等。用这类载体可以得到包含 104 以上的转化子的文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的 DNA 探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。

（三）RNA 探针RNA 探针是一类很有前途的核酸探针，由于 RNA 是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的 RNA 探针是细胞 mRNA 探针和病毒 RNA 探针，这些 RNA 是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类 RNA 探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组 DNA 克隆时，因无 DNA 探针可利用，就利用 HIV 的全套标记 mRNA 作为探针，成功地筛选到多株 HIV 基因组 DNA 克隆。又如进行中的转录分析（nuclear run on transcrip-tion assay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在 α -32P-ATP 的存在下进行转录，所合成 mR-NA 均掺入同位素而得到标记，此混合 mRNA 与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的 DNA 进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。

近几年体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体 pSP 和 pGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有 SP6 启动子和 T7 启动子，在 SP6RNA 聚合酶或 T7RNA 聚合酶作用下可以进行 RNA 转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源 DNA 片段，则可以此 DNA 两条链中的一条为模板转录生成 RNA。这种体外转录反应效率很高，在 1h 内可合成近 10μg 的 RNA 产生，只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的 NTP，则所合成的 RNA 可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。

值得一提的是，通过改变外源基因的插入方向或选用不同的 RNA 聚合酶，可以控制 RNA 的转录方向，即以哪条 DNA 链以模板转录 RNA。这种可以得到同义 RNA 探针（与 mRNA 同序列）和反义 RNA 探针（与 mRNA 互补），反义 RNA 又称 cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测 mRNA 的表达水平。在这种情况下，因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要比 DNA-DNA 杂交高几个数量级。RNA 探针除可用于检测 DNA 和 mRNA 外，还有一个重要用途，在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录，有时还存在反向转录（即生成反义 RNA），这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外，在真核系统，某些基因也存在反向转录，产生反义 RNA，参与自身表达的调控。在这些情况下，要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链 DNA 探针，而只能用 RNA 探针或单链 DNA 探针。

综上所述，RNA 探针和 cRNA 探针具有 DNA 探针所不能比拟的高杂交效率，但 RNA 探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。

（四）寡核酸探针前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在 DNA 序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点。优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌 DNA 的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。

合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如 20nt 的寡核苷酸探针在浓度为 100ng/ml，靶序列为 1～100pg、1kb 片段或 3×10-18~3×10-16mol/ L 时，达到最大程度的杂交只需 10min，而用 2kb 的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需 16h。②寡核苷酸探针可识别靶序列内 1 个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的 Tm 值。③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和 / 或选择相对长的序列（>30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有 18～40 个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少 50 个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。

①长 18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。

②碱基成分：G+ C 含量为 40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。

③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。

④避免单一碱基的重复出现（不能多于 4 个），如 -CCCCC-。

⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过 70% 或有连续 8 个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

按上述原则选出的探针会增加成功的机会，选定后进行合成与标记，并摸索合适的杂交条件。方法是制备几张点有特异靶 DNA 和不相关 DNA 的膜，各膜分别在不同温度下与探针杂交，特异靶 DNA 杂交信号强而非特异 DNA 不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。在进行点突变检测杂交的反应时，洗膜条件和温度物选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶 DNA 与探针产生强的杂交信号而突变型靶 DNA 则不产生杂交信号，这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。

寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技术。该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。例如，镰刀状红细胞贫血是因 β 珠蛋白基因的第 6 个寡码子由 GAG 变成 GTG，从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的 β - 珠蛋白功能异常，称作 S 珠蛋白，而野生型称为 A 珠蛋白，其基因型分别为 βS 和 βA。恰好突变点 A→T 位于 Del I 的识别序列 CT-NAG 之内，这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。方法是合成一个长 40 个碱基的寡核苷酸探针，其 5’末端距突变碱基有 11 个碱基，该探针与 βA 基因的非编码链互补。将此探针的 5’末端标记上 32P。杂交方法采用液相杂交法，即在液相中将靶 DNA 变性解链，然后与探针退火，产生杂交体。如靶 DNA 为 βA 型，则两条链完全互补，并产生 Dde I 的酶切位点；如待检 DNA 为 βS 型，则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对，从而不能被 Del I 所识别。用 Del I 消化杂交 DNA，显然 βA 会被切开而 βS 不被切开。βADNA 杂交体被切开后，5’端探针序列因只有 8 个碱基，与杂交链结合不紧而解离，从而产生游离的 5’端标记 8 核苷酸单链。不被切开的 βS 杂交体尚可被另一个限制酶 Hinf I 消化，该酶的识别位点紧靠 Del I 识别位点上游。βS 杂交 DNA 经 Hinf I 消化后，将释出探针 DNA 的 5’末端 3 核苷酸小片段。βADNA 杂交体因已无 Hinf I 识别序列，故而不能被 Hinf I 消化。这样 βA 和 βSDNA 经此寡核苷酸探针杂交和 Del I 及 Hinf I 消化后，分别产生游离的 8 核苷酸（8nt）和 3 核苷酸（3nt）片段，它们可以经电泳分离后进行放射自显影而获证实。藉此策略，可轻易将各种 β 珠蛋白突变型鉴别开，如纯合野生型 AA 结果为仅有 8nt 片段，纯合突变型 SS 则仅可检出 3nt 片段，而杂合子 AS 型则两种片段均存在。

四、核酸探针的标记和检测（详见每十九章）分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有 32P 和 35S 前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P 半衰期为 14.3 天，35S 半衰期为 87.1 天，125I 的半衰期为 60 天），3H 的半衰期长达 12.3 年，但它所释放 β 放射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近些年来，人们在寻找非航船性标记物方面取得了很大进展，国际上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒，在国内也已具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前，非放射性标记物有下述几类：金属如 Hg，荧光物质如 FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）。半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等。不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。下面仅就国际上较常用的，有实用价值或发展前景的几种核酸标记方法及其显示方法分两方面简述如下。

（一）核酸探针的常用酶促标记技术1．缺口平移 该技术由 Kelly 等于 1970 年创立。其原理是首先用 DNA 酶在双链 DNA 探针分子的一条链上制造一些缺口（nick）, 缺口处会形成 3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的催化下将核苷酸残基加在 3’-羟基上，同时，根据大肠杆菌酶 DNA 聚合酶 I 的 5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口 5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移（nick tr-anslation）。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为 α -32PdATP）置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达 108cpm（每分钟计数）/μg 的 32P 标记 DNA。用缺口平移法标记的 DNA 探针能满足大多数杂交要求。

2．DNA 快速末端标记 大肠杆菌 DNA 聚合酶 i 经枯草杆菌蛋白酶切割可得到两条多肽链，其中分子量为 76kd 的大片段称为 Klenow 片段。该酶具有完整聚合酶 I 的 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏 5’→3’核酸外切酶活性。利用 Klenow 片段可以填补由限制酶消解 DNA 所产生的 3’凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链 DNA 的凹陷 3’末端。用 Klenow 片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP 取决于 DNA 末端延伸的 5’末端序列，例如，用 EcorI 切割 DNA 所产生的末端用[α-32P]dNTP 标记。标记反应可在一种限制酶消解 DNA 后立即进行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更换缓冲液，具有 3’延伸的 DNA 末端不能被 Klenow 片段有效在标记，欲标记这类分子可用 T4DNA 聚合酶。

选用这种标记方法是为了产生可用于凝胶电泳时作大小参照物的 DNA 片段。因为标记的 DNA 片段与其摩尔浓度成比例，而不与片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被标记。因此，可使用放射自显影术确定不有被溴化乙锭染色所观察到的大小 DNA 带，尤其适用于 Southern 吸印杂交时分子量标志物的标记。通过选择相应标记的 dNTP，该法还可以只标记 DNA 分子的一端。例如，若 DNA 片段的两个末端分别是 Bam H I 和 Hind III 粘膜端，在反应中只加入[α-32P]dNTP 或[α-32P]dGTP，使可选择性标记两末端之一。

3．用 T4 多核苷酸激酶标记 DNa 5’末端 寡核苷酸探针或短的 RNA 和 DNA 探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4 多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由 T4 噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化 ATP 的 γ - 磷酸转移至 DNA 或 RNA 的 5’-OH 末端。在过量 ADP 存在时，也可促进磷酸交换反应，使 PNK 将 DNA 末端 5’磷酸转移到 ADP 上生成 ATP，然后催化[α-32P]dNTP 上的标记磷酸转移至 DNA 的 5’末端，从而使 DNA 重新磷酸化，并藉此得到标记。显然，PNK 标记 DNA 末端需要[γ-32P]dNTP，这与前述酶促标记方法不同。通常，对于 5’磷酸化的 DNA 探针，要先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团，然后再用于 PNK 催化的 5’末端标记，这样标记效率较高。

4．随机引物延伸 这是以单链 DNA 或 RNA 模板合成高比活性 32P 标记探针所选用的方法。原理是使长 6～8nt 的寡核苷酸片段与变性的 DNA 或 RNA 模板退火，在 DNA 聚合酶 I 或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发 DNA 链的合成，在反应时将[α-32P]dNTP 掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针 DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板 DNA 随机发生退火反应，因此被称为随机引物（random primer）。这种随机引物可用小牛胸腺 DNA 或鱼精 DNA 制备。

用随机引物法标记的 DNA 探针或 cDNA 探针比活性显著高于缺口平移法，且结果较为稳定。这种方法尤其适用于真核 DNA 探针，因为随机引物来自真核 DNA，其与真核序列的退火率要高于原核序列。因此，对于克隆的 DAN 探针，常先将插入探针 DNA 切下来回收后再标记，而缺口平移法可直接用于全质粒的标记。

5．聚合酶链反应（详见第二十二章）聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种分子生物学新技术，由美国 Cetus 公司人类遗传学部的 Kary.B. Mullis 于 1985 年创立。该技术利用两个与相反链杂交并随着于靶 DNA 两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的 DNA 片段，包括模板变性，引物退火和引物延伸三个步骤的反复循环，最终两引物所夹靶 DNA 得到千万倍以上的扩增。因此，PCR 技术已成为一项极为有价值的技术并已迅速推广应用。

PCR 技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性 DNA 探针。PCR 技术具有很高的特异性，可在 1～2h 之内在量合成探针 DNA 片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP 或其它标记的 dNTP，则探针 DNA 合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达 70%～80%。因此，PCR 标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性 PCR 引物。使用从探针 DNA 上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。

（二）核酸探针的非放射性标记技术1．光敏生物素标记核酸 目前使用的光标生物素试剂有两种：光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是 -N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照（320～400μm）下，可与单链或双链核酸发生反应，反应主要在 T 上，C 上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含 6～12 个碳原子，用以减少探针杂交时的空间位阻。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到 pg 水平，可用于外源基因的检测。最近出现了一种新的光敏活性 DNA 生物素试剂，即生物素 - 聚乙二醇 - 当归素（BPA）。BPA 的 DNA 结合部分是一个活性糖香豆素衍生物，在长波 UV 下它可与 DNA 碱基共价键结合。BPA 反应物与 DNA 结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特性可使 BPA 只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。

2．酶促生物素标记核酸 以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应 32P 标记的脱氧核苷三磷酸，经 DNA 聚合酶作用掺入 DNA。Bio-dUTP 代替 dTTP,Bio-dATP 代替 dATP，Bio- dCTP 代替 dCTP。Bio –11-dUTP 的 11 是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物素标记 DNA 的方法有缺口平移法和随机引物延伸法。

3．寡核苷酸的生物素末端标记 有 5’- 磷酸的化学标记法和 3’-OH 的酶促标记法。前者将寡核苷酸的 5’- 磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。后者是用末端转移将 Bio-11–dUTP 加于其 3’-OH 端（脱去一个焦磷酸）。

4．酶标 DNA 标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的 DNA 结合，使 HRP 与 DNA 连接在一起，组成 HRP 标记的 DNA 探针。

5．酶标寡核苷酸 包括核苷酸 5’末端标记 HRP 法和内部标记 AP 法。前者是在 HRP 中产生一个 -HS 反应基团，在寡核苷酸合成终了加在 5’端，带一个 C6 的 -HS 基，与活化的 HRP 反应生成 5’-HRP 寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸过程中将一个 5’带连接臂及 CF3 基团的尿苷 3’亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与 AP 反应即得到 AP 标记的寡核苷酸。

6．DNA 半抗原标记 其原理与 Bio-11-dTUP 相同，只是用毛地黄甙代替生物素形成 Dig –11- dUTP，酶促掺入 DNA 分子。用抗毛地黄甙抗体检测标记在 DNA 上的半抗原分子 Digoxigenin（地高辛）

(三）非放射性探针的显示体系1．AP 显色体系

BCI –OH+NBT→紫色↓

ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5 溴 - 4 氯 - 3 吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。

2．HRP 显色体系

HRP + H2O2[HRP·H2O2]

ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]枣→ODA-N = ODA/ 棕色↓+HRP +H2O

ODA：邻 - 联茴香胺。

3．ABC 显色体系

DNA –B+ SA – AP→DNa – B – SA 或 DNa – B +SA – BAP→DNa –B –SA –BAP

经上述两反应，把 AP 连接在 DNA 上以后，再进行 AP 酶显色。这里 SA 为 Streptavidin（链酶亲合素），BAP 为生物素化的磷酸酶，B 为生物素（biotin），ABC 为 Avidin – Biotin – Enzyme com-plex, 即亲合素 - 生物素 - 酶复合物。

以上反应 AP 亦可用 HRP 代替。

表 18- 3 曱核酸探针的标记分子

标记物性质标记分子标记方法杂交体的检测法放射性分子[α-32P]dNTPNT、PCR、RPI放射自显影或计数[γ-32P]dNTPTL放射自显影或计数125I碘化放射自显影或计数35SNT放射自显影或计数3HNT放射自显影或计数非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、TL、PCR酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色光敏生物素600W 可见光照同上生物素化补骨脂素365nm 紫外线照同上生物素酰 -e- 氨基乙酸化学合成法同上N- 羟基丁二酰亚胺脂酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色生物素肼化学合成法酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色酶微过氧化物酶直接法或合成法直接底物显色或用酶标抗体 + 底物显色碱性磷酸酯酶直接法或合成法同上荧光素罗丹明和 FITC合成法直接荧光显微镜观察或酶标抗体 + 底物显色化学发光标记物化学发光测量或自显影抗双链单抗酶标或荧光标记单抗化学法直接底物显色稀有金属Eu3-化学法时间分辨荧光重金属Ag化学法Hg化学法半抗原磺酸胞嘧啶化学法酶标单抗 + 底物显色地高辛RPL酶标抗体 + 底物显色*：NT：缺口平移；PCR：聚合酶链反应；RPL：随机引物标记；TL：末端标记

4．非放射发光自显影若将 AP 或 HRP 的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光子的化合物，可用自显影技术暴光 X 线片显示。

（1）HRP 发光自显影：氨基苯 - 甲酰肼在 HRP 与 H2O2 的作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出 N2 及发光（波长 428nm）。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图：

（2）AP 的发光自显影：AP 的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在 AP 的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间 - 氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621 型）直接暴光显影。显影信号强度比 BCIP/NBP 显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

其发光反应的原理如下：

HRP 的发光原理：

AP 的发光原理：

五、核酸分子杂交的类型随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶 DNA 自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern 印迹杂交、Northern 印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的 30 年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。

（一）固相膜核酸分子杂交方法固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法：

1．DNA 的变性 DNA 变性解链是杂交成功的关键。Southern 印迹杂交时 DNA 在凝胶中变性，变性方法是将凝胶浸在数倍体积的 1.5mol/l NaCl 和 0.5mol/l NaOH 中 1h 然后用数倍体积的 1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和 1.5mol/l NaCl 溶液中和 1h。DNA 受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免 DNA 降解。热变性在要低 DNA 浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1mol/l SSC 含 15mmol/l NaCl – 1.5mmol/ L 柠檬酸三钠，pH7.0）下进行。用 SSC 稀释 DNA 溶液为 50μg/ml, 加 10mol/l NaOH 使最终浓度为 0.1mol/L（pH 约 12.8），室温变性 10min，很快置冰盐水中，用 10min/l HCl 或 5mol/l NaH2PO4 调 pH 到 7～8[亦可用碱变性后，调至中性，再加热 100。c 10min]，DNA 变怀可用 OD260 增加（约 30%～40%）来检测，变性 DNA 醇沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的 12×SSC，冰浴保存。

2．变性 DNA 在硝酸纤维素膜上的固定 硝酸纤维素滤膜（孔径 0.45μm）先在蒸馏水中充分浸泡，再用 6×SSC 浸泡 30min～2h，凉干。DNA 样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥 4h，然后在 80。C 真空干燥 2h。

3．预杂交 湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米滤膜加 0.2ml 预热至 60。C 的预杂交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt 液，100μg/ml 鲑鱼精 DNA）。鲑鱼精 DNA 需经过剪切和 DNA 酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至 10mg/ml，用前放 100。C 水浴中煮沸变性 10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入 68。C 水浴保温 3~12h。当预杂交液温度升至 68。C 时，在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

4．杂交 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好是足量的液体保持滤膜湿润（50μl/cm2）。溶液的组成是 6×SSC，0.01mol/l EDTA, 变性的标记核酸探针，5×Denhardt 液，0.5%SDS, 100μg/ml 变性的鲑鱼精 DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口，杂交反应在 68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶 DNA 的性质及探针的比活性等情况而定，一般 4～20h。

5．洗膜 取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有 2×SSC 和 0.5%SDS 溶液的盘中，室温下漂洗 5min。再将滤膜移入 2×SSC 和 0.1%SDS 溶液中，室温下洗涤 15min（轻轻摇动）。然后将滤膜移入 0.1×SSC 和 0.5%SDS 溶液中；68℃轻轻摇动保温 2h，更换缓冲液后继续保温 30min。

洗膜的温度一般应控制在低于 Tm 值 12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %）。双链 DNA 的 Tm 值随错配碱基对数每增加 1% 而递减 1℃。

6．结果显示 非放射性检测方法前已述及，此处主要介绍放射性测定方法。固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射性自显影法，另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单，只需将杂交膜与 X 光片在暗盒中曝光数小时至数天，再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固相膜，用一块增感屏可显著增强曝光强度。此外，为了减弱 32P 的散射，曝光通常在 -20℃或 -80℃下进行。液闪计数法主要用于打点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形。方法是将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块（每份样品 1 块），80℃真空干燥后装闪烁瓶。加入 2～5ml 闪烁液，剪 2～3 块无样品膜块作为本底对照。在液体闪烁计数器上自动计数。液体计数测定放射性强度也可在放射自显影之后进行。

（二）固相核酸分子杂交类型1．菌落原位杂交（Colonyin situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出 DNA。将 NDA 烘干固定于膜上与 32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

实验步骤如下：

①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。

②培养细菌至产生 1～2mm 大小的菌落。

③在一块平皿中置 4 张滤纸，用 10%SDS 浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡。

④5min 后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl）浸湿的滤纸上，放置 10min。

⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/lNaCl , 0.5mol/L Tris·HCl，pH8.0）浸湿的滤纸上，放置 10min。重复中和 1 次。

⑥将滤膜移至用 2×SSPE 溶液浸过的滤纸上，放置 10min。SSPE 配成 20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。

⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干 2h。

以下操作参考前述。

2．斑点杂交（Dot blot）斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如 Minifold I 和 II、Bio-Dot (Bio –Rad)和 Hybri –Dot, 它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

（1）DAN 斑点杂交

①先将膜在水中浸湿，再放到 15×SSC 中。

②将 DNA 样品溶于水或 TE，煮沸 5min，冰中速冷。

③用铅笔在滤膜上标好位置，将 DNA 点样于膜上。每个样品一般点 50μl（2～10μg DNA）。

④将膜烘干，密封保存备用。

（2）RNA 斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加 10μg 总 RNA（经酚 / 氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。方法是将 RNA 溶于 5μlDEPC 水，加 15μl 甲醛 /SSC 缓冲液（10×SSC 中含 0.15mol/ l 甲醛）使 RNA 变性。然后取 5～8μl 点样于处理好的滤膜上，烘干。

培养细胞，标本处理技术可以简化，不用提取和纯化 RNA。方法是用含 0.5%Nonidet P40 的低渗缓冲液对多种动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带 DNA 而富含 RNA 的细胞质提取物，这一粗 RNA 在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5×104）或组织。

整个 RNA 实验中，要防止激活内源性 RNase，有许多种预防措施，有一种是在样品中加入核糖核苷氧矾基复合物（RVC）。

（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测。将整个细胞点到膜上，经 NaOH 处理，使 DNA 暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从 105 个培养细胞中检测到少至 5pg 的 Epstein– Barr 病毒 DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它是使细胞直接在膜上溶解，所以 DNA 含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与 32P 标记的探针杂交。但它不适于非放射性标记探针，因为 DNA 纯度不够，会产生高本底。

3．Southern 印迹杂交（southern blot）Southern blot 是研究 DNA 图谱的基本技术，在遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物分析等方面有重要价值。Southern 印迹杂交基本方法是将 DNA 标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris 缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将 DNA 从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中 DNA 片段的相对位置在 DNA 片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的 DNA 与 32P 标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条 DNA 带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的 DNA 片段的位置和大小。

（1）琼脂糖凝胶电泳：利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将 DNA 限制酶消化片段（0.3～25kb）分离开。分离大分子 DNA 片段（800～12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%）,300～5000bp 的片段则用 1.3% 的琼脂糖凝胶，根据分离样品量、分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。

电泳时，同时将标记物加到旁边孔中，便于确定样品 DNA 的分子量。20 伏恒压电泳过夜。电泳毕，将胶浸到含 0.5μg/ml EB 的 TBE 缓冲液中染色 30min，也可将 EB 直接加到电泳缓冲液中或在配胶前加入胶中，在 254nm 短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈 f4.5, 曝光 20～40s。

（2）硝酸纤维素滤膜吸印。

①将胶切成合适大小，切去右上角作为记号。

②将胶放进盛有变性缓冲液（1.5mol/lNaCl, 0.5mol/L NaOH）的盘中轻摇动 15min。

③换到中和缓冲液（1mol/LTris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl）中轻摇动 30min。

④裁一张硝酸纤维素膜，2～4 张 3MM 滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路），先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入 10×SSC 中，接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴橡胶手套操作。

⑤平盘上放一块比胶大的平板（盛胶槽翻过来即可），上面铺一张 3MM 滤纸，起灯芯作用，盘中加少量 10×SSC 缓冲液（2.5cm 厚），不能没过平板，使 3MM 滤纸充分饱和。

⑥将胶倒扣到 3MM 滤纸上。

⑦浸湿的硝酸纤维素铺在胶上，对齐，铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

⑧膜上放一张 3MM 滤纸，不能与胶接触。

⑨上面加吸印纸及重物（500g 左右）。

⑩通过滤纸的灶芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将 DNA 吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸。在室温下转印过夜。

⑾去除上面的东西，用镊了将膜取出，在 6×SSC 中洗一下（也可不洗）。

⑿自然干燥，80℃烤 2h。

⒀这时的膜就可进行杂交，或室温密封保存。

4．Northern 印迹杂交（Northern blot）这是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA 印迹技术由 Southern 于 1975 年创建，称为 Southern 印迹技术。RNA 印迹技术正好与 DNA 相对应，故被趣称为 Northern 印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 western blot。Northern 印迹杂交的 RNA 吸印与 Southern 印迹杂交的 DNA 吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使 RNA 变性，而不用 NaOH，因为它会水解 RNA 的 2’- 羟基基团。RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则 RNA 会被洗脱。在胶中不能加 EB，因它为影响 RNA 与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行 Northern 转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含 5μg/ml EB 的 0.1mol/L 醋酸铵中 10min，在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的 RNA 胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使 RNA 信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的 mR-NA 时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免 RNase 的污染。

下面介绍 RNA 甲醛凝胶电泳和吸印方法：

（1）试剂

10×MSE 缓冲液：0.2mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0, 50mmol/L 醋酸钠，1mmol/l EDTA, pH8.0。

5×样品缓冲液：50% 甘油，1mmol/l EDTA, 0.4% 溴酚蓝。

甲醛：用水配成 37% 浓度（12.3mol/L）。应在通风柜中操作，pH 高于 4.0。

去离子甲酰胺。

50mmol/L NaOH(含 10mmol/l NaCl)。

0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。

（2）步骤

①40ml 水中加 7g 琼脂糖，煮沸溶解，冷却到 60℃，加 7ml 10×MSE 缓冲液、11.5ml 甲醛，加水定容 至 70ml，混匀后 倒入盛胶槽。

②等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入 1×MSE 缓冲液的电泳槽。

③使 RNA 变性（最多 20μg）：RNa 4.5μl，10×MSE 缓冲液 2.0μl，甲醛 3.5μl，去离子甲酰胺 10.0μl。

④55℃加热 15min，冰浴冷却。

⑤加 2μl 5×载样缓冲液。

⑥上样，同时加 RNA 标记物。

⑦60 伏电泳过夜。

⑧取出凝胶，水中浸泡 2 次，每次 5min。

⑨室温下将胶浸到 50mmol/LNaOH 和 10mmol/l NaCl 中 45min，水解高分子 RNA，以增强转印。

⑩室温下将胶浸到 0.1mol/LTris·HCl (Ph7.5)中 45min，使胶中和。

⑾20×SSC 洗胶 1h。

⑿20×SSC 中过夜，转印到硝酸纤维素膜上。

⒀取出硝酸纤维膜，80℃真空烘烤 2h。

5．组织原位杂交（Tissuein situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出 DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体 DNA 的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核 DNA 的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞 RNA 的杂交可精确分析任何一种 RNA 在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

用于原位杂交的探针可以是单链或双链 DNA，也可以是 RNA 探针。通常探针的长度以 100～400nt 为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称 PCR 标记的小 DNA 探针或体外转录标记的 RNA 探针是组织原位杂交的优选探针。

探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H 和 35S 最为常用。3H 标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低。35S 标记探针活性较高，影像分辨率也较好。而 32P 能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。

原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用 0.2mol/l HCl 处理载玻片，用蛋白酶 K 消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高（详见二十章）。

6．固相夹心杂交 Dunn 等最早介绍了夹心杂交类型，Ranki 等又作了进一步的改进。夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点：①样品不需要固定，对粗制样品能做出可靠的检测；②用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强，因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。

固相夹心杂交需要两个靠近而不互相重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。样品基因组内核酸只有使这两个探针紧密相连才能形成夹心结构。需注意的是两个探针必须分别亚克隆进入两个分离的非同源载体内，以避免产生高的本底信号（如一个克隆人 Puc19, 另一克隆人 pBR322）。

夹心杂交法可用滤膜和小珠固定吸附探针，使用小珠可更好地进行标准化试验和更容易对小量样品进行操作。Dahlen 等利用微孔板进行夹心杂交，可同时进行大量样品检测，他们先吸取 DNA 探针加到凹板中，然后用紫外线照射使其固定到塑料板上。用微孔板进行夹心杂交还可直接用于 PCR 技术。应用光敏生物标记探针检测 PCR 产物的敏感性和用 32P 标记探针（3×108cpm/μg）作 16h 放射自显影的 Southern 杂交的敏感性一样。用微孔板杂交的其它优点还包括同时做多份样品，加样、漂洗和读结果等步骤可以自动化。

7．其它杂交类型

（1）固化探针杂交：该法较少使用，原理是使未标记固化探针通过杂交与靶 RNA 或 DNA 结合，漂洗后，用酶标抗 DNA：RNA 抗体或抗 DNA：DNA 抗体与杂交物结合。将乳胶颗粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物显色并进行测定。探针浓度 2μg/ml,80℃杂交，可在 10～15min 完成，检测的敏感性为 5×108 靶序列。

（2）反向杂交：这个杂交类型是用标记的样品核酸与未标记的固化探针 DNA 杂交，故称为“反向杂交”。这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中，可同时检测样品中几种核酸。这种杂交方式主要用于进行中的核酸转录试验和多种病原微生物的检测。前者是在转录过程中标记 RNA 探针，后者可用光敏生物素制剂 BPA 标记样品核酸。

（三）固相膜核酸杂交的几点说明1．杂交膜的选用杂交膜是一种多孔、表面积很大的固相载体，核酸一旦固定在上面，就可用杂交法进行检测。最常使用的膜是硝酸纤维素膜，用于放射性和非放射笥标记探针都很方便，产生的本底浅，与核酸结合的化学性质不是很清楚，推测为非共价键结合。经 80℃烤干 2h 和杂交处理后，核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合，这在使用非同位素探针中尤为有用。硝酸纤维素膜的缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓度盐（>10×SSC），与小片段核酸（<200bp）结合不牢，质地脆，不易操作。

尼龙膜在某些方面比硝酸纤维素膜好，它的强度大、耐用，可与小至 10bp 的片段共价结合。在低离子浓度缓冲液等多种条件下，它们都可与 DNA 单链或 RNA 紧密结合，且多数膜不需烧烤。尼龙膜韧性好，可反复处理与杂交，而不丢失被检标本。它通过疏水键和离子键与核酸结合，结合力为 350～500μg/cm2，比硝酸纤维素膜（80～100μg/cm2）强许多。尼龙膜的缺点是对蛋白有高亲合力，不宜使用非同位素探针。

2．“噪音”的排除“噪音”（noise）是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记 DNA 结合到空白膜上的放射性计数，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件：二是选择合适的杂交反应液和对膜进行处理。研究发现，随着离子强度的增加，空白膜（未固定 DNA 对照膜）上的“噪音”水平增加，而在 50% 甲酚胺 6×SSC 的杂交反应液中充分封闭膜上的多余非特异结合位点。

（四）液相核酸分子杂交类型1．

（1）HAP 吸附杂交：羟基磷灰石（HAP）层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法。在液相中杂交后，DNA：DNA 杂交双链在低盐条件可特异地吸附到 HAP 上。通过离心使吸附有核酸双链的 HAP 沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次 HAP，然后将 HAP 置于计数器上进行放射性计数。

（2）亲合吸附杂交：生物素标记 DNA 探针与溶液中过量的靶 RNA 杂交，杂交物吸附到酰化亲合素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗 DNA：RNA 杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应，加入酶显色底物，这个系统可快速（2h）检测 RNA。

（3）磁珠吸附杂交：Gen– probe 公司最近应用吖啶翁酯（acridinium ester）标记 DNA 探针，这种试剂可用更敏感的化学发光来检测。探针和靶杂交后，杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠（阳离子磁化微球体上）。溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出，经过简单的漂洗步骤，吸附探针的小珠可用化学发光测定。

2．发光液相杂交

（1）能量传递法：Heller 等设计用两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。两个靠得很近的探针用不同的物质标记（标记光发射），当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近。一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节 检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得近时，才能产生受激发光，因此这种方法具有较好的特异性。

（2）吖啶翁酯标记法：吖啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后，未杂交的标记探针分子上的吖啶翁酯可以用专门的方法选择性除去，所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低（约 1ng 的靶核酸），仅适用于检测扩增的靶序列，如 rRNA 或 PCR 扩增产物。

3．液相夹心杂交

（1）亲合杂交：在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构，杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针，用 125 I 标记检测探针，这个系统的敏感性可检测出 4×106 靶分子。该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。

（2）采用多组合成探针和化学发光检测：第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们有 50 个碱基长，其中含有 30 个细菌特异序列碱基和 20 个碱基的单链长尾；第二类探针是固相吸附探针，它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多个标记探针，液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上，典型的试验可用 25 个不同的检测探针和 10 个不同的吸附探针。第一个标记检测探针上附着很多酶（碱性磷酸酶或过氧化物酶）可实现未标记检测探针的扩增。使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物更敏感。这个杂交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测，敏感性达到能检测 5×104双链 DNA 分子。

4．复性速率液相分子杂交这个方法的原理是细菌等原核生物的基因组 DNA 通常不包含重复顺序。它们在液相中复性（杂交）时，同源 DNA 比异源 DNA 的复性速度要快。同源程度越高，复性速率和杂交率越快。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测定变性 DNA 在一定条件下的复性速率，进而用理论推导的数学公式来计算 DNA-DNA 之间的杂交（结合）度。

六、核酸分子杂交实验因素的优化（一）探针的选择

根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的 DNA 或 cDNA 双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和 RNA 探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的 DNA 单链探针（通过克隆人 M13 噬菌体 DNA 获得）或 RNA 探针，寡核苷酸探针也可。长的双链 DNA 探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的 PCR 标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。

在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立 DNA 文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定 6 个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用 PCR 方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。这种方法十分简便，无论基因组 DNA 探针还是 cDNA 探针都可以容易地获得，而且，可以建立 PCR 的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。

（二）探针的标记方法

在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。

（三）探针的浓度

总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32 P 标记探针与非放射性标记探针的用量分别为 5～10ng/ml 和 25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为 0.5～5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。

（四）杂交率

传统杂交率分析主要用于 DNA 复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。因此，本文不讨论通常用于杂交反应的传统二级速率公式，而叙述一级动力学公式。

在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形，双链探针开始时（1～4h），杂交动力学相同，但长时间杂交后，由于探针本身的复性，可用于杂交的探针浓度会逐渐降低。公式（1）可用于估计半数探针与固定靶序列杂交所需的时间。

t1/2=ln2/kc

t= 保温（杂交）时间（s）；k = 形成杂交体的速率常数[mol/(Lxntxs)]；c = 溶液中的探针浓度（mol/L）。速率常数 K 决定于探针长度（L）、探针复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和 pH。不含重复序列的探针，l =N。例如，对一个含两个 20nt 序列的 40mer 探针而言，l=40，N=20。K 与这些变量的关系为：

Kn= 3.5×105K=KnL0.5/N (2)

Kn 是缔结常数，Kn =3.5×105。Na+浓度为 0.4～1.0mol/L, Ph5～9 和杂交温度低于探针 - 靶序列杂交体 Tm 值 2.5℃时，公式（1）和（2）可合并为（3），用于计算半数探针与靶序列的杂交率（以秒计）。

对一个长 500 个碱基的探针而言，此值为：

长 500 个碱基的探针杂交时间很长（20h），应用短探针和使用杂交促进剂有其优越性。由于实际应用的探针长度变化较大（对>1kb 的探针，因扩散与粘度效应不可能使因素 L 得到合适的补偿）。另外，固靶序列也不可能都用于杂交，所以，由公式预计的随探针长度增加的杂交率不一定总是正确的。

（五）杂交最适温度

杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于 Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在 50% 左右或更低些的 DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化 10 倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表 18-3。最适复性温度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻复性温度：Ts = Tm – (10 或 15℃)

非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30 或 35℃)

在 2×SSC 反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃。

表 18-4 DNA—DNA 杂交温度的选择范围（2×SSC）

DNA 中 G +C mol%杂交反应温度（℃）TORTsTns3062.373.352.33564.974.954.94067.477.457.44570.080.060.05072.582.562.55575.185.165.16077.687.667.66580.290.270.27082.792.272.77585.395.375.3可以看出 DNA 复性和 DNa–RNA, DNA-DNA 杂交通常要在高温反应条件下进行, 其反应的最大速度是在低于 Tm 值约 25℃。然而对于那些反应时间需要延长, 或对生物活性必须保护的复杂生物的核酸研究(如哺乳动物), 核酸长时间处于高温下很显然是不利的。这会引起核酸链的断裂、胶嘌呤的作用，结合到膜上的 DNA 脱落也会增多。这个问题可以通过使用高浓度盐溶液（如 6.2mol/l NaCl），或使用某些有机溶剂的水溶液降低反应温度来解决。常使用的有机溶剂有两类，甲酰胺和二甲亚砜（DMSO）。在杂交液中加入 30% 二甲亚砜可使 T2 噬菌体 DNA 的 Tm 值比原先降低 14℃，而使用酰胺甚至可使 DNA 在室温下变性和复性。Mc-Conaughy 等发现，反应液中每增加 1% 的甲酰胺浓度，Tm 值可降低 0.72℃。

现在认为，适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度，可使 DNA 复性和 DNA-RNA 杂交获得高特异性和更快的反应速度。

（六）杂交的严格性

影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体 Tm 值 25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体 Tm 值。由此式可见，通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。对用 20 个碱基以上的探针做 DNA：DNA 杂交的 Tm 值计算如下：

n = 杂交体中最短链的长度，因此，对一个 G + C 为 42% 的 500 个碱基探针于 5×SSC（0.75mol/l Na+）和 50% 甲酰胺杂交的 Tm 值为：

T=81.5 +(-2.07)+ 17.22 –1 –(30.5)=65℃

T 杂交 =65℃–25℃=40℃

影响 TM 值的其它因素：

（1）对克隆或合成探针而言，同源性每下降 1%，Tm 值就降低 1.5℃，15～50 个碱基的寡核苷酸探针的这种作用更明显。

（2）RNA：DNA 杂交体的 Tm 值较同样的 DNA：DNA 杂交体的高 10～15℃。

（3）RNA：RNA 杂交体的 Tm 值较同样的 DNA：DNA 杂交体的高 20～25℃。

显然，当用 RNA 为靶序列时，要使用甲酰胺来降低 Tm 值以保证合适的杂交温度。当以克隆的探针进行膜杂交时，在最后的漂洗步骤中应达到最严格的条件。对一个 500 个碱基探针而言，典型最终漂洗条件点 0.1×SSC（0.015mol/l Na+）,55℃。代入公式（4）可得：

Tm =81.5 (-30.3) +17.22 –1-0 =67℃

67℃-55℃=12℃

因此，较 Tm 低 12℃的漂洗条件比 Tm 低 25℃的杂交相比条件更严格了。

对寡核苷核探针而言，杂交温度往往低于 Tm5℃，因此，对一个 G + C 为 50% 的 30nt 寡核苷酸探针来说，Tm 值为：

T 杂交 =55℃-5℃=50℃

下面一个经典的公式适用于 14-20 个碱基的寡核苷酸探针：

Tm =4℃（g + C）+2℃（a + T）

在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶 DNA 和非特异靶 DNA（如鱼精或大肠杆菌 DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度，在某些条件下，可用二甲亚砜（DMSO）代替甲酰胺来降低 Tm 值。

用一个以上的探针的（如夹心杂交）杂交系统中，估计 Tm 值更加复杂。可用上述公式估计每一探针的 Tm 值。然后求其均值作为杂交温度。

（七）杂交反应时间

在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行 20h 左右。1966 年 Britten 和 Kohne 推荐用 Cot = 值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。实验表明 Cot =100 时，杂交反应基本完成。Cot=0，基本上没有 杂交。例如在液相杂交中未标记的 DNa 400μg/ml（按单股 DNA 每微克 紫外吸收值为 0.024 计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为 21h，那么对于未标记的 DNA 来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。对标记 Dn A（浓度为 0.1μg/ml）来说 Cot 值为 0.05，这就充分排除了标记 DNA 的自我复性。

（八）杂交促进剂

惰性多聚体可用来促进 250 个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加 3 倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达 100 倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。

硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为 500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG 分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下 5%～10% 硫酸葡聚糖效果较好，若用 5%～10%PEG 则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为 2%～4%。与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。

小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链 DNA 间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低 DNA 浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链 DNA 的 Tm 值而起作用。此外，该分子还可以促进 RNA 的杂交，有裂解细胞而抑制 RNase 的作用。总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。

第四节 石蜡包埋组织的 DNA 提取及其应用近 10 年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组 DNA 的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想象的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和 DNA 甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位 PCR 分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对 DNA 或 mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节 不再赘述。Goelz(1985)和 Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的 DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了 DNA 研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节 重点讨论石蜡包埋组织 DNA 提取的方法学及其潜在的应用前景。

一、石蜡包埋组织 DNA 提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取 DNA 的基本步骤，是在常规 DNA 提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织 DNA 提取技术（表 18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含 SDS 和高浓度蛋白酶 K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得 DNA 虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使 DNA 释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的 DNA 小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的 DNA 大分子，从而提高了 DNA 质量，适于做 Southern 印迹杂交分析。Moerkerk 等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得 DNA 之点杂交结果一致，非螺旋化 DNA 亦不影响杂交分析。

表 18-5 Gpelz 氏 DNA 提取方法的主要步骤

1．切除多余石蜡，暴露组织2．将组织切碎（最大径 <0.5mm），称重；3．溶于 TE9 提取液（组织 <50mg/5ml,50～500mg/10ml）, 高速混悬 2～3min；于 48℃放置 24h，其制备见表 18-6；4．再次混悬组织，加入蛋白酶 K 至终浓度 1mg/ml,SDS 至 2%，孵育 40h；5．用等体积酚 - 氯仿溶液抽提 3 次；6．2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA7．-70℃放置 2～4h8．9000×g 离心 1h9．沉淀物用 70% 乙醇洗 1 次10．干燥，TE（pH7.2）溶解。表 18-6 TE9 DNA 提取液的制备

500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500μg/ml蛋白酶 K PH8.05μm 组织切片

↓

常规脱蜡、水化

↓

第一次溶液 A 孵育（去上清）

↓

第二次溶液 A 孵育（留上清）

↓

氯仿 - 异戊醇抽提

↓

RNA 酶和蛋白酶消化

↓

酚抽提

↓

沉淀

↓

（却除未螺旋化 DNA）↓

透析

图 18-6 石蜡包埋组织 DNA 提取流程（Drbeau 等，1986）

溶液 A

2×SSC100μg 蛋白酶 K /ml1% SDS不同类型的基因分析所要求的 DNA 质量长数量不同。Southern 印迹杂交分析需要 10～15μg 大片段 DNA（>20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的 DNA。故 DNA 提取要求高，小片段 DNA 存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段 DNA 样本上进行，分析所需的 DNA 很少，0.5μg 甚至更少即可。PCR 的模板 DNA 制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle-bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。这些方法不经过酚 - 氯仿 - 异戊醇抽提、DNA 纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸 10min 或在蛋白酶 K 缓冲液中消化 4h，DNA 即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行 PCR 扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的 DNA，扩增率较低，且重复性不好。这可能是由于 DNA 附着的蛋白质去除不净而影响 DNA 变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对 Taq DNA 多聚酶的抑制所致。

二、影响 DNA 提取质量的因素1．固定剂对 DNA 的影响 固定剂的类型直接影响提取 DNA 的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA 保存完好，可以获得高分子量 DNA。Warford 等（1988）对甲醛固定过程中 DNA 变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA 提取过程中的蛋白酶 K 消化，酚 / 氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的 DNA 某些理化性质改变。

bramwell 等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得 DNA 产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致 DNA 明显降解。Michel’s 运输保存液或 PBS 存放组织虽提取 DNA 纯度高，但产量明显降低。Dubeau 等也观察到含苦味酸（Bouin 氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的 DNA。

乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu 等（1990）用无水乙醇固定标本 48h，最长达 2 年，均可得到中量的高分子 DNA。每 mm3乙醇固定标本平均 DNA 产量为 26.6μg, 高于新鲜标本（19.4μg/mm3）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织 DNA 均显示由于重复 DNA 序列存在所产生的特征性卫星带，说明 DNA 被完成消化。Southern 印迹杂交结果与冰冻组织一致。

Sato 等（1990）用 AMex 方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量 DNA 完好无损。其基本方法为：将组织放至 4℃丙酮浸透，移至 -20℃过夜。然而再用丙酮分别在 4 ℃和室温脱水各 15min，苯甲酸透明两次，每次 15min，最后 60℃真空浸蜡 2～3h，石蜡包埋。结果显示，每 10mg AMex 法处理的湿重组织提高分子量 DNA71.4±14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±13.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示 AMex 法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于 DNA 降解、高分子量 DNA 减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的 DNA 保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。

2．固定时间对 DNA 的影响 固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与 DNA 几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响 DNA 提取的效率。如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而，Goelz 等没有发现固定时间对 DNA 提取质量的明显影响。Dubeau 等认为组织固定时间太短或太长均会导致 DNA 的降解。该作者对固定 12h 到 5 天不同时间间隔标本的 DNA 提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量 DNA 明显减少。固定 5 天后可螺旋化 DNA 提取率仅有 8%。Warford 等也发现单细胞悬液经 30min 福尔马林固定后，DNA 产量减少到 30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据 Dubeau 等经验，常规组织固定应在 12h 以上至 110 之内。

3．固定温度等其他因素对 DNA 的影响 核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下 DNA 双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；加热到 65℃时，氢键开始断裂；约 90℃时，产生两条单链分子。在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制 DNA 冷却后的再复性。

最近，Koshiba 等发现福尔马林固定过程中的 DNA 降解，是由于固定温度高，pH 低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善 DNA 保存。

酸性环境中 DNA 的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致 DNA 的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。当 pH 达到 2.5 以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使 DNA 双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现 N - 糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的 DNA 变性。然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下 DNA 亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解 DNA。福尔马林中 DNA 降解的机理及其预防有待于进一步研究。

4．组织处理过程 对 DNA 的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的 DNA，其大部分分子量在 100bp～1000bp 之间，主要分布于 100～1500bp，仅约 1 / 3 的组织所提取 DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的时间长短不一。虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的 DNA 大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存 10 年以上的标本所获得的 DNA 分子量大。可能蜡块中仍存在导致 DNA 降解的因素。

组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致 DNA 变性，而产生单链 DNA 片段。单链 DNA 不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。

三、提高 DNA 提取质量的方法1．蜡块的选择 从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量 DNA 的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在 DNA 提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。

2．DNA 提取方法 学的改善为了提高石蜡包埋组织 DNA 提取的质量和效益，人们从不同方面进行了探索。其中在 DNA 提取液的改良，蛋白酶的消化时间和 DNA 纯化等问题上取得了进展。①DNA 提取液主要含 SDS 和蛋白酶 K 的 TE 缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得 DAN 与蛋白质不易分离。因此，必须增加 SDS 和蛋白酶 K 的浓度和作用时间：SDS 可增至 1%～2%，蛋白酶 K200～500μg/ml，最高可达 1mg/ml；作用时间一般为 2～4 天，最长可达 7 天。蛋白酶 K 可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba 等发现，利用 Goelz 等和 Dubeau 等提出的 DNA 提取方法，不能够得到令人满意的完整 DNA。尿素和胍（guanidine）是 DNA 自然和人工交联最有力的剥脱剂，2- 巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对 DNA 提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和 2 - 巯基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得高质量 DNA。②DNA 释放率对于不同的组织类型是有差异的，取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过 24h 孵育 80% 以上 DNA 可释放出来；相同量的 DNA 释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要 6 天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA 释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织 DNA 提取，蛋白酶 K 的孵育时间可作适当调整，以求最大量地获取大分子 DNA。此外，对于 Dubeau 等提出的 DNA 提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。③Dubeau 等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的 DNA，可通过搅起完整的 DNA 而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在 DNA 纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化 DNA 的量，杂交分析显示，螺旋化 DNA 杂交信号强，而未螺旋化 DNA 信号减弱。因此，增加 DNA 螺旋化可提高提取 DNA 质量和杂交效率。但是，Moerkert 等认为未螺旋化 DNA 不影响进行点杂交分析。

3．避免 DNA 机械性损伤 福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切成 3～5μm 薄片，使每一细胞都被切开。但是，我们认为切片太薄，容易过多地将 DNA 切断，影响高分子量 DNA 的获得率。最好是采用 15～20μm 的厚切片。高浓度蛋白酶 K 消化 2～4 天，使能达到细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的 DNA 剪切。

此外，在 NDA 释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的 DNA 剪切。纯化 DNA 用 TE（pH8.0）溶解放 4 ℃保存即可，若短期不用时应 -20℃冻存，但切忌反复冻融，以免 DNA 降解。

四、石蜡包埋组织 DNA 分析的方法学由于 DNA 提取方法的改善和 DNA 质量的提高，几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织，但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern 印迹杂交和多聚酶链反应（PCR）。

1．点杂交 鉴于包埋组织 DNA 有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法，特别适用于较大样本的筛选。Dyall – smith 等（1988）采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜，进行点杂交分析，在 3 周内对 200 多病例进行筛选，对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂交等方法作进一步证实。

2．Southern 印迹杂交Southern 印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变，扩增、重排和丢失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的 Southern 印迹杂交分析有以下几个方面值得注意：

（1）当所分析的酶切片段长为 300～500bp 时，包埋组织 DNA 杂交信号强度只有相同量标准 DNA 的 10%～85%。信号强度与原始 DNA 大小呈正相关，最小片段 DNA 产生最弱的信号。

（2）包埋组织 DNA 所致的非特异性背景杂交比标准 DNA 为明显。这种背景杂交的产生可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段 DNA 存在。

（3）由于背景杂交明显使得信号模糊，信 / 噪比缩小。根据 Goelz 的经验，约有 25% 石蜡包埋组织不适于作 Southern 印迹杂交。

（4）某些限制性酶切片段的电泳速度比标准 DNA 稍迟缓。可能的原因是 DNA 直接或间接的化学改变使某些限制性酶切位点失活和 / 或单链 DNA 存在。

（5）由于小片段 DNA 的存在，故用作杂交分析的 DNA 量应适当增加，以增强杂交信号。

3．PCR 分析PCR 技术是近年来分子生物学技术的典范，已被广泛地用于分子病理学的各个领域。此技术不但特异性好和敏感性高，而且简便、快速、模板 DNA 要求不高，特别适于石蜡包埋 DNA 的分析。

用于 PCR 扩增的 DNA 提取比较简单，既使少量 DNA 样品亦能产生大量特异性 DNA 拷贝。已被成功地用于各代木乃伊 DNA 的分析，小至 1mm2的 HE 染色切片提取的 DNA 亦可获得满意的扩增，并可用于诊断。但是，为了提高 PCR 的敏感性和可重复性，模板 DNA 应尽可能地纯化，除去提取物中某些抑制 PCR 反应的成份。

此外，切片过程中要注意防止污染，以免出现假阳性。

最近，Davis 等（1993）对 PCR 产物进行单链构型多态性（SSCP）分析，可以提高 PCR 敏感性 5 倍以上。SSCP 分析是应用单链 DNA 在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳，根据序列的不同所产生的构型差异来分析 PCr 产物。此分析能检测出小到一个碱基的差异，因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性。

此外，在包埋组织的 DNA 提取中往往发现有 RNA 的存在。这些未加任何保护而免受降解的 RNA，不可能是完整的序列。然而，此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为 Northern 印迹杂交分析的可能材料来源。

五、分子病理学研究中的应用1．基因重排分析与淋巴瘤的诊断 分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用，目前仅限于淋巴瘤 / 白血病。淋巴瘤以具有特异性抗原受体基因重排的单一性细胞增殖为特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig）和 T - 细胞受体（TCR）基因重排的检出可作为淋巴瘤诊断的重要指标，这在国外许多实验室已成为常规诊断技术。

Southern 印迹杂交和 PCR 都已被成功地用于基因重排分析。此技术在下列病变的诊断和鉴别诊断中特别有意义：①恶性淋巴瘤与反应性淋巴组织增生的鉴别。后者为多克隆性细胞增生，不能检出或扩增出克隆性基因重排序列；②T 和 B 细胞性肿瘤的区分：PCRβ 基因重排支持 T 细胞源性，而 Ig 重链基因则为 B 细胞源性。然而，一部分病例显示 Ig 和 TCR 基因双重排。在这种情况下，要结合其他基因分析。若同时伴有 Ig 轻链（K 或人）基因重排则支持 B 细胞肿瘤；同时伴有 TCRr 或 TCRs 基因重排则为 T 细胞肿瘤。另外，也可结合免疫分型。双基因重排的肿瘤往往一种基因为不完全重排、不伴有相应的抗原受体表达，故免疫表型上往往是单一的。③T 细胞性淋巴瘤的诊断，T 细胞肿瘤形态变化多端、免疫表型上无克隆性标记，故对此类淋巴瘤均有必要进行基因分型。④T 细胞优势性 B 细胞淋巴瘤。这种肿瘤在形态和免疫表型上很难建立诊断。⑤残留病变监测和复发的早期诊断。此技术还可用于识别骨髓的累及、治疗或骨髓移植后残余病变的检测，以及形态学上不能察觉的早期复发的诊断。

某些淋巴瘤 / 白血病所伴有的特异性染色体易位是另一种类型的基因重排标记。例如滤泡型淋巴瘤中常出现的 t（14：18）易位，Burkitt 氏淋巴瘤的 t（8：14）、t（8：2）和 t（8：22）易位，以及慢粒或急淋白血病中常见的 t（9：33）易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出现频率不高，故诊断应用价值不大。

2．癌基因与抗癌基因的研究 分子生物学在肿瘤病理学中另一热点是癌基因和抗癌基因的研究。自从 1981 年 Weinberg 等首先报道人癌基因分离成功以来，至今已有 50 多种癌基因被发现，这些基因普遍存在于各种生物细胞中，对于细胞的生长和分化起着重要作用。在正常情况下，其表达受到严格调控；病理状态下，癌基因活化，表达失控，使细胞原有的正常生物学性状发生改变，从而导致细胞癌变。据报道，癌基因的结构和功能改变见于造血系统、乳腺、粘膜鳞状上皮、前列腺、肺、肾、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神经系统和软组织等肿瘤。

另一类基因称抗癌基因或抑癌基因，现已发现的有 p53、Rb、DCC、WT1和 NF1等。其蛋白产物的功能是阻滞癌基因所编码多肽的活性。因此，如果抗癌基因发生突变或功能丧失，异常的癌基因产物表达失控，而诱发细胞转化为肿瘤。此现象为见于视网膜母细胞瘤、子宫内膜、结肠、食管等各部位的肿瘤。

目前，对人类肿瘤中癌基因和抗癌基因的检测，已经在肿瘤的分类、发病机理、肿瘤生物学行为和预后的关系等方面与肿瘤临床密切结合起来，并正在逐渐地应用于肿瘤的诊断、鉴别诊断和治疗。

（1）癌变机理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用。已有大量证据表明，至少需要两种以上的癌基因活化的协同作用才能使正常细胞发生恶性转化。目前研究发现绝大多数肿瘤有一种以上的癌基因过度表达，一种癌基因对靶细胞的永生化起重要作用，而另一种则促进细胞的永生化。

（2）肿瘤生物学待业和预后的研究：某些癌基因突变及其产物的过度表达与癌细胞的分化和恶性程度有关。目前研究最多的是 c –erbB –2 与乳腺癌的关系。许良中等（1992）发现，浸润性导管癌中 c – erbB –2 阳性表达率达 67% 以上，单纯癌阳性率为 26.5%，而全部乳癌良性病变皆阴性。我们的研究发现，c –erbB –2 过度表达的乳腺癌预后不良，Schimmelpenning 等（1992）也报告伴有 c –erbB –2 扩增的导管内癌易于发生周围浸润。此外，ras P21 在乳腺癌中的表达也有上述趋势。

（3）辅助诊断和鉴别诊断：bc1- 2 基因已被用于滤泡型淋巴瘤与反应性滤泡增生的鉴别诊断，前者阳性表达率在 80% 以上，而后者几乎为阴性；ras 癌基因突变或过度表达有助于甲状腺乳头状癌、乳腺导管癌、结肠腺癌等肿瘤的诊断；小细胞肺癌常伴有 n –myc 突变。

（4）癌细胞的组织发生：paget 氏病可分乳腺外（EPD）和乳腺内（MPD）两种。有关 paget 细胞的起源问题仍有争议。许良中（1993）观察了 c –erbB –2 和 p53 在 77 例 EPD 和 10 例 MPD 中的表达，认为 MPD 中的 paget 细胞是来源于腺癌细胞而不是表皮的角质层细胞。EPP 中的 paget 细胞也来源于腺癌细胞，但这种腺癌细胞与 MPD 中的腺癌细胞不同，因为两者基因表达不同。

3．遗传病的基因诊断 遗传病的回顾性家族调查，可通过石蜡包埋组织完成。Mueller 等描述 1 例怀疑囊性纤维化（CF）的死婴，石蜡包埋组织是唯一的材料来源。应用 CF 基因标记引物，对患儿和其父母的 DNA 分别进行 PCR 扩增。扩增产物用相应内切酶消化并检测限制性片段多态性。结果显示父母和患儿在同一位点上有意义，表明患儿遗传有突变型 CF 基因，最后证实了 CF 的诊断。

另一种常见的遗传病–肌营养不良症（DMD），是由 Dystrophin 基因的 DNA 序列畸变引起。Forstboefel 等用该基因的已知编码 DNA 序列，从一死婴尸检组织中得到的 DNA 进行选择性 PCR 扩增。结果发现 DMD 基因的一关键部分缺失，进而证实了 DMD 的诊断。同样可通过亲代 DNA 分析，区分遗传性或散发性缺失。

4．病理微生物的检测 核酸杂交和 PCR 技术对病原微生物的检测亦具有独到之处，除其特异性和敏感性极高外，还可适用于石蜡切片等多种材料，且可避免因培养造成的病原扩散。特别是一些原位杂交和 PCR 诊断性试剂盒的问世，使此项检测更加简便易行。因此，分子生物学将是传染病实验室诊断技术的发展方向。这方面的应用已有很多报道，本节 不再赘述。

5．组织来源的鉴定PCR 可用于选择性扩增一部分 HLa–DQa 基因，这部分是人类基因组中高度多肽性的位点。DNA 序列微小的个体差异，可被特异性 cDNA 探针区分。此基因在人群中的正常变异是有图谱的，故可将其用作“基因指纹”来验证组织来源。在日常工作中偶尔遇到标本的标记错误，当观察组织切片，发现与临床资料不匹配时才被发现。Shibata 等通过分析石蜡标本 DNA 中 HLa–DQa 位点解决了这一难题。另一高度多肽性的基因 - 低密度脂蛋白受体基因，亦可同样用于标本的鉴定。

Dubeau 等发现提取 DNA 的甲基化类型是恒定的，包埋组织仍保留其原有的特异性甲基化特征，籍此可有助于识别某些肿瘤的起源组织。

综上所述，石蜡包埋组织 DNA 的提取扩展了分子生物学技术在临床上的应用范围。虽然现在回顾性 DNA 分析仅用于确定少数特异性诊断，但随着越来越多的感染性病原基因、特异性肿瘤基因和遗传病基因的识别和克隆，相信不远的将来基因诊断的应用范围会进一步拓宽，分子杂交等基因分析技术将会在病理学诊断和研究中发挥越来越重要的作用。

（张建中）

参考文献1．吉昌华. 特异单引物法标记高活性 DNA 探针. 第四军医大学学报.1991：12：62～85

2.Sambrokk J, Fritch EF, ManiatisT.Molecular Cloning –a laboratory Manual. 2nd. ed , Cold Spring HarbourLabortory Press, 1989

3. Cox KH, Deleon DV, Angeres LM,et al. Detection of mRNAs in sea urchin embryosby in situ hybridization usingasymmetric RNA probes. Dev Biol, 1984；101：485～489

4. Herrin DL, Schmidt GW. Rapidreversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques.1989；6：196～201

5. Khandjian EW. Optimizedhybridization of DNA blotted and fixed to nitrocellulose and nylon memdranes.Bio/Technology. 1987；5：164～170.

6.White BA, Bancroft FC.Cytoplasmic dot hybridization.Simple analysis of relative mRNA levels inmutiple small cell or tissue samples . J. Biol Chem. 1982；257：8569

7. Williams DL, Newman TC,Shelness CS, et al. Measurement of apolipoprotein mRNA by DNA –excess solutionhybridization with single –stranded probes. Methods Enzymol. 1986；128：671

8. 侯云德, 主编. 病毒基因工程原理与方法.P159～166. 人民卫生出版社,1985；第 1 版, 北京

9. Schleif RF & Wensink PC.Practical methods in molecualr biology. Springer –Verlag. 1981

10. 林万明, 主编. 医学分子微生物学进展. 第一集(上, 下册). 中国科学技术出版社,1991, 北京

11.Mallet F. Enzyme –linkedoligosorbent assay for detection of immumodeficiency virus type 1. J ClinMicrobiol. 1993；31：1444～1449

12. Hall GS. Probe technology forthe clinical microbiology laboratory. Arch Pathol Lab Med 1993；117：578～83

13. 林万明, 主编, 核酸探针杂交实验技术. 中国科技出版社,1991；北京

14. Hajra A. Detection of humanDNA mutations with nonradioactive, allelespecifc oligonucleotide probes.Pharmacogenetics, 1992；2：78～439

15.Ogilvie AD. In situhybridization . Ann Rheum Dis. 1990；49：434～439

16. Levenson C, Watson R, SheldonEL. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridizationprobes. Methods Enzymol, 1990；184：577～583

17. Tenover FC. DNA hybridizationtechniques and their application to the diagnosis of infectious disease. InfectDis Clin North Am 1993；7：171～181

18. Landry ML. Nucleic acidhybridization in virol diagnosis.Clin Biochem 1990；23：267～277

19. Jackson P, Dockey DA, LewisFA, et al. Application of lnm gold probes on paraffin wax sections for in situhybridization histochemistry. j Clin Pathol 1990；43：810～812

20. Guesdon JL. Immunoenzymatictechiques applied to the specific detection of nucleic acids. A review. JImmunol Methods. 1992；150～49

21. Bush CE, Nichele LJ, PetersonWR, et al. Solid –phase time – resolved fluorescence detection of humanimmunodeficency virus polymerase chain reaction amplified products. AnalBiochem 1992；202：146～151

22.Cano RJ, Torres MJ, Klem RE,et al. DNA hybridization assay using ATTO PHOS, a fluorescent substrate foralkaline phosphatase.Biotechniques. 1992；12：264～269

23. Kallioniemi A, Goldstein F,Smith AR, et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogeneticanalysis of soid tumors.Science. 1992；258：(5083)：818～821

24. Terouanne B, Chung J –L,Williams S, et al.Quantitative and qualitative annalysis of amplified DNAsequences by a competitive hybridization assay. Anal Biochem. 1992；205：193～199

25. Marechal D. A subtractivehybridization method to isolate tissues – pecific transcripts application tothe selection of new brain ╟ specific products. Anal Biochem 1993；208：330～333

26.Goelz SE, Hamilton SR,Vogelstein B. Purification of DNa from formaldehyde fixed and paraffin embeddedhuman tissue. Biochem Biophys Res Commun. 1985；130：118

27. Debeau L, Chandler LA, GralowJR, et al. Sorthern blot analysis of DNA extracted from formalin – fixedpathology specimens. Cancer Res. 1986；46：2964

28. Mies C, Houldsworth J,Chaganti RSK. Extraction of DNa from paraffin blocks for Southern blotanalysis. Am J Surg Pathol, 1991, 15：169

29. Sato Y, Mukai K, Matsuno Y,et al. The AMeX method：a multipurpose tissue – processingand paraffinembedding method. II.Extraction of spooled DNA and its applicationto southern blot hybridization to southern blot hybridization analysis. Am JPathol. 1990；136：267

30. Mu AM, Ben –Bzra J, WinbergC, et al. Analysis of antigen receptor gene rearrangements in ethanol and formaldehyde– fixed,paraffin embeded specimens, Lab Invest . 1990；63：107

31.Mies C. Molecular pathology ofparaffin – embedded tissue：currentclinical applications. Diagn Mol Pathol. 1992；1：206

32. Koshiba M, Ogawa K, Ogawa O,et al. The effect of formalin fixation on DNA and the extraction of high –molecular weight DNa from fixed and embedded tissues. Path REs Pract . 1993；189：66

33.Bramwell NH, Burn BF. theeffects of fixative type and fixation time on the quantity and quality ofextractive DNA for hybridization studies on lymphoid tissue. Exp Hematol. 1988；16：730

34. 张建中晏良遂白炎, 等. 基因重排分析在淋巴瘤诊断中的应用. 中华医学杂志,1988；16：730

35. Davis TH, Yockey CE, Balk SP.Detection of clonal immunoglobulin gene rearrangements by polymerase chainreaction amplification and sinle – strand comformational polymorphism analysis.Am J Pathol, 1993,142：184

36. Wick MR. Oncogene analysis indiagnostic pathology：a current perspective. Am J ClinPathol, 1992；97：S1

37. Furcht LT, McGlennen RC. Theemerging role of molecular diagnositics in surgical pathology, 1992；23：1197

38. Sukpanichnant S, Vnencak–Jones CL, McCurley TL.Detection of clonal immunoglobulin heavy chain generearrangements by polymease chain reaction in scrapings from archival H –Estained histologic section.Diagn Mol Pathol, 1993；2：168

39. 张建中. 分子杂交技术在淋巴瘤诊断中的应用, 国外医学肿瘤学分册,1988；15：97

40. 桂开林张建中. 甲状腺肿瘤的 rasp 21 表达的免疫组化观察. 中华医学杂志,1990, 70：140

41. Wang Boyun (王伯沄),Li Yunsong (李云松),et al.Genetic identification for routine diagnosis of HBV by Dot – blot hybridization.Chinese Med J, 1993；106 (7)：550～551

第十九章 核酸（基因）分子探针第一节 概述从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。探针和靶的相互反应如抗原 - 抗体、血凝素 - 碳水化合物、亲合素 - 生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。此方法用于疾病的诊断，称为分子杂交基因诊断。此法开始用于遗传性疾病的诊断如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断。近来，已发展为诊断外源性病原体如病毒、细菌、原虫等的方法；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；人类基因识别及其生理功能和衰老有关研究；在法医检测中有关性别鉴别和 DNA 指纹谱的鉴定。基因探针的研究引起了人们高度重视，在探针的制备技术上有重大突破。可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。据美国华尔街分析家预言：“在生物技术市场中，下一个突破和具有吸引力的是基因探针”。它的巨大的开发潜力和经济效益，已引起人们的重视。

目前基因检测方法中以同位素标记（32P、35 S 等）DNA 探针灵敏度最高，但由于放射性污染、半衰期短、需要特别的安全防护条件等，限制了同位素标记探针的广泛应用。因此，非同位素标记探针的研制引起重视，自 Langer 等（1981）合成了生物素化 dUTP 和 NTP 类似物以来，开创了用非同位素标记的新领域，用生物素标记核酸探针检测和识别特定的核酸序列，已广泛应用于临床检验和科学研究。Leary 等（1983）用缺口平移法标记的生物素 DNA 探针成功地用于 Southern 印迹杂交技术。Forst 等（1985）发表了光敏生物素直接标记核酸的简便方法，使核酸和蛋白质的生物素标记探针技术前进一大步。Renz 等（1984）、Thorpe 等（1985）和 Pollars、Knight 等（1990）用化学法直接把辣根过氧化物酶接到 DNA 上，运用发光显影法提高了敏感性。Muh-legger 等（1990）用地高辛（Digoxigenin）标记 DNA，再用地高辛抗体连接碱性磷酸酶，催化发光底物金刚烷脱磷并发光，灵敏度与32 P 标记探针相同，而且32P、标记的 DNA 探针杂交膜需要在 -70℃件下曝光 4～7 天于 X 光片上显影，碱性磷酸酶发光法只需 10～30min，十分快速、简便。

基因诊断的被检测基因或目的基因存在于样品中，先将样品中核酸提取出来，或在原位，或将样品点在硝酸纤维素滤膜上，再经蛋白酶处理，或酶切成较小的片段，经变性处理（热或碱变性）成单链。另一方面制备已知核酸序列标记的核酸分子探针，也经变性成单链。根据核酸链之间碱基配对的原理，将此核酸探针与样品中核酸单链结合成双链核酸，即称分子杂交。被检样品形成杂交双链，显示阳性结果。如样品无与探针互补的序列，则不发生分子杂交，结果为阴性。这种技术用于诊断要依靠基因探针，可见基因探针是基因诊断中的关键性试剂。

核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，多用32PdNTP、3HdNTp、35SdNTP 等。用放射性同位素标记核酸有以下优点：

（1）灵敏性高：一般可达到 0.5～5pg 或更低浓度核酸的检测水平，可以检测极少量或拷贝数少的基因组（可延长曝光时间或增敏屏增敏）。

（2）特异性高：用放射自显影法，样品中存在的无关核酸或非核酸成分不会干扰检测结果，准确率高，假阳性率低。

（3）方法简便。所以，放射性同位素标记核酸探针在一些有条件的单位，作为主要的标记方法仍在使用。

放射性同位素标记技术也存在以下缺点：

①半衰期短，必须经常标记探针：如32P、半衰期只有 14.3 天，放射强度逐日变化。35 S 的半衰期可达 88 天，但衰变能量只有32 P 的 1 /10，灵敏度较低，只能用于多拷贝基因的检测。3 H 的半衰期虽长达 12.26 年，但衰变能低，灵敏度太低。

②费用高：α-32 P 标记的 dATP（400Ci/mmol），需要进口试剂，价格高。

③检测时间长：用放射自显影需要较长的曝光时间（1～15 天）。

④放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染，放射性废物处理困难。因此，推广使用受到限制。

所以研究非放射性标记核酸探针及其检测显示方法、为推广应用基因诊断创造有利的条件，已成为 80 年代以来各国十分重视的研究目标。这项技术属生物高技术中发展很快、前景很大的项目。美国科学家于 1981 年首先合成了生物素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，他们采用缺口平移制成生物素化核酸探针，成功地用于探测一系列基因。随后美国的 BRL 和 Enzo biochem 生产了这种生物素标记探针及分子杂交成套试剂盒。1985 年澳大利亚合成了光敏生物素，用于直接标记核酸，这是 Adelaide 大学 Forest 等学者的重大成功。该大学的 Bresatec 公司和美国的 Vector 实验室，先后完成了配套试剂盒。1988 年西德 Boehring – Mannheim 公司研制成功地高辛（半抗原）- 抗体 - 酶法基因探针试剂盒。1989 年我国军事医学科学院马立人教授等合成光敏生物素并研制成功光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒。至今，在国内外市场上已有多种商品化非放射性标记核酸探针试剂盒供应。

利用核酸探针杂交技术比用免疫学抗原抗体技术有更高的特异性和敏感性等优点，已显示出巨大的发展潜力。许多核酸（基因）探针已直接用于基因检测，疾病诊断和病因研究。正在迅速发展的基因诊断更需要制作各种基因探针。因此，学习和研究制备核酸探针技术象制备各种单克隆抗体探针一样已成为 90 年代大力发展的高技术，也是分子医学发展的热点之一。

核酸探针制备技术包括目的基因的制备，放射性同位素标记或非放射性标记，标记核酸的纯化、鉴定、分装、贮存等。本文介绍常用核酸探针的制备技术，供初学者参考，更详细的了解请参考有关专著。这项技术正在发展中，新方法不断出现，要密切注视文献进展。

第二节 核酸（基因）探针目的核酸的制备技术一、特异性目的核酸（或基因）的制备核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备：

（1）直接分离基因核酸：即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。

（2）化学合成基因核酸：即以单核苷酸为原料，以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚，分子量较小的寡核苷核。

（3）酶促合成核酸：在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以 mRNA 为模板，利用逆转录酶合成单链 cDNA，再以大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 合成双链的结构基因。

（4）RNA 探针。

二、目的核酸的扩增在获得特异的目的基因后，可用以下方法大量扩增制备：①用体外 DNA 重组技术与载体 DNA 相连，转化至大肠杆菌中进行无性繁殖。以氯化铯超速离心纯化重组质粒 DNA，并以合适限制性内切酶消化，经凝胶电泳制备回收特异的目的核酸片段。②聚合酶链式反应（Poly-merase chain reaction, PCR）扩增技术：利用这种先进技术能简便快速制备大量特异性目的核酸片段。PCR 技术的基本原理是利用 DNA 聚合酶依赖于 DNA 模板的特征，在体外用一对和欲扩增 DNA 片段的两侧序列互补的引物诱发聚合反应，即双链 DNA 先高温变性，然后在低温下与引物退火，再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应，重复这种循环反应可使 DNA 获得指数性倍增，例如经过 35 个循环反应，DNA 可扩增 1×108倍以上。

第三节 放射性同位素标记核酸探针最常用的同位素是 α -32PdNTP,3HdNTP, 及35SdNTP，多用缺品平移法、末端标记法，随机引物延伸法和反转录标记法。在以 mRNA 制备 cDNA 时，同时掺入标记的脱氧核苷酸，制出 cD-NA 标记探针。

一、缺口平移法在适当的浓度的 DNase I 作用下在一双链 DNA 上制造一些缺口，再利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同时将四种脱氧三磷酸核苷（其中一种用放射性标记）利用该酶 5’—3’聚合活性补人缺口，使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。此法也适用于探针的非放射性标记。如 32 P 标记 DNA 探针（缺口平移法）：反应体积为 25μl，内含 0.3μgDNA 片段，4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×106Bq [α-32P]dATP,1μl2 万倍稀释的 DNA 酶和 2μl DNA 聚合酶 I，6μl 缓冲液[为 50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO4、1mmol/ L 二硫苏糖醇（DTT）和 50μg/ml BSA]，反应在 14℃ 进行 3h。标记 DNA 经 Sephadex (G-50)柱层析回收。

二、末端标记法在大肠杆菌 T 4噬菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将 γ -32P-ATP 上的磷酸连接到寡核苷酸的 5’末端上。要求标记的寡核苷酸 5’端必须带羟基。反应式为：

此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为 Bio –11 –dUTP，也可以在 3’端标记上一个生物素。

寡核苷酸35 S 的 3’—末端标记法：将下列液体依次加入 Eppendorf 管中。

寡核苷酸（1 pmol）1μl

10×Tailingbuffer 2μl

[α-35S]2μl

双蒸馏水 14μl

末端脱氧核苷酸酶 1μl（10Unit）

混合后，置于 37℃水浴中 1.5h。取出反应管放入冰水中 5min。加入下列液体：

TRNA(25mg/ml)3μl

1×TE(pH8.0)180μl

酚 100μl

CTAa100μl

充分混合 2min。离心 15000r/min 5min。将上清液（约 200μl）移入新的 Eppendorf 管中，然后加入下列液体：

4mol/ L 醋酸胺 100μl

100% 酒精 800μl

混匀，置冰浴中，15min。再 15000r/min 离心 10min，在管底可见一白色沉淀块（含 tRNA 及寡核苷酸）。吸去管中液体，然后加入 1000μl80% 酒精，混合 1～2min 同上离心，吸除酒精（勿破坏沉淀块），将管置于 40℃温箱中 5min。加入适量的 1×TE（pH8.0）及 0.5mol/l DTT 溶解沉淀。标记探针的最终浓度是 0.5ng/μl,DTT 的最终浓度为 20mmol/μl。取出 1μl 标记探针测定比放射性，应在 1.0×10dpm/μg 以上。保存在 -80℃中 1～2 个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。

三、应用特异单引物法标记 DNA 探针应用探针 DNA 上的一个片段作为 DNA 引物，以环化探针 DNA 的重组质粒 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下，通过变性，退火和延伸过程，使探针 DNA 得到标记。反应在 0.5ml 离心管内进行，总体积为 25μl，内含 50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl2、BSa 5mmol/L、80ng 引物 DNA 和 0.1μg 连接的 DNA 或 0.1μg 质粒。反应管在 95℃变性 5min，取出，稍离心，立即放入 37℃C 水浴保温 2min 使 DNA 退火，加入 1UE.coli DNA 聚合酶 I，在 37℃进行延伸反应。对环化基因，延伸 18min，对质粒 DNA 延伸 35min 重复上述变性、退火和延伸过程 1 次。

四、双引物法标记 DNA 探针法反应在 0.5ml 管内进行，反应体积为 50μl，内含 50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg-Cl2、10mmol/L β- 巯基乙醇和 500μg BSA/ml，引物片段 1 和 2 各 90ng，模板 DNA0.1μg,[α-32P]dCTp 1.5×106Bq，dATp、dGTP 和 dTTP 各 200μmol/L。标记反应包括 3 个步骤：

（1）变性：反应管在 95℃水浴 5min，然后离心；

（2）退火：37℃水浴 2min；

（3）延伸：加入 DNA 聚合酶 i 1u，37℃水浴 18min。重复上述变性、退火、延伸过程 1～2 次，分别进行其标记率测定：取 0.5μl 反应液分别点于两张滤纸片上，烤干。一张经 0.6mol/ L 三氯醋酸（TCA）、0.3mol/l TCA 依次洗涤，每次 10min，然后再用无水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗涤各 5min。两张滤纸分别放入闪烁瓶内，测定 cpm 值，达到 108cpm/μg DNA 以上。

五、聚合酶链反应（PCR）标记高活性 DNA 探针在 0.5ml 离心管内进行，反应总体积为 50μl，内含模板 DNA350ng,DNA 引物各 50pmol/L,dGTP、dCTP 和 dTTP 各 200μmol/L，[α-32P]dATp 1.1×106Bq，反应缓冲液为 67mmol/l Tris—HCl pH8.8 含 2.5mmol/l MgCl2、6.7mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/l β- 巯基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA 和 40μl/ml 二甲亚砜。将反应管置于 95℃水浴变性 5min 取出，加入 Taq DNA 聚合酶 0.5～2u, 在旋涡混合器上混匀简单离心一下，加入 35μl 石蜡油。放入 65℃水浴 2min，取出，立即进入 PCR 循环：91℃变性 30s,51。 C 退火 1min，68℃延伸 2min。重复上述过程 15 次。最后将反应管置 65℃水浴 5min。反应完成，加入酵母 tRNA10μg。分别测定参入和游离放射性计数，参入率为 97.4%。标记 DNA 探针经醋酸钠酒精沉淀回收。将沉淀溶于 10mmol/l Tris—HCl、EDTA(pH8.0)100μl。用 PCR 方法标记的 DNA 探针特异性高，敏感性好，可测出的最低靶 DNA 量为 10fg, 利用 PCR 还可以作 DNA 探针的非放射性标记。

第四节 非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。

酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素 -11-dUTP 掺入到探针 DNA 中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。

化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到 DNA 分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照 10～20min，生物素就结合在 DNA 或 RNA 分子上。

非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：

一、生物素标记核酸探针方法生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素 -11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的 5 位上，合成 TTP 或 UTP 的类似物。在离体条件下，这种生物素化 dUTP 可作为大肠杆菌多聚酶 I（DNA 酶 I）的底物掺入带有缺口的 DNA 或 RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在 DNA 上的生物素与链霉亲合素 - 酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

缺口平移法标记生物素 DNA 探针：在硅化 Eppendorf 管（放入冰浴中）加下列反应液：

待标记 DNA 0.1μg/μl 5μl

10×NTB 1μl

DNase I2pg/μl 1μl

消毒三蒸水 3μl 总体积达 10μl

混匀，37℃，15min。离心 10000r/min 1min 后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：

dNTP(ACG)0.5μg/ml2μl

Bio –11–dUTP 0.5μg/ml2μl

10×NTb 4μl

消毒三蒸水 31μl

混匀，短暂离心后，加入

DNA 聚合酶 I（5u/μl）1μl 总体积 50μl

混匀，14℃过夜（10h 以上），加入

终止液 2μl

经 Sephadex –G –50 柱分离，回收生物素标记 DNA。

10×NTB 配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl2；80mmol/L β- 巯基乙醇，500μg/ml BSA。

终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA 和 10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。

缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记 DNA 不超过 1μ.Bio –11-dUTP 要浓贮，分装，-20。 C 保存，反复冻融常会降解失活。Bio –11- dUTP 贮存液：10mmol/ L 即 100μg Bio-11-dUTP 中加入 11.6μl Bio-11 –dUTP 稀释液，分装成 3μl/ 支，-20℃保存。

地高辛 -dUTP 标记 DNA 也可按此法进行。

乙醇沉淀分离回收标记 DNA 比较方便，即加入 5μl4mmol/l LiCl,125μl 冷乙醇，混匀，-20℃放置 30min,12000r/min 离心 5min，去上清，用 70% 乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置离心管，晾干，用消毒三蒸水 5μl 溶解沉淀物（0.1μg/μl）-20。 C 保存。用 LiCl 可较好地分离 DNA 和可溶性核苷酸，因为 dNTPS 的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。

二、光敏生物素标记核酸探针光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与 DNA 或 RNA 的腺嘌呤 N—7 位置特异结合，大约每 50 个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于 200 个核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和 dUTP 等；只需光照，探针稳定，-20℃可保存 12 个月以上。适用于 DNA 和 RNA，抗体和酶等的标记。在原位分子杂交，斑点杂交和 Southern 印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有试剂盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。

方法步骤：在一灭菌 Eppendorf 管中加待标记 DNa 5μg/10μl，在暗室中加入 5μg/5μl 光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下 10cm 处照射 20min。加入 100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA10μl 混匀。再加入等体积仲丁醇，混匀。离心 1min（10000r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。再加入仲丁醇 25μl，重复提取游离的光敏生物素。吸去上层无色仲丁醇后，加入 5μl 3mol/ L 醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精 100μl 充分混匀，沉淀标记 DNA，置 -20℃过夜（或 -70℃15min）15000r/min 离心 20min，沉淀物再用 70% 乙醇洗一次，离心，抽干，溶于 0.1mmol/l EDTA 或 TE 中，测定探针浓度，分装，保存于 -20℃。

三、生物素 - 补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法生物素 - 补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到 DNA 中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链 DNA 或 RNA，及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法：取 DNA 或片段 0.5μg 加 50μlTE（pH8.0）缓冲液中，再加入 5μlg 生物素 - 补骨脂素，溶解后，置 365nm 紫外光下直接照射 20min，距离 5cm，加等体积 TE，移入用 TE 平衡的 Sephadex G—50 柱（高 1.0cm），离心法过柱，收集液体即为 Bio –DNA 探针。

四、生物素 -α- 氨基乙酸 -N- 羟基琥珀标记化学修饰的 DNA 法此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到 DNA 分子上而制成生物素化 DNA 探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出 DNA 和 RNA 中胞嘧啶 N - 4 位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导 C - 6 位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有 3%～4% 的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠 - 乙二胺混合液，两者混合液含量分别为 1mol/ L 和 3mol/l（pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为 1mg/ml。将 DNA 用超声打成 500～800bp 长度的片段，煮沸法变性，取 1 份 DNA 与 9 份上述混合液混合，42℃水浴 3.5h。用 5mmol/ L 磷酸钠缓冲液（pH8.5）在 40℃下充分透析，浓缩 DNA，再溶于 200μl 0.1mol/ L 磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入 4mmol/ L 生物素 -ε- 氨基乙酸 -N- 羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应 2h，用含 150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA 的 10mmol/ L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）在 40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。

五、缺口平移法标记生物素 DNA 探针（二步法）取 HBV 质粒 DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至 10μl，37℃，15min；加 5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP 各 2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至 10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至 49μl，DNA 聚合酶 i 5u，混匀，14℃过夜，加 0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl 终止反应。

已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5)150μl,2.5 倍体积的 95% 乙醇，置液氮中 15min 或 -20℃过夜。15000r/min，离心 10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。

使用闭环或线性双链质粒 DNA，或分离的双链 DNA 片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体 DNA。

此法也可用于放射性同位素和地辛标记 DNA 法。

六、生物素随机引物标记探针方法以 HBV DNA 为例。取 HBv DNA 质粒 0.5μg，随机引物（Pharmacia）2μg，用 TE（pH8.0）补足体积至 10μl；100℃，热变性 5min，骤冷 10min。加 10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2,10mmol/L β 巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l dATP/dGTP dCTP 各 1μl，按不同比例加入 Bio –11-Dutp, 和 dTTP，用三蒸水补足体积至 48μl，加 DNA 聚合酶（SABC）8u，混匀，37℃，2h，加 0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，终止反应。

在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的 Bio-11-dUTP/dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%）比值为 35% 时，其标记率最高，显色灵敏度达 0.2pg，杂交灵敏度为 1～2pg。二步法缺口平移标记 HBv DNA 探针，其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg 等（Focus,1992；14：21）证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的 dTTP，能增加 HBv DNA 探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。

七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针1988 年德国 Boehringer Manheims 公司推出了一种地高辛标记 DNA 检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至 dUTP 上，用随机引物法标记 DNA 制成探针。平均每 20～25 个核苷酸中标记一个地高辛甙元，然后用抗地高辛抗体的 Fab 片段与碱性磷酸酶的复合物和 NBt – BCIP 底物显色检测，灵敏度达 0.1pg DNA，因此可做 1μg 哺乳动物 DNA 中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性，安全稳定，操作简便，可避免内源性干扰，是一种很有推广价值的非放射性标记探针。

标记方法步骤：（1）取一小离心管（0.5ml）插入冰浴中，加入待标记 DNa 1μg/5μl，95℃变性 10min，迅速移入盐冰中 3min。加入六核苷酸引物 2μl，Dig-dNTP 标记物 2μl 和消毒双蒸水 10μl、大肠杆菌 DNA 聚合酶 i Klenow 片段 1μl(单位)。（2）短时离心，37℃孵育至少 60min（20h 以内）。（3）加入 2μl 0.2mol/L EDTA 溶液中止反应。再加入 2.5μl 4mol/L LiCl 和 75μl 预冷的乙醇（-20℃），放入 -70℃至少 30min 或 -20℃过夜。（4）离心（12000g）10min，弃上清，再加入 70% 乙醇（冷）40μl 洗一次，离心，抽干，再溶于 50μl TE 溶液（pH8.0）中，分装，-20℃存放备用。

八、光敏 2，4- 二硝基苯（光敏 DNP）标记 DNA 法光敏 DNP 由一连接臂组成，一端是 2，4- 二硝基苯，另一端有芳基叠氮化合物。此法适用于含氨基检测基团。其敏感性和光敏生物素标记探针相同，检测时需要抗 DNP 抗体和免疫化学显色。标记方法：（1）DNA 不心变性，必须溶于水中，取 2～10μg10μl，加入二甲亚砜 25μl，每微克 DNA 加入光敏 DNp 2μg（在避光条件下），混匀。（2）置入冰浴中，在特制灯 10cm 下照射 10min。（3）加入水 165μl，4mol/ L 醋酸钠 20μl 和异丙醇 50μl，混匀。（4）用 705 和无水乙醇沉淀各一次，晾干，按 50μg/ml 溶于 200μl 水中，如探针不溶时，可在 60℃水溶中加热 10min，离心 5min，除去不溶性杂质，分装，-20℃可保存 1～2 年。此法简便，不仅适用于核酸标记，也适用于蛋白质标记。

九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针在温和的条件下，TNBS 将核酸的胞嘧啶转化为 N - 甲氧基 -5，6- 二氢嘧啶 -6- 磺酸盐衍生物，对胞嘧啶残基进行磺化修饰制成磺化半抗原探针。此法十分简便，也可用于蛋白质的标记。标记方法：取变性单链的 DNA5μg，溶于 0.02mol/ L 硼酸钠缓冲液（pH8.6）中，加入 TNBS5μg 溶解，在室温中反应 1h。移入冰浴中，加入无水乙醇和 70% 乙醇各洗 1 次，晾干，用 50μl 消毒双蒸水溶解，分装，-20℃保存备用。

十、生物素化的 RNA 探针标记RNA 探针比 cDNA 探针的敏感性提高 10 倍以上，在许多优点。它们是单链，不需变性，也没有互补链的干扰，与靶基因杂交比 DNA 探针更稳定。Bio-11-dUTP 可通过 Sp6、T3和 T 7RNA 聚合酶掺入到 RNA 转录子中。标记方法：其下列反应体积为 50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/ L 亚精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/ L 每一 ATP、GTP、GTP，1mmol/ L 生物素 Bio-11-Dutp,500ng 模板，45u T3RNA 聚合酶。混合，37℃反应 1h。加入 10%SDS 终止反应。凝胶过滤分离标记 RNA 探针。

十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法此法标记原理如下图所示：

标记的 HRP 部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼氨基苯二甲酸

+N2+ 光→X- 光片上感光 10～20min 显定影。

光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。

这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在 X 光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当，简便快速，安全，是一种特异性好的检测手段，具有广泛的应用前景。

HBV-DNA 的 HRP 标记方法：质粒中插入 HBV 全基因组 DNA，长 3.2kb，载体为 PBR322 质粒，4.3kb。将质粒 DNA 用三蒸水稀释成 10ng/μl，取 20μl 放入 EP 管，100℃变性 5min，加入 20u HRP 标记试剂，混匀，加入戊二醛 20μl 混匀，37℃10min，此时可立即使用，或放在冰浴中 10～15min 内使用，或加入 50% 去离子甘油 -20℃保存供分子杂交用，可存放 6 个月。

十二、用聚合酶链反应标记高活性 DNA 探针聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的 DNA 序列两端的取向相对的 DNA 引物，在 DNA 聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶 DNA 序列。在标记 dNTP 存在时，经 PCR 反应产生的靶 DNA 片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达 97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板 DNA 的纯度，可以大量制备。此法有普遍应用价值。

标记方法如下：待标 DNA 模板 1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/LMgCl2dATP、dCTP、dGTP 各 200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各 1μmol/L，明胶 200μg/ml，2u Taq DAN 聚合酶，总反应体积为 100μl。混匀后，加石蜡油封顶，94℃和 55℃各 2min，72℃3min，经 25 个循环后，可产生 5～10μg 标记探针，需时仅 4h。乙醇沉淀扩增的产物后，溶于 100μl TE 中，分装 -20℃。

第五节 寡核苷酸探针的制备利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制备寡核苷酸探针（如 15～50bp），这类探针具有以下优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链 DNA 探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小 DNA 片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

因此，寡核苷酸探针的研究，对于提高核酸杂交技术的特异性和敏感性，扩大应用范围有重要意义。

常用的寡核苷酸探针有 3 种：①特定序列的单一寡核苷酸探针；②较短的简并性较高的成套寡核苷酸探针；③较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。多用 32 P 标记寡核苷酸探针，如：1）通过 T 4 噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸探针，在合成寡核苷酸时期 5’端缺少一个磷酸基，因而易用 T 4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应，而将 α -32 P 从 [γ-32P]ATP 转移至其 5’端。这种磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32 P 原子。2）用大肠杆菌 DNA 聚合酶 i Klenow 片段标记合成的寡核苷酸探针，其比活性更高，每一寡核苷酸分子可带有若干个放射性原子，放射性比活度可高达 2×1010 计数 /（min·mg）。

附图 DNA 聚合酶 i Klenow 片段标记合成寡核苷酸探针

寡核苷酸探针的非放射性标记时，可用以下几种方法：

1．酶延伸法合成与探针目的基因的 3’- 端一段互补的寡核苷核序列，此序列的 5’- 端多加一个 A，与目的基因片段退火，再用 Klenow 酶延伸，使 bio –dUTP 掺入探针的 3’末端。

2．5’磷酸末端标记法带 5’- 磷酸的寡核苷酸探针，在咪唑缓冲液中用水溶性碳二亚胺（EDC）处理，可生成活性的磷酸咪唑中间体，与过量的乙二胺作用，就可以引入一个带氨基的接臂。用活化生物素标记就可以得到 5’- 磷酸标记的寡核苷酸探针。

3．酶标探针法用双功能联接剂如辛二酸双羟基琥珀亚胺酯联接寡核苷酸和碱磷酶，可以生成 1：1 的酶标寡核苷酸探针。此法省略了生物素 - 亲合素中间步骤，可减少非特异性反应。

4．生物素酰肼胞嘧啶修饰法在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探针。

5．寡核苷酸的酶促加尾标记法在末端转移酶的作用下，用非放射性物质修饰的核苷酸（生物素 dATP；生物素 -dUTP；地高辛 -dUTP）可加到 DNA 的 3’末端，每个探针 DNA 可加上 10～20 个修饰碱基。

（1）取 -0.5ml 硅化塑料离心管，插入冰浴中，加入寡核苷酸（3pmol）×μl，5×加尾缓冲液 20μl，5.0mmol/l dUTP 4μl（终浓度 200μmol/L），修饰的 dNTP（生物素 -dUTP；生物素 -dATP；地高辛 -dUTP）×μl（终浓度 100μmol/L），加入至 100μl，混匀后加入末端转移酶 5u。37℃反应 1h。

（2）探针纯化：乙醇沉淀法：加入 50μg tRNA，15ul 4mol/ L 醋酸钠和 375μl 无水乙醇，混匀，-20℃1h，高速离心 10min，弃上清，用 70% 乙醇和无水乙醇再反复洗沉淀，晾干，再溶于水中，浓度为 500ng/ml。

常用试剂配制方法[见附录二“（四）关于探针的标记”部分]。

参考文献1．Forst AC, et al. Non- radioactivehybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with a novelreagent, photobition. Nucl Acids Res, 1985；3：745～761

2.LawrenceJB, Singer RH. Quantitive analysis of in situ hybridization methods for thedetection of actin gene expression. Nucl Acid Res, 1985；13：1777

3.WangBoyun (王伯沄),et al. Photobiotin HBV- DNAprobe for routine diagnosis of hepatitis B virus in dot blots. Interantionalsymposium on Viral hepatitis and Aids, 1991；1：14～18,Proceedings A038, Beijing.

4.PeterSD, et al. Fale -positive results with hepatitis B virus DNA dot –hybridizationin hepatitis B surface antigen – negative specimens. J Ciln Microbiol, 1986；23：297

5. 白薇 静国忠. 应用点杂交技术对乙型肝炎病毒基因组进行定量分析. 中华微生物学和免疫学杂志,1990；10：174

6. 马立人刘耀清. 光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒使用说明. 军事医学科学院放射医学研究所,1989：6

7. 马风林. 生物素标记核酸探针技术. 生物化学与生物物理进展,1989；16(27)：15～17

8. 王伯沄, 李玉松. 核酸探针标记和检测技术的进展. 中华流行病学杂志,1997；18(3A)：37～42

9. 张立农, 等. 半抗原 Digoxingenin 标记 HBv DNA 探针的制备及临床应用. 中国人兽共患病杂志,1990；6(3)：9～12

10.AmoldusEPJ, et al. Feasibiligy of in situ hybridization with chromosome specific DNAprobes on paraffin wax embedded tissue. J Clin Path, 1991；44：990～904

11. 蒋三亮张思仲. 用地高辛配基标记 DNA 探针检测人类基因单拷贝序列. 遗传与疾病,1991；8(17)：4～6

12. 吴玉涛方勤. 核酸分子探针制备技术新进展. 国外医学：分子生物学分册,1989；3：101

13. 刘钟镔. 应用免疫学方法的核酸探针 - 抗杂交体和半抗原核酸探针. 国外医学：免疫分册,1989；5：29

14.NoveGJ, et al. Detection of human papilloma virus DNAin Formalin –fixed tissues byin situ hybridization after amplification by PCR. AM J Pathol, 1991；139：847

15. 王伯沄, 等. 生物素标记 HBV-DNA 探针的研制和应用. 中华流行病学杂志,1992；13(特 2)：193

16. 林万明, 主编. 核酸探针杂交实验技术. 北京：中国科学技术出版社,1991：33～82

17.JSambroor FF. Fritch T Maniatis：Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd . 金冬雁, 等译：分子克隆实验指南. 北京：科学出版社,1992：495～569

18. 王伯沄. 原位 PCR 标记检测技术. 中华流行病学杂志,1997；18(3A)：1～4

19. 吉昌华. 应用特异性双引物法标记 DNA 探针. 第四军医大学学报,1991；12(1)：66

20. 吉昌华. 应用聚合酶链反应标记高活性 DNA 探针. 第四军医大学学报,1990；11(4)：316

21. WangBo –yun(王伯沄)et al. Genetic identification for routine diagnosis of HBV DNA by Dot–blot hybridization. Chin Med J , 1992；106(7)：550～551

第二十章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry, ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有的位置进行细胞定位。这一技术为研究单一细胞中编码各处蛋白质、多肽的相应 mRNA 的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关因素的调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革合性的突破。

第一节 原位杂交组织化学概述一、核酸分子杂交技术1961 年 Hall 开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是 70 年代末到 80 年代初，分子克隆、质粒和噬菌体 DNA 的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern 印迹杂交（Southern blot）、Northern 印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等（详见第十八章）。

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situhybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出 DNA，然后进行杂交。Southern 印迹杂交法是以鉴定 DNA 中某一特定的基因片段，而 Norhtern 印迹杂交法是用以检测某一特定的 RNA 片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969 年美国耶鲁大学 Gall 和 Pardue 首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno – Nardelli 和 Amaldi,John 及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3 H 标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒 DNA 在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。

由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记 cRNA 探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用 2，4 二硝基苯甲醛（DNP）标记 DNA 探针，使该 DNA 探针具有抗原性，然后用兔抗 DNP 的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。

Pezzella（1987）创建了用磺基化 DNA 探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使 DNA 探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化 DAN 探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是 Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒 DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶 - 抗过氧化物酶显示系统显示病毒 DNA 在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图 20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每 100～150 个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。

图 20-1 光敏生物素结构图

近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio-chemisca 于 1987 年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组 DNA 中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶 - 抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。

核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为 DNA 探针、RNA 探针、cDNA 探针、cRNA 探针和寡核苷酸探针等。DNA 探针还有单链 DNA（Single stranded, ssDNA）和双链 DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是 DNA 探针，继之 Temin 在 70 年代研究致癌 RNA 病毒时制备了 cDNA 探针（complementaryDNA），其基本原理是以 RNA 为模板，经逆转录酶（reversetranscriptase）又称为 RNA 指导的 DNA 聚合酶催化产生的。该酶以 RNA 为模板，按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。CDNA 是指互补于 mRNA 的 DNA 分子。RNA 探针是将特异性的 cDNA 片段插入含有相当的 RNA 聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括 pSP64 和 pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64 和 pSP65 在 sP6 启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的 RNA 聚合酶，可以控制 RNA 的转录方向，即以哪条 DNA 链为模反转录 RNA。从而可以得到与 mRNA 同序列的同义 RNA 探针（Sense probe）和与 mRNA 互补的反义 RNA 探针（antisense probe），又称互补 RNA 探针（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同义 RNA 探针做为反义 RNA 探针的阴性对照。由于 RNA 探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于 DNA 探针的 8 倍。

DNA 合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性 DNA 探针，它是由 DNA 合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。

原位杂交组织化学技术在近 20 年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了，更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。Coulton（1991）建议将非放射性标记技术更名为亲合复合物标记技术（Affinity – Complex Labelled Probes, ACLP）。因为“非（non）“在英文里是一个否定的名词，而且根据非放射性标记技术的原理是将一个标记物利用其亲合性，应用直接或间接的方法结合在核苷酸分子上。

原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。我们在下节 将详加叙述。

三、原位杂交组织化学技术的基本方法如前所述，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual-ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。

（一）固定

原位杂交组织化学技术（In Situ HybridizationHistochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内 DNA 或 RNA 的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA 是比较稳定的，mRNA 是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA 却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于 DNA 的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在 RNA 的定位上，如果要使 RNA 的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释 ISHH 的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对 RNA 保存所带来的影响，因组织中 mRNA 的降解是很快的。在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。其它如醋酸 - 酒精的混合液和 Bouin’s 固定剂也能获得较满意的效果。对于 mRNA 的定位，我们常采用的方法是将组织固定于 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液中 1～2h，在冷冻前浸入 15% 蔗糖溶液中，置 4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入 4% 多聚甲醛约 10min，空气干燥后保存在 -70℃。如冰箱温度恒定，在 -70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测 DNA 和 mRNA 有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低 mRNA 的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：酒精 / 醋酸混合液、Bouin’s 液、Carnoy’s 液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存 RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存 RNA 和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为 ISHH 较为理想的固定剂。

（二）玻片和组织切片的处理

1．玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡 24h，清水洗净烘干，95% 酒精中浸泡 24h 后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在 150℃或以上过夜以去除任何 RNA 酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放（硅化方法见附录）。

由于 ISHH 的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾 - 明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。近年 Vector Lab (U.S.A.)推出一种新的粘附剂叫 VectorbandReagent, 每一单位包装可制备 500～700 张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。目前国内尚无生产，需国外进口（配方见附录 2）。

2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂 Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低 RNA 的保存最和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。

蛋白酶 K（ProteinaseK）的消化作用在 ISHH 中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶 k 1μg/ml(于 0.1mol/l Tris/50mmol/LEDTA, pH8.0 缓冲液中),37℃孵育 15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶 K 还具有消化包围着靶 DNA 的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。在蛋白酶 K 消化后，应用 0.1mol/ L 的甘氨酸溶液（在 PBS 中）清洗以终止蛋白酶 K 的消化作用，甘氨酸是蛋白酶 K 的抑制剂。为保持组织结构，通常用 4% 多聚甲醛再固定。Burns 等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用 0.1n HCl 配）37℃、30min 进行消化，所获实验结果优于蛋白酶 K。

不少实验工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceticanhydride）和三乙醇胺（tri-ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。有的作者除在室温下浸于上述溶液 10min 外，还在预热 37℃的 50% 甲酰胺 /2×SSC 液中预杂交 15min，然后用 2×SSC，0.30mol/lNaAc/0.030mol/ L 枸橼酸钠液中浸 15min。但 Heinz、Hofer 等一些著名学者却对此持有异议，根据他们的实验和经验证明，乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善 ISHH 的信 / 噪比例。

3．减低背景染色和免疫细胞化学染色一样 ISHH 实验程序中，如何减低背景染色是一个重要的问题。ISHH 中背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。

预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。

有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的 RNA 酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，以减低残留的和内源性的 RNA 酶，减低背景染色。

4．防止 RNA 酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有 RNA 酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除 RNA 酶的目的。要破坏 RNA 酶，其最低温度必须在 150℃左右。有条件的国外实验室在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。在无高温消毒的烤箱时，亦可用国内出产的卫生蒸汽消毒锅（山东新华医疗器材厂生产）。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。

（三）杂交（Hybridisation）

在 ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在 ISHH 整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是 ISHH 中关键的而且是最重要的一个环节。

杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。国内向正华等采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片也可获得满意的实验结果。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。因此，也有为稳妥起见，在盖玻片周围加液体石蜡封固的，但作者认为这并不十分必要，因封固的石蜡在高温下融解反易导致杂交液的污染，必要时可加橡皮泥封固盖片四周。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。在孵育时间较长时，为保证杂交所需的湿润环境，可将复有硅化盖玻片进行杂交的载片放在盛有少量 5×SSC 或 2×SSC（standardsaline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高温破坏）中进行孵育。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖（配方见附录）。

如前所述，杂交前的准备只是为杂交的成功奠定基础，要获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中还须注意以下的环节。

1．探针的浓度很难事先确定每一种实验探针的浓度，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信 / 噪比值。背景染色的高低也与探针浓度有关。根据国内外实验工作者的经验，认为最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。这和我们在免疫细胞化学试验中选择抗血清的最佳工作浓度的原则一样。

探针浓度依其种类和实验需要略有不同，根据笔者的经验及所查阅文献，在原位杂交细胞化学中，探针浓度为 0.5～5.0μg/ml（即 0.5～5.0ng/μl）。根据 Heinz、Hofelt 实验室经验，对放射性标记的 dsDNA 或 cRNA 探针，其浓度在 2～5ng/μl。Conlton 认为生物素标记探针，其最佳浓度在 0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院 Polak 教授实验室应用于放射性标记 cRNA 探针的浓度为 0.5ng/μl，而在非放射性标记（生物素或地高辛）cRNA 探针浓度为 2.5ng/μl，放射性标记 DNA 探针浓度为 1.0ng/μl。向正华等应用地高辛标记生长抑素 cRNA 探针获得满意结果，其探针浓度为 0.5ng/μl。

必须强调的是，国内外实验室都证明加杂交液的量要适当，以 10～20μl/ 每张切片为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落，影响杂交效果，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色等不良后果。

2．探针的长度一般应用于 ISHH 探针的最佳长度应在 50～100 个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长 500 个碱基的探针，其杂交时间约需 20h 左右。200～500 个碱基的探针仍可应用，如超过 500 个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。

附：核酸探针水解法（以放射性标记探针为例）

（1）按下列比例混合

探针溶解于水 160μl 无菌蒸馏水加入含标记探针沉淀物的 Eppendrof 管中

0.4mol/L NaHCO320μl

0.6mol/L Na2CO320μl

混合后孵育于 60℃水浴，其孵育时间由下式推算：

孵育时间 = LO–Lf/K×LO–Lf

LO：核酸探针原长度（Kb）

Lf：核酸探水解后所需长度（Kb）

K：是一常数 0.11Kb/min

（2）在室温中加入下列配方以终止水解

3mol/L 醋酸钠 6.6μl(最终浓度 0.1mol/L)

醋酸 1.3μl(最终浓度 0.5%)

（3）加下列配方沉淀探针

7mol/L 醋酸铵 100μl

100% 乙醇 750μl

tRNA(10mg/ml) 2μl

置于—20℃2h 后回暖至室温，在 14000rpm 离心 30min。

（4）小心将乙醇轻轻倾出，待试管内干燥后再用无菌蒸馏水稀释到 10ng/μl 浓度。

（5）应用放射性标记测定法测定其放射比活性（详见第十九章），然后调到 5ng/μl 浓度。

3．杂交的温度和时间杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节。在第十八章 概述中曾提到 DNA 或 RNA 需加热或变性、解链后才能进行杂交。能使 50% 的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（melting temperature, 简称 Tm）。原位杂交中，多数 DNA 探针需要的 Tm 是 90℃，而 RNA 则需要 95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规的加入 30%～50% 甲酰胺（for-mamide）于杂交液中。McConaughy 报告，反应液中每增加 1% 的甲酰胺浓度，Tm 值可降低 0.72℃。因此，可用调节 盐浓度的办法来调节 Tm。Tm 的计算公式在第十九章 有介绍，由公式的列出也表明了它与盐的浓度、探针的长度、甲酰胺的百分比等诸多因素有关。由于盐和甲酰胺浓度的调节 等因素，实际采用的原位杂交的温度在 Tm-25℃左右，即比 Tm 减低 25℃，大约在 30～60℃之间，根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA 和 cRNA 探针一般在 37～42℃左右，而 DNA 探针或细胞内靶核苷酸为 DNA 的，则必须在 80～95℃加热使其变性，时间 5～15min，（有作用报告在 105℃微波炉加热使之变性），然后在冰上搁置 1min，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有 2×SSC 的温盒内，在 37～42℃孵育杂交过夜。

杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在 3h 左右。Barns 等（1987）报告用 DNA 探针杂交，其反应完成时间为 2～4h。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为 16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜，从现有文献报告看无不良结果。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关，在确定杂交反应时间应予考虑，并经反复实验确定。

有作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。

4．杂交严格度（Hybridizationstringency）杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。一般来说，低严格度（lowstringency）杂交及冲洗条件在 Tm -35℃至 Tm –40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有 70%～90% 的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm -20℃至 Tm-30℃的范围。高严格度（high stringency）为 Tm-10℃至 Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。麦跃行装用地高辛标记原位杂交技术检测尖锐湿疣中人乳头瘤病毒 DNA 型别，结果发现在严格条件下（Tm-12℃）各型病毒 DNA 的检出率和阳性率明显低于非严格条件下（Tm-35℃），其相差非常明显（P<0.001）。因为，在严格条件下只有同源性很强的 DNA 才被检出，而在非严格条件下同源性较低的 DNA 序列也被检出。因此，他建议对病毒 DNA 分型需在高严格条件下进行，而低严格条件则可用于对病毒感染进行筛选。

由于原位杂交技术多数是在 Tm-25℃进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信 / 噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于 RNA 杂交的稳定性，应用 cRNA 探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高 10～15℃。实验证明，cRNA 产生的信号比双链 cDNA 要强。单链的 RNA 探针其杂交信号大于双链的 cDNA 的约 8 倍。

5．硫酸葡聚糖（Dextransulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占 50% 左右，而硫酸葡聚糖占 10% 左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合（hydrate）作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。

甲酰胺的主要作用在上节 已提及，在调节 杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。

（四）杂交后处理（posthybridisation treatment）

杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环节。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA 探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的 RNA 酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对 RNA 除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法检测背景染色（非特异性标记的多少）作为改善漂洗程序的指针。在35 S 标记的核酸探针在漂洗液中须加入 14mmol/ L 的 β - 巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸盐（thiosulphate），以防止35 S 标记的核酸探针被氧化。总之，如何控制漂洗的严格度从而达到理想的信 / 噪比无既定方案可循，必须从反复的实践中取得经验。

（五）显示（Visualization）

显示又可称为检测系统（Detectionsystem）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理（详见本章 第二节）。

细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪（computer –assisted image analysis）检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。但利用 ISHH 做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。

（六）对照实验和 ISHH 结果的判断

和其它实验方法一样，并非 ISHH 的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种（表 20-1）。

表 20-1 ISHH 对照试验一览表

核乳胶或非放射性检测系统对照试验Northern 或 Southern 印迹杂交法 *ISHH 与免疫细胞化学结合 *应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交将 cDNA 或 cRNA 探针进行预杂交（吸收试验）*与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验）将切片应用 RNA 酶或 DNA 酶进行预处理后杂交 *应用同义 RNA 探针（Sense probe）进行杂交 *以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验）组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行 ISHH 对照应用未标记探针做 ISHH，进行对照从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少 3～4 种用以证实 ISHH 结果的可靠性。在上述试验中，标明 * 者为比较可靠的对照试验。①Northern 和 Southern 印迹杂交法证明的方式和用 Western 印迹法检测抗体（蛋白质）的特异性一样，是比较可靠的。②如果具备相当的免疫组化抗血清，可用结合的免疫组织化学和 ISHH 法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应 mRNA 共存于同一细胞中。③预先将切片用 DNA 酶或 RNA 酶消化，然后用 ISHH 技术证明丢失的是 DNA 或 RNA。如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的 cRNA 或 cDNA 进行杂交。再进行 ISHH，其结果应为阴性。④由于同义 RNA 探针和组织内 mRNA 序列顺序是相同的，应用其进行 ISHH，结果应为阴性。检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。

ISHH 的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。应用高敏感度的放射性标记 cRNA 探针在理想的 ISHH 的实验条件下检测 mR-NA，其敏感度可达到 20 个 mRNA 拷贝 / 每个细胞。由于双链 DNA 的稳定性，在用 ISHH 定位 DNA 时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染色体铺片，长于 2kb 的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。正因为如此，对 ISHH 结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。因为如前所述，影响 ISHH 实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中 mRNA 的降解而导致假阴性结果。另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各异。这些诸多因素都将影响 ISHH 的实验结果。

第二节 cRNA 探针在原位杂交组织化学（ISHH）中的应用Angerer 及其同事们首先应用 RNA 探针于原位杂交（见 Cox et al 1984），核酸探针为单链的 RNA 分子，产生自具有质粒逆转录系统的 cDNA 克隆（图 20-2）。由于它是单链的，不像双链的 DNA 探针，在溶液中不会再退火（reanneal），因此，较大百分比的探针可参与杂交反应，较 cDNA 探针的信号强。除此之外，在溶液中产生的 cRNA-mRNA 杂交体比相应的 cDNA-mRNA 杂交体稳定，但在原位杂交中是否如此尚未证明。cRNA 探针不足之处在于有时比 DNA 探针粘性强（stickier）。可与组织产生较高的非特异性结合，但此缺陷可在杂交后漂洗液中加用酶漂洗来解决。最近，Wolf 等（1987）建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生 cRNA 分子，这种 cRBA 分子称为“寡核苷酸核酸探针”（oligoribo-probes）已被成功的用于原位杂交实验。

图 20-2 示 cDNA 转录为 cRNA，可标记以不同的标记物，然后与细胞中的 mRNA 相结合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛）

一、同位素标记 cRNA 探针在 ISHH 中的应用（一）组织切片的原位杂交细胞化学方法

（1）组织准备：大鼠以 10% 水合氯醛（0.3ml/100g 体重），或 1% 戊巴比妥钠约 1ml（3～4mg/100g 体重）腹腔内注射麻醉，用 100ml 生理盐水冲洗和 150ml 4% 多聚甲醛主动脉灌注固定。固定半小时后，取出组织块，置入 4% 多聚甲醛液中后固定 4～6h，4℃。

如要取脑组织，可于灌注后置 4℃冰箱内过夜，次晨取脑组织，后固定 4℃4h 左右。

（2）组织切片 / 培养细胞在经过处理，抹以粘附剂的载片上，在 43℃烤箱过夜。

（3）在 PBS（0.1mol/l Ph7.2）中浸 5～10min。

（4）浸于 0.1mol/ L 甘氨酸—PBs 液内 5min。

（5）为增强组织通透性，将载片置于 0.3%Triton X-100(在 PBS 内)10～15min。

（6）PBS 洗 3×5min。

（7）在蛋白激酶 K（1μg/ml）溶于 Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和 EDTA（50mmol/L,pH8）中 37℃20min。也有用蛋白激酶 K 溶液，不加 EDTA 的。

（8）浸入新鲜配制的 4% 多聚甲醛（在 PBS0.1mokl/L,pH7.2）3min 以终止消化作用和再固定。

（9）浸入新鲜配制的含 0.25%（V/V）三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0）中，10min 以达乙酰化（acetylate）的目的。

（10）预杂交：在 50%（V/V）甲酰胺溶于 4×SSC 预热 37℃15～45min。

（11）杂交：将载片上过量的甲酰胺液倾去，加 20μl 杂交混合液（含放射性同位素标记的探针量为 5×103～106cpm/ 每张载片）。覆以硅化的盖玻片，置于盛有少量 5×SSC 的硬塑料盒内以保持湿度，42℃孵育 12～18h。为使载片不致于浸泡于 SSC 溶液内，通常以二根玻管（或棒）扎成担架状，载片置于玻棒上，与盐液不接触，但可保持盒内空气湿润。

（12）杂交后漂洗

①以小烧杯盛适量 4×SSC 溶液，将载片一端斜插入溶液内，轻轻抖动以移除盖玻片。

②将载片置于有刻度的染色用小方玻缸内，加入 42℃（预热）4×SSC，3×20min。在漂洗过程中宜不断振动，以增强漂洗效果。如设有调整钮的振动台更为理想。

③加 20μlRNA 酶溶液（20μg/ml）在 NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和 EDTA（1mmol/L,pH8.0）消化未杂交探针，42℃30min（也有不加 EDTA 的）。

④以递减梯度盐溶液 SSC 漂洗载片：2×SSC，0.1×SSC 和 0.05×SSC 各 30min 42℃。

⑤梯度酒精脱水：70%，90%，2×100% 酒精含 0.3mol/ L 乙酰胺，室温，每次 10min，空气干燥后待进行放射自显影。

（13）放射自显影和复染

①在暗室中预热水浴至 45℃，将分装的核乳胶溶液小瓶置水浴中浸泡至少 1h，同时预热一电热板至 45℃。将杂交后漂洗过完全干燥的载片依次排列于玻片架上，有组织切片一面面向实验者。在实验的载玻片前放 1～2 张无切片的干净玻片，作为测定核乳胶溶解度与浸片高度等的空白对照片。浸泡（Dipping）过核乳胶膜的载片放入暗盒内，事先最好将暗盒准备好，为保持干燥，放入一包变色硅胶干燥剂（无水干燥剂为小块蓝色晶体，吸水后呈粉红色，置烤箱中烘干待转成蓝色后可重复应用），预先备好封固暗盒用的胶带备用。

②核乳胶液，国外产品为 ILFord K5 乳胶液，国内核乳胶产品可自原子能研究所订购。不论国产或进口乳胶，事先应（按说明需要浓度）稀释分装在 10ml 小瓶内，密封于暗盒内，4℃备用。反复的冷冻和融解核乳胶会增加背景染色。每一小瓶供一次性实验应用。

为节 省核乳胶，切片宜贴附在靠近载片的一端。这样，在浸泡时少量乳胶便可充分覆盖切片。

③浸核乳胶（Dipping）：当一切准备工作就绪后，在暗室中（只留完全灯）先将载片置于电热板上预热 1～2min。以空白载片浸入核乳胶液，取出后检查核乳胶是否充分溶解，玻片上有无气泡。然后正式进行切片浸入。浸核乳胶膜是一项需反复操练的技术。以拇、食指夹住玻片一端，以垂直方向进入乳胶，进入的提出均应采取中速度，且速度应保持稳定，提出后可将玻片一端滴下的乳胶轻沾于吸水纸上，掌握好该技术，浸入形成的核乳胶膜厚度适当，均匀一致。依序放在预热 45℃的电热板，倾斜度应一致。在 45℃电热板上干燥至少 1～2h，在此期间应严格控制在黑暗中。

④装入暗盒曝光：将载片架上已干燥覆有核乳胶的载片放入暗盒内，周围用胶带封固，以标签写明：样品种类，实验者姓名，曝光日期等放在 4℃冷房或冰箱内。曝光时间依同位素种类而异，32 P 大约需 5～7 日，3 H 需 4 周，但还要参考细胞内 mRNA 的含量而定，含量高者曝光时间宜短，反之宜适当延长。可根据不同曝光时间的实验结果予以调整。曝光时间长可增加信号，但也增加背景，反之，信号减弱，但背景亦低。

⑤显影：取出切片中暗盒（注意：切勿启封），放在室温至少 1h，使其回升到室温。然后在暗室内（只留安全灯），将载片置入 Kodax D19 显影液（预调温至 18～20℃）3min。水冲片刻后入 Kodax F24 固定剂内 3min。上述溶液及水温最好都保持在 18～20℃。突然改变溶液温度会损坏精细的核乳胶膜。另外，在显影和定影过程中不要振荡溶液，因为，这时的乳胶还是处于胶状结构，溶液振荡的冲击可使乳胶膜产生划痕。

⑥冲洗，脱水和复染：用自来水（水冲力勿过猛）冲洗载片 20min，如需要可用 1% 苏木精复染，复染后自来水冲洗分化 2min，梯度酒精脱水（70%，90%，100%）每次 3min，二甲苯透明，DPX 封片。

（二）培养细胞的原位杂交细胞化学方法

（1）固定：通常将细胞培养在盖玻片或塑料薄膜上，可将盖玻片取出，倾去培养液，用 4% 多聚甲醛液固定 2～4h 后，依组织切片处理法进行 ISHH 实验。也有在 4% 多聚甲醛室温固定 20min 后，由低浓度 30%，50%，70% 酒精各 3min，保留在新鲜配制的 70% 酒精中，4℃，备用。

（2）重回到水：50%，30% 酒精 3min，无菌重蒸水 2×3min，然后置入 PBS 含 5mmol/l MgCl210min，室温（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2）。

（3）0.1mol/ L 甘氨酸 /Tris pH7.4：室温 10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg 甘氨酸和 20ml Tris，应用重蒸水制成 200ml）。

以后步骤同（一）组织切片法。

二、生物素标记 cRNA 探针在原位杂交组织化学中的应用（一）光敏生物素标记 cRNA 探针的应用

以线性质粒 DNA 为模板合成未加标记物的 cRNA 探针，使其最终浓度为 0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl), 再与等体积的光敏生物素（1μg/μl）混合。在 150 瓦卤素灯下，距离光源 20cm 处照射 30min。用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素 cRNA 探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光亮度计测探针的光密度（详第十九章），其最佳工作浓度为 2μg/ml。

切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节。

光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序：

（1）石蜡切片脱蜡入水后，置 0.1mol/l PBS pH7.2 冲洗 5min；冰冻切片直接入 PBS 冲洗 5min。

（2）0.1mol/l 甘氨酸 PBS 冲洗 5min。

（3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗 15min。

（4）蛋白酶 K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配）37℃保温 30min。

（5）4% 多聚甲醛 PBS 固定 5min。

（6）0.1mol/l PBS 冲洗 2×3min。

（7）0.25% 乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。

（8）2×SSC 冲洗 10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠）。

（9）取 10μl 含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是 cDNA 探针则用前将探针于 95℃水浴中保温 10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。

（10）盖上 22×22mm 的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒 43℃保温 12～16h。

（11）4×SSC 洗脱盖片，并在同一液中 37℃漂洗 10～30min。

（12）2×SSC（含 20μg/mlRNaseA, 适于 RNA 探针）冲洗 30min，37℃。

（13）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗 10～30min。

（14）0.05mol/l PBS 冲洗 4×5min。

（15）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS 配）37℃保温 30min。

（16）Avidin –AKP(碱性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS 配）室温 1～3h。

（17）0.05mol/l PBS 冲洗 4×5min。

（18）TSM1冲洗 2×5min。

（19）TSM2冲洗 2×5min。

（20）硝基四氮唑蓝（NBT）0.4%mg/ml 和 5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - 磷酸（BCIP）0.2mg/ml 混合液显色，室温，暗处 3h。

（21）20mmol/l EDTA,pH8.0 终止显色。

（22）甘油明胶直接封片。

结果：杂交阳性部位着蓝黑色。

组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。

（三）酶促生物素标记 cRNA 探针的应用

基本方法和放射性标记 cRNA 探针同，所不同的是探针浓度为 2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。

（1）用 PBS 冲洗粘附有切片的载片 2×3min。根据情况也可用漂洗法。

（2）将载片浸入 0.3%H2O2在 PBS 或甲醇内 30min 以封闭内源性过氧化物酶。

（3）PBS 冲洗 2×3min，用吸水纸拭干切片周围的水份，加入小鼠抗生物素血清 1：100 和 PBS 含正常羊血清（1：30），室温 1h，或 4℃过夜。

（4）PBS 彻底冲洗。

（5）载片加生物素化抗小鼠 IgG（1：100）30min 室温。

（6）PBS 彻底冲洗。

（7）应用 ABC 复合物与等量的 1% 牛血清白蛋白 -PBS 液混合孵育 1h，室温。

（8）PBS 彻底冲洗。

（9）将切片覆以新鲜配制的 0.025%DAB 溶液，0.02%H2O2, 孵育 3～15min。

（10）水洗，复染，脱水，透明和以甘油 /PBS 或 DPX 封固。如需要可用银染，多层 ABC 或 PAP 法加强染色效果。

三、地高辛标记 cRNA 探针的应用（一）基本原理

地高辛（Digoxigenin 简写 Digo-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成 digoxigenin –11-dUTP（图 20-3）。通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将 dig-11-dUTP 与探针的核酸分子相连，构成 Dig- 配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体 Tab（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的，其反应过程见图 20-3。

图 20-3 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应

常用的免疫酶学检测方法有两类：一是 Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系，以 DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以 4 - 氯 -1- 萘酚 /H2O2为底物，结果为蓝色。另一是 Dig –AKP 检测体系：以 BCIP/NBT 为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP 灵敏度和分辨率较 HRP 高约 10 倍左右，但 HRP 的优点为价廉、稳定。

应用地高辛标记的核酸探针也较稳定，据报告在 -20℃贮存可达 2 年，随时要取用，不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中，仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记 3～6 个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知 mRNA 的检测，仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。

与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高，反应产物颜色鲜艳，反差好，背景染色低，制备探针可较长期保存，对人体无害等优点，已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学，还可应用于 Southern 印迹杂交法检测特定基因组序列，进行 RFLP 分析用于基因诊断，菌落原位杂交，噬菌斑原位杂交，固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中，组织中病毒 DNA 序列的检测。这一技术还被应用于检测 DNA 标记物及测序，对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。

（二）基本操作步骤

组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记 cRNA 探针相同，但由于地高辛标记 cRNA 探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。

1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚 10～30μm）最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在 37℃预干燥 4h，然后置于 37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在 -20℃可保存 2～3 周，在 -70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内 mRNA 含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入 37℃烤箱 4h 或过夜，然后进行杂交前处理。

在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中 RNA 酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。

下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。

（1）PBS 洗 2×3min。

（2）选择少数几张切片作为“RNA 酶对照片”。

其它切片暂放于 PBs 内。

RNA 酶对照片处理方法：加 RNA 酶（100μg/ml）在预热 37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许 2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的 RNA 酶溶液，在 37℃孵育 30min 后用 2×SSC 冲洗，2×3min，然后与其它保存在 PBS 的切片一起进行下列处理。

（3）蛋白酶 K 消化：将组织切片放在 0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶 K1μg/ml，孵育 15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。

（4）0.1mol/ L 甘氨酸 /PBs 5min 终止蛋白激酶 K 反应。0.25% 乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。

（5）在 4% 多聚甲醛 /PBS3min。

（6）以 PBs 漂洗 2×3min。

（7）浸入新鲜配制的 0.25% 乙酸酐（0.1mol/ L 三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。

（8）2×SSC 漂洗 15min。

2．杂交以含 cRNA 探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片 10～2μl 的量覆盖切片。地高辛配基标记的 cRNA 核酸探针保存浓度为 2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量 2×SSC 温盒内在 42℃，16～18h 或过夜。

3．显示

（1）用缓冲液 1 冲洗杂交后的载片 2×3min。

（2）在缓冲液 1 中 10min，室温以封闭非特异性结合部位。

（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度 1：500，以缓冲液 1 稀释），孵育 2h，室温。

（4）缓冲液 1 漂洗 3×3min。

（5）浸入缓冲液 210min 室温。

（6）浸入底物中孵育 10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色 BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。

（7）将切片浸入缓冲液 3 以终止反应。

（8）复染，可用 1% 伊红、1% 苏木精、1% 亮绿或 5% 的焦宁（又称派咯宁丫）（pyronin 丫）10～30s。

（9）流水洗 5～10min，直至水无色为止。

（10）在切片未干前，以 PBS/ 甘油封固切片，如要永久保存，可以用 DPX 在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX 封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。

几点说明

①缓冲液 1，2，3 配制法见附录。缓冲液 1 中 BSA 用量大，价贵，如无法负担可略去。

②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法，载片染色适用于切片数数量较少时，可用液体覆盖于切片表面进行孵育，漂洗在烧杯内进行。如切片多，可将载片置于方形的染色缸（staining jar）内，将冲洗液加入缸内，如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量，将切片置于凹形碟内，或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量，切片两面均可接触反应液，有利于信号的增强。

③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色，有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片，二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位，而前者系无结构性定位，常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。

④在组织前处理中应严格注意控制 RNA 酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫细胞化学一样，自始至终应保持切片的湿润，勿令其干燥。

第三节 DNA 及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用一、DNA 探针的应用虽然一般认为 DNA 探针敏感度不如 cRNA 探针，但在病毒的检测等领域中 DNA 探针仍得到广泛的应用。

在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与 cRNA 探针基本相同，所不同的是：（1）杂交时需先在高温 80～95℃短时处理，使 DNA 探针及细胞内靶 DNA 变性，解离成单链，迅置于冰上冷却。然后置于 37℃～42℃杂交过夜。（2）RNA 酶的溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。

（一）地高辛 - 碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记 DNA 探针在石蜡包埋切片检测病毒 DNA 中的应用

1．组织前处理

（1）固定：组织以 10% 中性福尔马林液或 Bouins 液固定，常规石蜡包埋，切片厚 4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱 60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。

（2）脱蜡：二甲苯 10min×2，自 100% 乙醇，90%，70%，50%，30% 各 5min。入 PBS（含 5mmol/lMgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入 0.2n HCl 20min 以进一步去除蛋白。

（3）50℃2×SSC，含 5mmol/l EDTA 溶液中 30min。

（4）蛋白酶 K（1μg/ml 溶于 0.1mol/l PBS 中，）37℃20～25min。

（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室温 10min，中止蛋白酶反应。

（6）4% 多聚甲醛（PBS 新鲜配制）：室温 20min。

（7）PBS/5mmol/lMgCl2漂洗 10min×2。

（8）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各 3min，空气干燥。

2．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/ 每张切片，42℃水浴半小时。

3．杂交 10～20μl/ 每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于 95℃min，使探针及病毒 DNA 变性，然后迅速置于冰上 1min（也有报告用乙醇使之冷却的），然后将切片置于盛有 2×SSC 湿盒内，42℃过夜（16～18h）。

4．杂交后漂洗

（1）2×SSC 液内振动移除盖片。

（2）2×SSc55℃10min×2。

（3）0.5×SSc55℃5min×2。

（4）缓冲液 II（含 0.5% 封阻试剂，用缓冲液 I 溶解）37℃30min。

（5）缓冲液 I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室温。

（6）酶标地高辛抗体（1：5000，应用缓冲液 I 稀释）37℃30min。

（7）缓冲液 i15min×2 室温。

（8）缓冲液 III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室温 2min。

5．显色

（1）显色液配制：缓冲液 III：1ml 中加入 4.5μl 四氮唑蓝（NBT），3.5μl X- 磷酸盐（5- 溴 -4- 氯 - 3 吲哚磷酸盐（BCIP 配成））。30μl/ 每张切片，置暗处显色 30min 到 2h。定时抽查切片，镜检其显色情况。

（2）缓冲 IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min 终止反应，甲绿复染 5min，二甲苯透明，DPX 封固，镜检。

（二）荧光标记 DNA 探针的应用

1．概述在原位杂交细胞化学中荧光标记 DNA 探针（Fluorescence in situ DNA hybridisa-tion , FISH）的应用在细胞培养和染色体铺片（见二十一章）中较为广泛。FISH 属于非放射性标记，其优点在于简便，快速，其敏感性可与放射性同位素标记核酸探针相等。不少实验室报告应用 FISH（2～5kbp 探针）可成功地达到单个拷贝（copy）的特异性定位。

2．荧光标记 DNA 探针应用于 ISHH 中的基本原则（Barbara Traok 和 Dan Pinkel 1990）

（1）首先应使组织或染色体中靶核苷酸高温加热变性解离为单链 DNA，化学性标记的 DNA 探针除外。

（2）杂交：一般在 37℃进行，探针稀释浓度在 2ng/μl，染色体铺片探针浓度在 0.4ng/μl, 杂交液 2～3μl/ 每 cm2盖片，每张盖片大约 1.8cm2，约需 10μl 杂交液。有实验室报告，如每张盖片（温度为室温）加入杂交液将会降低杂交温度所需要的 37℃，因此，建议对盖片应用前在 37℃进行预热。

（3）用免疫细胞化学或组织化学方法显示荧光标记。自 80 年代以来，荧光素标记检测系统日益增加。包括：①生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素（avidin）或抗生物素抗体。②氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）- 改良探针（modified probe），与抗 AAF 抗血清。③磺酸（sulfonatc）改良探针，以抗磺酸抗血清检测（Organic Ltd, Yavene, Israel 和 TMc BioproductsRockland ME 可提供此药盒）。④汞标记探针（mercuratedprobe），以硫氢基（sulf hydryl）与荧光标记物或 - 半抗原相结合，再以抗半抗原抗血清检测。⑤地高辛标记探针，以地高辛抗血清检测（Boehringer – ManubeimInc, Mannhein, FRG 可提供此药盒）。在上述各例中，为简便可采用直接法（图 20-4A），为提高敏感度可采用间接法（图 20-4B）。

图 20-4 生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解

生物素和地高辛用缺口平移法或随机引物法进行标记，以用后者为多。氨乙酰荧光素，磺酸和汞的核苷酸探针标记利用简单的化学反应。产生荧光的物质各有不同，常用的有异硫氰酸荧光素（FITC），也有应用德克萨斯红（texaored）获得满意效果的。但藻红素（Phycoerythrin）应用效果较差，可能由于分子大的缘故。可同时应用 AAF 和生物素标记系统及汞与生物素系统分别应用不同的荧光素去标记两条 DNA 进行双重染色。

3．基本操作方法

（1）玻片准备：细胞用甲醇：醋酸（3：1）固定，滴在玻片上可保存在 -20℃，如将此载片烘烤于 65℃数小时，将会导致样品的人工老化。应用相差显微镜在低倍下定位最佳区域，或用嘴轻吹气的方法可以看见浮动的细胞。在玻片背面圈出盖片应覆盖的区域。

（2）RNA 酶处理：加 50μlRNA 酶溶液，盖以盖玻片，放在湿盒内（2×SSC）37℃1h。应用 2×SSC 漂洗 2×3min，室温，梯度酒精脱水（70%，90%，100%），在空气中干燥。

（3）蛋白酶 K 和多聚甲醛处理：对单个拷贝杂交，蛋白酶 K 溶液（0.3～0.6μg/ml，在 20mmol/l Tris –HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl2）在 37℃孵育 2h。此法对甲醇 - 醋酸固定的淋巴细胞效果特佳，但这种浓度的蛋白酶 K 溶液对未事先经多聚甲醛固定的染色体制片可在靶 DNA 变性步骤中完全破坏。因此，需根据细胞类型调整溶液的浓度和孵育时间。蛋白酶 K 消化后，以 2×SSC，在室温漂洗 2min×3，再固定于 4% 多聚甲醛溶液中，室温 10min。2×SSC 洗 2min×3。

（4）靶 DNA 变性：将载片浸入 70℃变性溶液（70% 甲酰胺，2×SSC）2min。新鲜的变性溶液需每周配制，贮存于 4℃冰箱中备用。一张处于室温的载片放入 50ml 的染色缸（coplin jar）内，将会使溶液温度减低约 1℃，因此，每次应加入少量玻片，以免影响溶液的温度致变性不完全。冷却变性处理后的载片可放在冰上或浸入 70% 酒精溶液 1min。漂洗加震动以终止反应和彻底去除变性溶液。然后经梯度酒精脱水（80%，90%，100%），空气干燥。

（5）杂交液的准备

MM1甲酰胺 5.0ml

硫酸葡聚糖 1.0g

20×SSC 1.0ml

（或 50% 硫酸葡聚糖）2.0ml

MM2甲酰胺 5.5ml

硫酸葡聚糖 1 .0gm

20×SSC 0.5ml

首先将溶液在 70℃加温，以溶解硫酸葡聚糖，冷却后调整 pH 至 7.0, 容量加至 70ml。这容量是最后应用的杂交混合液的 70%，其余的 30% 为核酸探针和水（如果需要的话）。MM1给预杂交混合液是：50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖 2×SSC。Trask 发现 MM2效果较 MM1好，DNA 的 Tm 比 MM1低 -8℃。在 2×2cm 区域杂交混合液应为：MM17μl，DNA 探针（保存液为 500μg～10mg/ml）1μl，加探针混合液 2μl，总量为 10μl。

（6）杂交：每张盖玻片加 10μl 杂交混合液，注意移除气泡，可在盖片四周加橡皮泥封固，在 37℃湿盒中过夜。

（7）漂洗：从温箱中取出后，以镊子移除橡皮泥，从现在起注意勿使载片干燥。否则盐的晶体将产生非特异性背景染色，漂洗应用 2×SSC（pH7）在 45℃3min×3。不时震动以助彻底漂洗，盖玻片将在漂洗中自然移除。然后再在 2×SSC，45℃，2min×3。保存载片于 PBS 溶液内。

（8）荧光显示：

①生物素标记 DNA 探针的荧光显示。

1）应用 PBS 含 5% 无脂干奶（5μl 每张盖片），也可用 1% 牛血清白蛋白（BSA）-PBS 覆盖孵育 5min 室温，以封闭非特异性结合部位。

2）移除多余液体，加抗生素 -FITC（5μg/ml 在 PBS 含 5% 奶粉或 1%BSA，5μl/cm2）。在湿盒中，室温孵育 20min。抗生物素 -FITC 在此应用是过量的，因此，可回收贮存 4℃再次应用，其保存时间可达数周。反应见图 20-4A 直接法。

3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。

4）如需放大（amplification）, 即提高其敏感度，可按图 20-4B 间接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody）30min 室温。倾去加另一层抗生物素 -FITC 抗血清孵育 20min，重复上述 1）～3）。

②AAF 标记核酸探针的荧光显示

1）封闭非特异性结合部位：从 PBS 中取出载片，吸干多余液体，加 PBS-0.1% 吐温（Tween）含 2% 正常羊血清（NGS）（5μl/ 每 cm2盖玻片）。使载片停留在室温 5min。

2）倾去多余液体，加抗 -AAF 抗血清 1：750，PBS-Tween –NGS 溶液（如上 i）5μl/cm2盖玻片。室温 37℃。孵育 30min.

3）漂洗：PBS-0.1%Tween 室温 5min×3，间歇性振荡。

4）羊抗小鼠 IgG-FITC 孵育，1：300～1：1000 在 PBS-0.1%Tween 含 2%NGS，37℃孵育 30min，如 3）应用 PBS-0.1%Tween 漂洗 5min×3。

4．荧光标记 DNA 探针在细胞核混悬液杂交中的应用

（1）细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用 MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh etal 1986, 在 Traok 和 Van Den Engh 34 章）。细胞混悬液浓度为 5×106/ml。利用 RNA 酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为 4～5×106细胞核 /ml。

（2）细胞固定和酸的处理：在 5ml 试管内加冷的 100% 酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留 10min。在 4℃离心（×150g）10min。重复加三次冷的 100% 酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上 10min，再离心。然后加入相当核悬液 1 / 2 量的 0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留 10min。加入 IBM-0.25%Triton X-100（IBM 配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复 IBM 漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以 2×SSC-0.1%Tween 漂洗 1×3min，继之加入等量 2% 的多聚甲醛在 1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室温静置站立 10min。倾去上清液，加 IBm -Triton X-100 漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为 108/ml，（可用 IBM-Triton X-100 稀释约 50 倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

（3）细胞核混悬液杂交

①配制杂交混合液：甲酰胺 5 份，20×SSC1 份，50% 硫酸葡聚糖 2 份，pH 调至 7.0。此原液（stocksolution）可贮存在 4℃冰箱内。应用时加 1 份 10mg/ml 鲱鱼精子 DNA（herringsperm DNA）。

②混合 1μl 的细胞核混悬液（108/ml）与 18μl 的杂交混合液，充分混匀。将此 19μl 混合液移入 1.5ml 容积的 Eppendorf 管中（核含量约为 105）。

③加入 100ng/ 每管的 AAF 标记 DNA 探针（如为生物素标记 DNA 探针浓度为 20～40ng/ 每管）。

④置 70℃10min 使 DNA 探针和核 DNA 变性。

⑤和组织切片与 DNA 探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入 37℃孵育过夜。

（4）杂交后漂洗

①在每管中加入 1.25ml 50% 甲酰胺 -2×SSC（pH7.0），在 42℃静置 10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加 100μl 经 dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入 1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，继之，静置于室温 10～15min，如前离心，再加 1.25mlIBM-Triton X-100, 室温静置 5min，离心。

注：DEMS 处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如 PBS 中，细胞含量为 108/ml，以 K 2CO3和 DEMS 溶液处理 3 次，第 1 次：K2CO3为 20mmol/L,DEMS 为 3mmol/L，以后 2 次：K2CO3依然为 20mmol/L，而 DEMS 为 10mmol/L。在应用前将 K 2CO3和 DEMS 液混合加入红细胞混悬液中。在最后 2 次漂洗液中，应用 100mmol/l K2CO3将 pH 调至 9～10。在 25℃，15min 后，加入 50μl，100mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/ 每 ml 细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用 2×SSC 稀释到 108/ml，加 0.1% 叠氮钠可在 4℃保存至少 1 年。

（5）AFF 标记的荧光显示：加 200μl 的 PBS 含 0.05%Tween 和 2% 正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置 10min，加 20μl 1：100 的单克隆抗 AFF 抗体，37℃孵育 45min，加 1.25ml 的 PBS-Tween，室温静置 10min，加 20 间歇性振荡，离心，倾去上清液，加 200μlPBS 含 0.05%Tween –2%NGS, 振荡，室温静置 10min，加 20μl 的羊抗小鼠–FITC 荧光标记抗血清，稀释度 1：100～1：300。孵育于 37℃45min，加 1.25mlPBS –Tween, 室温静置 10min，离心，倾去上清液。

（6）生物素标记探针的荧光显示：加 200μl 4×SSC 含 0.1%Trion X-100 和 5%BSA。室温静置 10min 后，加 20μl 抗生物素标记 FITC 抗血清 15μg/ml，孵育在 37℃30min，以 1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100 洗 1 次，加入 1.25ml IBm –Triton X-100, 室温静置 10～15min，间歇振荡、离心。

（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于 250μl 的 IBM-Trion X-100 中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。

（8）流式细胞计：将 750μl 的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS 处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。详细操作见第十章。

二、寡核苷酸探针的应用寡核苷酸探针的优点在于它能根据需要人工用 DNA 合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，可以控制。其长度一般较克隆的 DNA 片段短。目前，寡核苷酸探针已能成功的为放射性同位素、荧光素、生物素和地高辛所标记，并成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些科技工作者认为其敏感度不如来自质粒扩增的 cRNA 或 DNA 探针，但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功，寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。

在原位杂交组织化学中应用寡核苷酸探针，其基本操作要点是相同的，如杂交温度在 Tm-25℃，杂交孵育时间以过夜（16h 左右）为佳。应用寡核苷酸探针在原位杂交组织化学技术中的成功与否主要决定于探针的设计，使有效配对率增加而错配（mismatch）减少。

（一）地高辛标记寡核苷酸探针的应用

1．组织处理

（1）冷冻切片：厚 10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于 -80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于 3% 多聚甲醛 -PBS 溶液中，pH7.4。PBS 漂洗 5min×3，孵育在 2×SSc10min。

（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯 10min 移除石蜡，以 100% 乙醇 10min×2，空气干燥 10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/ 每个浓度。PBs 5min×3，孵育在 2×SSc 10min。

（3）离心细胞涂片：将细胞先以 4% 多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用 PBS（含 5mmol/l MgCl2）5min×3 漂洗。在 0.1mol/ L 三乙醇胺含 0.25%(V/V)乙酸酐 10min。在 0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/ L 甘氨酸）pH7.410min。孵育在 2×SSc 10min。

2．探针准备 35pmol 的寡核苷酸（oligo -）探针，3’终末标记以地高辛 -11–dUTP。

3．预杂交和杂交加约 300μl 预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育 1h。如为鲱鱼精子 DNA，在应用前须在沸水浴中加热 10min，而对酵母 tRNA 可不用加热变性。

（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的 Oligo- 探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA 的 Oligo –探针，其理想工作浓度为 342ng/ml(0.342ng/μl)。

（2）预杂交后以 2×SSC 漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加 30μl 杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在 37℃过夜。如探针大于 36 碱基则杂交温度为 42℃。次日室温 2×SSC 液漂洗切片 1h，1×SSC 漂洗切片 1h（室温），0.5×SSc 37℃漂洗半小时，0.5×SSC 室温漂洗半小时。

4．地高辛显示（同前）。

（二）同位素标记寡核苷酸探针的应用

1．组织处理大鼠应用 1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏灌注 4% 多聚甲醛 - 磷酸缓冲液中，约 2h 后（也可置于 4℃冰箱过夜）取脑浸于同样固定液中加 10% 蔗糖溶液过夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃），厚 14μm 左右，贴于有粘附剂的载片上，37℃或室温干燥以增加切片的粘附性。

2．杂交前处理同本章 第二节 放射性标记 cRNA 探针一节。

3．杂交 37℃过夜，余细胞同前。

4．杂交后漂洗 2×SSc5min×3，1×SSc 1min 室温，0.5×SSc55℃15min×2，室温漂洗于 0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脱水，切片室温干燥。

5．浸核乳胶切片浸入核乳胶，黑盒封闭，在 4℃曝光 2～3 周（视同位素种类），显影，复染，观察。

（第二、三节 中所用试剂配制见附录）。

第四节 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法原位杂交组化（ISHH）与免疫组织化学（IHC）结合法是先后用 ISHH 和 IHC 在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种 mRNA 和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH 与 IHC 结合法可以在相邻切片上分别进行 ISHH 和 IHC 染色，也可先后在同一切片上进行 ISHH 和 IHC 染色。前者可使 ISHH 和 IHC 染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于 m RNA 易被染色过程中污染有少量 RNase 的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。

一、同位素原位杂交组化与免疫组化 PAP 法的联合程序（1）切片入 PBS 冲洗 5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

（2）0.1mol/L 甘氨酸 PBs 5min。

（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

（4）1μg/ml 蛋白酶 K，37℃保温 30min。

（5）4% 多聚甲醛 PBS 固定 5min。

（6）PBS 冲洗 2×3min。

（7）0.25% 乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。

（8）2×SSC 冲洗 10min。

（9）杂交：如是 cDNA 探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液 10μl 于切片上，盖上 22×22mm 的硅化盖片或相当大小看蜡膜，3 H 标记探针每 10μl 杂交液含 1×105cpm 探针，32 P 或35 S 标记探针每 10μl 杂交液含 5×105cpm 探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后 43℃保温 12～16h。

（10）4×SSc 37℃冲洗 10～30min。

（11）2×SSC（如为 RNA 探针则含 20μg/ml RNase）37℃冲洗 30min。

（12）1×SSC 和 0.1×SSc 37℃分别冲洗 30min。

（13）PBS 冲洗 2×5min。（转录 ISHH）

（14）0.5%H2O2PBS 室温 30min。

（15）1%BSA 37℃，30min。

（16）第一抗体，4℃孵育 16～24h。

（17）PBS 冲洗 4×5min。

（18）第二抗体 37℃，1h。

（19）PBS 冲洗 3×5min。

（20）兔 PAp 37℃，1h。

（21）PBS 冲洗 3×5min。

（22）DAB 显色液 5～10min（DAB 显色液：0.05%DAB + 0.03% H2O2PBS 液配）。

（23）PBS 冲洗 3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

（24）切片入 70%，85%，95% 和 2 个 100% 酒精脱水，空气干燥。

（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/ L 醋酸胺 =1：1），晾干，装入自显影暗盒。

（26）4℃曝光：3 H 标记探针 4～8 周，35 S 标记探针 1～4 周，32 P 标记探针 7～10 天。

（27）D196显影液，20℃显影 5～10min。

（28）自来水冲洗数秒。

（29）F5坚膜定影液 10min。

（30）自来水冲洗 15min。

（31）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。

结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应 mRNA 为黑色银颗粒聚集。

二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法非同位素标记物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和碱性磷酸酶等，其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化 PAP 法或 ABC 法联合使用，能成功地显示一些神经肽 mRNA 和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的 Fab 段没有 Fc 段，而免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）所应用的抗体既有 Fab 段，又有 Fc 段。由于抗体的这一特性可在 ISHH 和 ICC 抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体 Fab 段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，这样可明显缩短 ISHH 和 ICC 结合法的实验周期，同时还可以减少实验过程中对 ICC 检测的蛋白、多肽的损害，使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片，这是因为抗地高辛抗体只有 Fab 段，而没有 Fc 段。我们知道抗体的抗原决定簇在 Fc 段，因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的 Fab 与第一抗体的 Fc，所以第一抗体如果只有 Fab 段没有 Fc 段，那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图（图 20-5）。

图 20-5 原位杂交细胞化学与免疫细胞化学结合法

此种 ISHH 与 ICC 联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的 ISHH 与 ICC 结合法。详细程序如下：

（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2 冲洗 3×5min。

（2）0.1mol/ L 甘氨酸 PBS 冲洗 5min。

（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。

（4）1μg./ml 蛋白酶 K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温 30min。

（5）4% 多聚甲醛 PBs 5min。

（6）PBS 冲洗 2×min。

（7）0.25% 乙酸酐（0.1mol/ L 三乙醇胺配）10min。

（8）2×SSC 冲洗 10min。

（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为 0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片 15μl 杂交液足够。43℃保温 12～16h。

（10）4×SSc 37℃冲洗 30min。

（11）2×SSC（含 RNasea 20μg/ml）37℃保温 30min。

（12）1×SSC 和 0.5×SSc 37℃分别冲洗 30min。

（13）0.05mol/l PBS 冲洗 3×5min。

（14）0.5%H2O2PBS 室温 20min。

（15）0.05mol/l PBS 冲洗 2×5min。

（16）碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般 1：1000 稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBSpH7.2，4℃孵育 24h。

（17）0.05mol/l PBS 冲洗 4×5min。

（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温 1h。

（19）0.05mol/l PBS 冲洗 3×5min。

（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温 1h。

（21）0.05mol/l PBS 冲洗 3×5min。

（22）DAB 显色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2 配）显色 5～10min。

（23）0.05mol/l PBS 冲洗 3×5min。

（24）TSM，冲洗 2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/LNaCl,0.01mol/L MgCl2）.

（25）硝基四氮唑蓝（400μg/ml）和 5 - 溴 -4-3- 吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM2配显色混合液）显色 1～3h，避光。

（26）20mmol/l EDTA 终止显色。

（27）将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。

（28）梯度酒精脱水，透明、封片。

结果：ISHH 阳性细胞的胞质呈紫蓝色，胞核不着色，示该细胞含 XmRNA。ICC 阳性细胞的胞质呈棕色，胞核不着色示该细胞含 X 多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色，示多肽与 mR-NA 共存于该细胞内。

第五节 原位杂交免疫细胞化学技术的未来与展望自 1969 年以来，我们高兴的看到原位杂交免疫细胞化学技术已从分子生物学的一个分支发展成为生命科学的有效的研究方法。在原位杂交免疫细胞化学发展过程中两个关键性的突破是核酸探针制备的标记物的改进。核酸探针由克隆的核酸探针发展到无克隆的合成的寡核苷酸探针；从放射性同位素标记到非放射性标记。令人可喜的是，这一技术还处于不断的改进和更新的过程中。

一、PCR 与原位杂交细胞化学结合法自 1988 年以来 On 等科学家相继在研究对导致人类免疫缺陷的 HIV-1/AIDS 病毒 DNA 进行细胞内定位，以期提高对患者的阳性检出率。在系列研究的基础上，Bagasra 及其同事在 1990～1993 年成功的报告了原位杂交及聚合酶链反应结合法，简称为原位杂交 PCR（PCr in situ, PCRIS）。在本书二十二章 中曾介绍了 PCR 技术，它是一种对特定的 DNA 片段在体外进行快速扩增的无细胞克隆技术，基本步骤包括高温变性，低温退火适温延伸三个步骤的反复热循环，其效率可使几个拷贝的模板序列甚至一个 DNA 分子扩增 107～109倍。大大提高了 DNA 的检测率。此法不足之外，在于其不能达到细胞或组织的定位。PCRIS 技术的基本的原理是首先利用 PCR 技术将靶 DNA 片段扩增，然后用原位杂交细胞或免疫细胞化学技术通过标记的核酸探针与扩增了的 DNA 进行杂交显示和定位，其敏感性可达到显示单个拷贝基因的信号的程度。Bagasra 及其同事们利用这一方法，应用 32 P 和生物素标记的核酸探针分别对导致人体免疫缺陷的 HIV-1/AIDS 病毒 DNA 的单个拷贝基因经 PCR 扩增后在外周血单核细胞内显示成功。就算此法对 HIV- 1 感染患者外周血单核细胞检测的阳性率明显高于用单纯原位杂交技术的检出率，说明其敏感度大于单纯的原位杂交免疫细胞化学技术。其主要实验步骤为将离心沉淀的细胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated）的设有三个凹孔的特制玻片（CellLine Associ-ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm 的孔）的凹孔内，加热 105℃90s，然后以 2% 多聚甲醛 - 磷酸缓冲液，pH7.4，固定 1h，PBS 漂洗 3min×3。如用生物素标记核酸探针，应用 0.3% 的 H 2O2 孵育 37℃过夜，然后以蛋白酶 K 溶液（5μg/ml PBS）55℃孵育 2h（孵育时间应根据细胞的种类而定），将孵育的载片置于 96℃热板上 2min，最终以蒸馏水漂洗，空气干燥。在溶液中按 PCR 技术的需要加入 20PM 一对应的引物（Primer），15μg PCR 混合液含 10μmol/l dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/LMgCl2和 10μl Taq 多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo）。把上述溶液加入左侧二孔中，留一孔加入无引物的 PCR 混合液作为对照。将载片以 22×66mm 盖片覆盖，片周以无色指甲油封闭，放入自动的热循环仪（M.J.Re-seasCH,Boston MA）。可改良用铝锡箔纸覆盖于热循环仪表面再放置载片。按 94℃/45℃/72℃每个温度 1min，30 个循环。这温度也可根据引物的 GC 比例加以调整以求得理想的扩增。也可根据下列公式计算引物的 Tm 值（Muller & Wold,1989）。

引物 Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)–500/n

n= 引物的长度，mol/L= 缓冲液中盐的摩尔数，一般是 0.047mol./L

按扩增后，将切片放入 100% 乙醇 3～5min，以锐利刀片移除盖片，将载片放在 90℃热板上 30s，应用 2×SSC 漂洗，然后用生物素标记核酸探针进行杂交。载片在 95℃热板上 5min，然后移入温盒，48℃孵育 4h 或过夜。次日 PBS 漂洗，以抗生物素标记 FITC 抗血清（100μg/ml PBS pH7.2）37℃孵育 1h，PBS 冲洗，以甘油 /PBS 溶液封片，荧光显微镜观察。如生物素标记核酸探针的显示系统为过氧化物酶，则应用 DAB/H2O2溶液显色，常规光镜观察。这一技术不仅提高了病毒 HIV- 1 的侦检率，而且可用以确定细胞内携带的特殊基因，遗传片段，病毒和肿瘤的侵犯（load）等，是一项颇具广阔应用前景的实验技术。

二、快速原位杂交细胞化学技术原位杂交免疫细胞化学技术存在的难点之一是实验手续繁琐，实验周期长。国外 Liesi 等（1986）和国内学者何彬等应用光敏生物素 - 链亲合素（Biotin-streptavidin）胶体金系统进行原位杂交，得到了快速满意的结果，全部实验可在数小时内完成。

作用把含某种多肽或蛋白的 cDNA 片段的质粒，按照第十九章 在光照下标记光敏生物素，然后经 DNA 酶消化 1h，得到大量 100～500bp 长度的混合片段，变性后用于原位杂交。

如为培养细胞或细胞涂片，用 95% 乙醇、5% 乙醇固定 5min，PBS 冲去固定液，加含探针的杂交液覆盖（光敏生物素标记探针浓度为 2.5ng/μl），在温盒中 50℃孵育 1～2h，取出后直接加入胶体金标记链亲合素（1mg/ml）室温孵育 15min，然后在室温或 37℃下用大容量（200ml/ 每片）洗脱液（2×SSC，0.1%Triton X-100）分别冲洗 5～10min，以银显影液放大金颗粒显示原位杂交结果，可用 1% 伊红复染，脱水，透明，封片，镜检。

如为冰冻切片（cryostat section 10～15μm），应经新鲜配制 4% 多聚甲醛室温固定 15min，PBS 冲去固定液，吸干后滴加蛋白酶 K（25μg/ml,Sigma）37℃15min，再用 4% 多聚甲醛室温固定 20min，PBS 冲去多聚甲醛，晾干后按上述方法进行原位杂交和杂交后冲洗。

三、原位启动标记法原位启动标记法（Primed in situ labelling,PRINS），又叫寡核苷酸启动法（Oligonucleotide-priming method）是 Koch（1987）首先提出的，其基本原理是将未标记的寡核苷酸探针与细胞或组织中的靶 DNA 或 RNA 进行杂交，然后该寡核苷酸探针充当引物的作用，在 Kelow 多聚合酶的催化作用下，将生物素（或地高辛、荧光素）标记的核苷酸编入，以达到原位显示的目的。PRINS 技术具有 3 个方面的优点：首先由于探针在杂交时是未标记的，仅在杂交之后才进行标记，因此背景染色很低。至少，从理论上讲，背景染色几乎是零。其次是有效地缩短了实验的时间，由于探针未经标记，无增加背景染色的顾虑。因此，可增加探针尝试，缩短反应时间。杂交反应时间只需 1h。实验反应时间的缩短可有效的保持细胞或组织结构的完整性。第三个优点是能提高或增加信号的强度。Koch 等曾成功的将此方法应用于染色体制片、单层细胞涂片和组织切片。它们还将此法与流式细胞计相结合以达到检测群体离散细胞的目的。

在染色体或单层细胞涂片，载片在 70℃的溶液中变性（70% 甲酰胺，2×SSC）2min，立即在系统酒精中脱水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V），用吹风机吹干。预孵育在 37℃～53℃20～30min，孵育时间加盖玻片，孵育液含 2～4pmol 寡核苷酸探针，dATP，dCTP，dGTP 各 10mmol,5mmol 生物素 -11-dUTP 在 25μl×NT 缓冲液中（1×NT 缓冲液含 50mmol/l Tris –HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO4,100μM 二硫苏糖醇（dithio threitol）,50μg/ml 牛血清白蛋白），在预孵育时加入 1μl 的 Klenow 多聚酶。应用 100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl 在 65℃洗 1min 以终止反应，然后放入 100ml×BN 缓冲液（100mmol/l NaHCO3,Ph8.0,0.01%Nanidet P-40）40℃，进行检测系统的显示如荧光 - 亲合素标记，过氧化物酶 - 亲合素标记等。

总之，自 Gall 和 Pardue 1969 年建立杂交免疫细胞化学以来的 20 余年中，已有不少新的改良的方法出现，但基本原则仍为 Gall 和 Pardue 所建立的相仿。作者个人体会是任何方法需在本人的实验实践中加以体验和改良。比如目前对乙酰基化作用，即浸入醋酸酐和三乙醇胺是否能减低背景染色的问题有作者对此提出异议。在科技工作者认为在原位杂交实验的所有应用溶液中加入 0.1%～0.2% 的二乙基焦碳酸乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）能有效的减低背景染色，但有些作者对此持怀疑态度。蛋白酶 K 的消化作用曾被认为是增加细胞或组织渗透性的关键步骤，但有作用在自身的实验室实践中体会除结构较致密的组织如脑、脊髓等外，对培养或涂片的单层细胞、蛋白酶 K 的消化及预杂交均是可以省略的。本文列举各作者的操作步骤略有不同，可能是基于这个原因。

目前，原位杂交技术主要应用于基因组图（Gene mapping），基因表达定位（localization of gene expression），核 DNA 和 RNA 的排列，mRNA 的排列和运输（arrangement and transport of mRNA），复制（replication）和细胞的分类（sorting of cells）。临床研究应用在细胞遗传学（Cytogenetics），生前诊断（Prenatal diagnosis），肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定（biological dosimetry）和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备，标记方法和基本操作方法的不断改进，新的技术不断涌现，相信在不久的将来，原位杂交化学技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。

参考文献1. Gall G& pardue ML.Formation and detection of RNA ╟ DNA hybrid molecules in cytologicalpreparations. Proc Nat Acad Science.U.S.A,1969,63:378～ 381

2.Glaid,etal. The use of complementary RNA probes for the identification and localisationof peptide messenger RNA in diffuse neuroen-docrine system. In : in situ hybridisation,Application to developmental biology and medicine Eds:N1 Narris and D.GWilkinson, Combridge University press, 1990,43～68

3.CoultonG.Non – radiosotopic labele for in situ hybridization histochemstry: ahistochemist’s view. In: in situ hybridization,application to developmentalbiology and medicine. Eds: N1 Narris and Dg wilkinson, Combridge universityPress, 1990:PP1～32

4.PlakJM,Mcgee JOD(Eds).In situ hybridisation principles and practice. New York:Oxford Oxford University Press, 1991

5.ForsterAC, et al. Non-radioactive hybridisation probes prepared by chemical labellingof DNA and RNA with a novel reagent photobitio.Nuci Acids Res, 1985;3:745 ～761

6.BagasraO, et al. Polymerase Chain Reaction in situ:intracellular amplificaton anddetection of HIV –1 proviral DNA and other specific genes. J. ImmunologicalMethods, 1993;158～145

7.BehringerMan heim, Biochemica. Neuradioactive in situ hybridisation application Manoal,1992

8.Cai WQ(蔡文琴),et al. In situ hybridisation ofatrial natriuretic peptide mRNA in the endothelial cells of human umbilicalvessels. Histo-chemistry, 1993;100:277 ～ 283

9.Koch J,et al. Oligonucleotide – priming methods for the chromosome – specificlabelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma,1989;98:259～ 265

10.Barbara T, Pinkel D. Fluorescence in situ hybridisation with DNA probes. In :Flow cytometry (Eds zbigniew Darzynkiewice and Harry A.Crissman) Academinpress Inc, 1990;383～400

11. LiesiP, et al. Specific detection of neuronal cell bodies in situ hybridisation witha biotin – labelled neurofilament cDNA probe J. His-tochem Cytochem, 1986July;34(7):923～926

12. 正向华，蔡文琴，等. 用光敏生物素反意生长抑素(SS)cRNA 探针显示组织切片中 ss mRNA。解剖学杂志，1992，15（4）：312～313

13. 正向华, 张俐. 应用反意生长抑素 cRNA 探针原位杂交显示大鼠下丘脑生长抑素 mRNA. 解剖学杂志,1990,13(4):307

14. 何彬, 等. 一种快速敏感的原位杂交方法. 解剖学杂志,1992;15(4):312～313

15. 向正华, 蔡文琴, 等. 原位杂交组织化学与免疫组织化学结合法的研究. 解剖学杂志,1993,16:451～454

第二十一章 原位杂交技术在染色体和电镜水平的应用原位杂交免疫细胞化学技术的应用除在培养的离散细胞涂片和各种组织制片如恒冷箱冷冻切片、石蜡包埋切片外，又进一步扩展到染色体铺片和电镜水平。现分别予以介绍。

第一节 原位杂交技术在染色体铺片的应用近年，不少科技工作者将原位杂交组织细胞化学技术（ISHH）应用于细胞分裂中期（Metaphase）和分裂间期（Interphase）的染色体铺片上，利用标记的核苷酸探针与之进行杂交，可在光镜或电镜水平检测到不同的特异性的标记物。目前，原位杂交组织化学在染色体铺片的应用主要在三个方面：染色体的基因分配或基因图（Gene assignment）的研究、癌细胞或癌前组织的染色体异常的间期细胞遗传学分析研究和性染色体对胚胎的生前诊断。在依次介绍这些方法的应用以前，我们先简要介绍一个有关染色体的基本的知识和染色体铺片的制作方法。

一、有关染色体的基本知识及制片（一）染色体的形态结构体细胞的染色体是 46 个，23 个，其中 22 对是常染色体，一对是性染色体。男性一对 XY，女性为 XX。染色体的形态随着细胞周期的不同而有所改变，在光学显微镜下所看到的染色体是细胞分裂中期染色体（metaphase chromsome）。

每个染色体含有两条染色单体，呈赤道状彼此分离，只有着丝粒处相连。根据着丝粒的位置分为三种类型，中部着丝粒型，亚中部着丝粒和端着丝粒型（图 21-1）。

图 21-1 正常人体细胞的三种染色体

1．中部着丝点染色体；2. 近中部着丝点染色体；3. 近端部着丝点染色体

1. 非显带染色体特征分为七组

A 组（1～3）：为最大的具中部着丝粒染色体，这组染色体相互间很易区别。第 1 号和第 2 号染色体大小相似，唯第 2 号染色体为近中部着丝粒染色法。第 3 号染色体较 1、2 号染色体小，为中部着丝粒染色体。

B 组（4～5）：为大的具中部着丝粒染色体。2 对染色体之间在形态和长度上较难区别。

C 组（6～12 号和 X）：为中等大小的具中部或近中部着丝粒染色体。这组染色体较难区分，其中第 6、7、11 号和 X 染色体为中部着丝粒染色体，第 8、9、10 和 12 号染色体为近中部着丝粒染色体。女性为 2 个 X 染色体。男性只有 1 个 X 染色体。

D 组（13～15 号）：为中等大小的具近端着丝粒染色体。在其短臂上有随体。与他组染色体有明显区别。但 3 对染色体之间较难区别。

E 组（16～18 号）：为小的具中部或近中部着丝粒染色体。第 16 号染色体为中部着丝粒染色体，第 17 号和 18 号染色体为近中部着丝粒染色体。不过，着丝粒位置第 18 号较第 17 号染色体更近端部。

F 组（19～20 号）：为更小的中部着丝粒染色体。2 对染色体之间，形态上很难区别。

G 组（21～22 号和 Y）：为最小的近端着丝粒染色体。第 21 号和 22 号染色体大小相似，且短臂上常连有随体。Y 染色体常比第 21 和 22 号染色体大、染色深。且无随体。Y 染色体长臂 2 个染色单体比较靠拢，长臂末端也较模糊。

2．G 带染色体的特征

第 1 号染色体：识别并不困难，但初学者易把长短臂颠倒。短臂的近侧 1 / 2 处有 2 个深带。远侧有一半几乎为浅染区；短臂共分 3 区。界标为近侧的深带（2 区 1 带）和中段的深带（3 区 1 带）。长臂近侧为一窄的浅带。中段和远侧段各有 2 条深带；长臂共分 4 区，界标为次缢痕远侧的浅带（2 区 1 带）、中段的深带（3 区 1 带）和远侧的深带（4 区 1 带）。

第 2 号染色体：短臂可见 4 条深带。中段的 2 条深带常互相靠近，表现为 1 条深带；短臂共分 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带）。长臂可见 4～7 带，近侧着色甚浅，中段及远侧着色较深；长臂共分 3 区，界标为 2 个浅带（2 区 1 带和 3 区 1 带）。

第 3 号染色体：短臂近侧可见 2 条深带；远侧可见 3 条深带，其中远端的 1 条带较窄，染色浅；短臂分为 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带），长臂近侧和远侧各有 1 条较宽的深带：好的标本近侧深带可分为 2 条深带，远侧深带可分为 3～4 条深带；长臂分为 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带）。长臂深带宽度略大于短臂深带。

第 4 号染色体：短臂有 1～2 条深带，只 1 区。长臂有均匀分布的 4 条深带；长臂分 3 区；界标为 2 浅带（2 区 1 带和 3 区 1 带）。

第 5 号染色体：短臂有 1 条深带，只 1 区。长臂有 5 条深带，中段的 3 条深带常靠近；长臂分 3 区，界标有 1 深带（2 区 1 带）和 1 浅带（3 区 1 带）。

第 6 号染色体：短臂近侧有 1 宽的浅带，远侧为 1 深带；短臂分 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带）。

第 7 号染色体：短臂有 2～3 条深带，近末端带着色很深；短臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）长臂有 3 条深带，近侧和中部的 2 条带较深；长臂分 3 区，界标为 2 深带（2 区 1 带和 3 区 1 带）。

第 8 号染色体：短臂有 2 条深带，远侧深带较近侧深带着色深；短臂分 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带）。长臂有 3～4 条深带，远中的深带着色较深；长臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 9 号染色体：短臂有 1～2 条深带；短臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。长臂 2 条深带。长臂分 3 区，界标为 2 深带（2 区 1 带和 3 区 1 带）。

第 10 号染色体：短臂有 2 条深带，近侧较近侧深带着色浅；短臂只 1 区。长臂有 3 条深带，近侧深带着色更深；长臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 11 号染色体：短臂有 1～2 条深带；短臂只 1 区。长臂有 2 条深带，在近侧深带与着丝粒之间有 1 宽的浅带；长臂为 2 区，界标为 1 浅带（2 区 1 带）。

第 12 号染色体：短臂有 1 条深带；短臂只 1 区。长臂有 3 条深带，中间的 1 条深带宽，近侧深带与着丝粒的距离较第 11 号染色体近；长臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 13 号染色体：长臂有 4 条深带，中间 2 条深带宽；长臂分 3 区，界标为中间的 2 条深带（2 区 1 带及 3 区 1 带）。

第 14 号染色体：长臂有 45 条深带，近侧的第 2 条带和远侧的带着色更深；长臂分 3 区，界标为 2 条深带（2 区 1 带和 3 区 1 带）。

第 15 号染色体：长臂有 4 条深带，近侧的第 2 条带较宽；长臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 16 号染色体：短臂有 1～2 条深带，短臂只 1 区。长臂有 2 条深带，近中部深带明显；长臂分 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 17 号染色体：短臂有 1 深带；只 1 区。长臂 1～2 深带，远侧深带较宽，在深带与着丝粒之间有 1 宽的浅带；分 2 区，界标为浅带（2 区 1 带）。

第 18 号染色体：短臂为 1 浅带区。长臂有 2 条深带；为 2 区，界标是 1 浅带（2 区 1 带）。

第 19 号染色体：着色最浅。着丝粒周围为深带。短臂和长臂均为 1 区。

第 20 号染色体：短臂有 1 深带，较宽；短臂和长臂均为 1 区。长臂有 1 深带，较宽。

第 21 号染色体：最小的 1 个染色体。长臂紧按着丝粒处有 1 深带，较宽；长臂为 2 区，界标为 1 深带（2 区 1 带）。

第 22 号染色体：较 21 号色体长，长臂紧接着丝粒处有 1 深带，较窄。短臂和长臂均为 1 区。

X 染色体：短臂中部有 1 条深带；分 2 区，界标是深带（2 区 1 带）。长臂有 4 条深带，其中近槽深带最宽；分 2 区，界标是近侧深带（2 区 1 带）。

Y 染色体：长臂远侧半色着深，为 1 深带；短臂和长臂均为 1 区。

现在国内流行一种辨认 G 带每个染色体的口诀，稍加修改如下：

一秃二蛇三蝶飘，四象鞭炮五黑腰；

六号短空小白脸，七上八下九苗条；

十号长臂近带好，十一低来十二高；

十三十四十五号，三个长臂一二一；

十六长臂缢痕大，十七长臂带脚镣；

十八人小肚皮大，十九中间一黑腰；

二十头重脚脚底轻，二十一带宽身体小；

二十二带小身体大，Y 长一宽近末端；

X 短臂一、长臂三，中间象个工字般。

（二）染色体 G 显带技术1．原理染色体的化学成份是核酸和蛋白质两部分。核酸以 DNA 为主，蛋白质有组蛋白和非组蛋白两种。因此染色体经蛋白水解酶类物质处理后，蛋白质已被水解而使 DNA 分子中碱基暴露，由于碱基中 G / C 和 A / T 组合的比例不同，对染料结合的程度不一，如这一段 A / T 碱基的成份多，则 Giemsa 染料易与它结合成深染；另一段 G / C 碱基的成份多，则 Giemsa 染料不易与其结合，结果成淡染，由于整条染色体上 A / T 和 G / C 的分布不匀，这样在染色体上呈现出深浅不一的条纹或者称带纹，该技术用 Giemsa 染色，故其带型称为 G 带。

2．操作过程

（1）按常规染色体技术制片。

（2）制好的染色体玻片，在 80℃烘箱中，烘烤 2h，置于室温。

（3）4℃冰箱 PBS 液 5min。

（4）4℃冰箱 PBS 缓冲液含胰蛋白酶终浓度 0.025%，消化 10min。

（5）蒸馏水洗净胰酶。

（6）Giemsa 染色 20min。

（7）蒸馏水洗净染色液，晾干镜检。

4℃低温胰酶处理片子，其优点是：时间较长，易掌握。配制 1 次试剂可用 1～2 个月。

（三）高分辨染色体 G 带技术1．原理常规的 G 带显带技术，在人类染色体中仅观察到 320～450 条带纹，对于一些染色体细微结构异常的识别是不够的。

氨甲碟呤抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸转变为四氢叶酸，从而干扰了脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成，阻止了 DNA 的复制，使细胞被阻止在 S 期内。胸腺嘧啶核苷解除氨甲喋呤的作用，让被阻滞的细胞同时开始进行 DNA 复制，进而同步分裂；放线菌素 D 可增加染色体的长度，能显示更多的亚带。放线菌素 D 与核酸相互作用：①插入脱氧鸟嘌呤核苷酸和脱氧胞啶核苷酸之间，使 DNA 变长；②能与染色体缩短有关的特殊蛋白和 DNA 结合，因此，抑制了染色体正常的收缩过程。秋水仙胺抑制纺垂丝的形成，可以得到较多的晚前期、前中期、早中期的分裂相。这样染色体带纹可增加到 500 和 850 条，甚至可达 1200～2000 条之多。这一步对于研究较细小的染色体缺陷的基因定位，具有很大的意义。

2．材料和方法

（1）4ml 培养液（为从日本进口的 RPMi 1640 或从美国进口的 F10 液）虽自制的小牛血清 1ml。每 ml 加青、链霉素各 100 单位，pH=7.2。

（2）每瓶培养液内，另加自制的 PHA 或重庆产的 PHA2.5mg。

（3）取外周血 2ml，分别装入含培养液的 4 个培养瓶内。

（4）37℃孵育箱内培养 72h。

（5）加入氨甲喋呤，最终浓度 10-7mol/L，继续培养 17h。

（6）用不含血清的培养液冲洗两次后，将上清液吸出，再加入含胸腺嘧啶核苷（最终浓度为 10-5mol/L）的培养液，继续培养 3h。

（7）再加入放线菌素 D，最终浓度为 3μg/ml，培养 2h。

（8）加秋水仙胺，最终浓度为 0.03μg/ml，培养 2h。

（9）按常规染色体技术制片。

（10）按一般常用的 G 带显带技术，显示带纹。

3．注意事项

（1）高分辨染色体，重叠多，应增加固定次数和固定时间，可置于 4℃冰箱存放 24h 后制片，用高距离滴片，以使染色体分散开。

（2）细胞培养液同步化后，如果用 5 - 溴 - 2 脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU），则需加黑物包装进行暗培养。

（四）外周血培养及染色体制片技术1．国内应用的外周血培养染色体技术

（1）原理：外周血染色体制备是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术，亦是基本的实验技术，由于取材容易，培养过程比较简单，短期内可以得到结果，所以其实用价值很高。

血液中含有红、白两类细胞，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核，无分裂能力；白细胞类虽有细胞核存在，但是外周血中处于休止期。植物血球凝集素（简称 PHA）能促使淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞。染色体只有在细胞分裂中期时最典型。秋水仙素类药的药物能抑制纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，低渗处理使细胞膨胀，细胞膜破裂，染色体分散，这样就可便于分析。

简意流程图：

（2）操作过程

①采血：无菌干针筒从静脉取血 1～2ml，用肝素抗凝（约每毫升全血内含肝素 100 单位）。

②培养液配制：RPMI 1640 4ml

小牛血清 1ml

1%PHA（自制）0.2ml

调节 pH 为 7.4 后置于 -20℃冰箱

③标本接种：每 5ml 培养液加入抗凝全血 0.5ml。

④培养细胞：将接种好的培养瓶置于 37℃恒温箱中培养 72h。

⑤阻止分裂：培养至 68h，加秋水仙素，最终浓度 0.02μl/ml，摇匀后置于 37℃恒温箱中继续培养 4h。

⑥收获：培养物混合后，置于 10ml 离心管内，离心 10min（1000 转 /min），去上清液。留下培养物。

⑦低渗处理：低渗液可用 0.56% 的 KCl（或 0.075mol/l KCl）5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于 37℃水浴箱中保温 20min，然后加入固定液（3 份甲醇：1 份冰乙酸）1ml 用吸管打匀，预固定 1～2min。

⑧离心：1000 转 /min 离心 10min。

⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液 6～8ml，用吸管将沉淀物打散，固定 30min 后离心，1000 转 /min 离心 10min，取出吸去上清液留下沉淀。

⑩重复上述固定离心 1 次。

⑾标本制作：最后 1 次固定、离心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鲜固定液约 0.3ml 打散细胞悬浮液即可进行制片。制片之前先将载玻片经清洁液洗净处理后，置于冰箱内制成冰片。取冰片 1 张滴上 2～3 滴细胞悬液。利用冰片的表面张力关系使液体迅速向玻片四周散开，与此同时用嘴轻轻吹向滴片处，以助其更快散开，然后在酒精灯火上通过 7～8 次后，自然干燥或烤干均可。

⑿染色：Giemsa 染液 1 份和 pH7.4 磷酸缓冲液 9 份，混合后，染色 20min，蒸馏水洗去余下染液，晾干，镜检观察。

（3）注意事项

①无菌操作是关键。培养液不得污染。

②所用药品不得失效，特别是 PHA，既要使淋巴细胞转化，又不能过量。

③小牛血清优质、无菌。

④秋水仙清素低浓度 4～6h 效果最佳，过量则染色体易收缩。

⑤固定液和 Giemsa 染液要求新鲜配用。

⑥培养时间 72h 较好。

（4）各种物品清洗与消毒

①玻璃器皿用后，立即用自来水冲洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗。待干，泡入清洁液 24～48h，取出，自来水冲洗，再用双蒸水冲洗，干后备用。

②接触洗液时，带上橡皮手套，围裙等防护品。

常用清洁液配制：

重铬酸钾 25g

水 200ml

浓硫酸 1000ml

③先将重铬酸钾在水中溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，防止过度发热。使用 3～6 月后检查，若变绿表示失效。

④G5、G6漏斗的处理：水洗净、晾干，于浓硫酸泡（或洗液中泡）24h，再用蒸馏水冲洗至加入 1%BaCl2滴无白色沉淀为止。包装消毒，15 磅 20min。

（5）橡皮塞的处理

新的橡皮塞洗后，先用 0.5N NaOH 煮沸 15min，再用 0.5n HCl 煮沸 15min，流水冲洗 10min，用双蒸水泡 24h，双蒸水冲洗，晾干，15 磅 20min 高压灭菌。

（6）金属器械清洗

先用纱布或纸擦去防锈油，然后用洗涤液清洗，再用清水或蒸馏水洗净，擦干或烘干备用。

2．外周血细胞培养法（Bhatt B and McGee JOD,1990）

（1）收集静脉血（无菌），加肝素抗凝（20 单位 /ml）；

（2）加 0.8ml 全血入每个培养瓶（含 10ml 培养液），37℃培养 72h；

培养液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)

小牛血清 20ml

PHA 2.0ml

（3）加 100μl Brdu 于培养瓶中，37℃再孵育 16～17h；

（4）离心（1200rpm）8min，弃去上清液，沉淀中加入 10ml RPMI 1640 培养液，混匀；

（5）重复步骤（4）；

（6）沉淀中加入 10ml 新配制的完全培养液（含 2.5μg/ml 胸腺嘧啶），重新置于 37℃孵育 6～7h；

（7）在收获培养细胞前 15～30min，可加 Colcemid, 但当同时应用 BrdU 时这就并非十分必要。因为 BrdU 是胸腺嘧啶核苷的类似物，能使染色体在富含异染色质处断裂分解，从而使显带明显；

（8）1200rpm 离心培养细胞，弃去上清液，加入 1ml 0.56% KCl（事先预热至 37℃），继续加入 0.56%KCl 使总容量达到 10ml，在 37℃孵育 10min；

（9）如上述离心，弃去上清液，在沉淀的细胞内加入新鲜的冷固定剂，（甲醇：冰醋酸 =3：1，新鲜配制，保存在冰上），置冰上至少 20min；

（10）重复步骤（9）3～4 次，直至细胞悬液清洁无色；

（11）可较长期保存在冰的固定剂内（-20℃）或再离心后加入 0.5～1.0ml 新鲜固定剂，置于冰上；

（12）玻璃载片放在 Decon（清洁液）或其它的清洁液内过夜，次日用自来水冲洗，继之蒸馏水漂洗，在 60～75℃干燥，然后把载片孵育在 2% 丙酮液内，室温，60min。自来水冲洗，再在 60～75℃干燥；

（13）每张载片上加 10μl 的细胞混悬液，空气干燥，在 24h 后可应用于杂交实验，也可保存在 -4℃达 8 周之久（试剂配制法见附录四）。

二、应用 ISHH 技术对染色体制片、基因分配（Chromosomalassignment of genes）的研究（一）基本原理

染色体上基因位置分配的研究，又叫染色体图的研究，包括基因名称、基因在染色体的位置及与相邻基因的距离及其核酸序列的研究。研究基因图的方法包括家系的连锁分析法、体细胞杂交法、重组 DNA 技术和原位杂交法。果蝇的线形基因图和大肠杆菌、T4噬菌体两者的环状基因图都已绘成，目前正致力于人类基因图的绘制。人类基因约有 5 万～10 万个，根据第八次国际人类基因定位工作会议，已定位的人类基因总数达 1479 个。

ISHH 技术对染色体基因图的研究，是用同位素或生物素、地高辛标记的核酸探针，直接同中期的染色体铺片行杂交。早期的研究是用于重复序列 DNA 的定位，如编码核糖体的基因 18S 和 28S 核糖体 RNA 定位于第 13～15 号染色体和第 21～22 号染色体短臂次缢痕区。5S 核糖体 RNA 定位于第 1 号染色体上长臂的远侧 Iq42～Iq43。近年已能进行单拷贝基因的定位，如胰岛素基因定位于 IIp 15 上、C-mos 原癌基因定位于 Sq22 上、N-ras 原癌基因定位于 IPI34。在染色体 11 的短臂上，利用 ISHH 技术证明 4 个基因依次排列，从短臂的远端依次为胰岛素、β- 球蛋白、HRASI 和 PTH。

（二）操作步骤（Bhatt and MCGee, 1990）

在前面已介绍了制备血培养染色体铺片的方法。下面介绍的是在染色体制片上用免疫金银染色法进行原位杂交的基因定位显示、结合 Giemsa 染色显带技术的操作步骤。

1．移除内源性 RNA

（1）加 100μl RNA 酶溶液，覆以盖玻片，放在有少许 2×SSC 溶液的湿盒内孵育，37℃，60min。

（2）在 2×SSC 溶液内移除盖玻片，以 2×SSC 洗 2×3min。

（3）等级酒精系列脱水，10%，50%，70%，90% 和 100%，各 1min，各 1min。空气干燥。

2．探针标记和纯化用缺口平移法将生物素 11-dUTP 标记在 DNA 核酸探针上。

3．变性与杂交

加 20～100ng 生物素标记探针到杂交液中，加入 5μl 20mg/ml 人或鲱鱼精子 DNA，总容量为 30～40μl，离心 5s，混匀后，滴于染色体铺片，覆以盖玻片，盖片四周以橡皮泥封固。放入盛 2×SSC 溶液温盒内 75℃7～8min，使之变性，继之于 37℃孵育 16h。

4．杂交后漂洗 2×SSC 溶液内移除盖玻片，将载片浸入含 50% 甲酰胺的 2×SSC 溶液内，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗

溶液 漂洗时间温度

2×SSc 20min42℃

1×SSC20min 室温

0.1×SSc 20min 室温

5．免疫细胞化学显示

（1）孵育载片于 PBt 15min，将片缘及背面擦干，加 100μl 一抗于载片（兔抗生物素抗血清 1：100，以 PBT 稀释），孵育于 37℃40～60min。

（2）快速用 PBT 冲洗，擦干片缘及背面，加 100μl 二抗抗血清（羊抗兔 IgG 结合 10～20nm 金粒，以 PBT1：50 稀释）于载片染色体铺片部位，37℃孵育 45～60min。

（3）PBS 洗 3×5min。

（4）蒸馏水洗 3×5min。

（5）加数滴银溶液于载片上，在光镜下监测，大约需 5～18min 可见在染色体上出现银斑点。

（6）蒸馏水洗。PBT 配制见附录 3。

6．显带复制（Replication banding）

（1）应用 5μg/ml Hoechst 33258 在 2×SSC 溶液内，暗室中染载片 20min。

（2）蒸馏水洗，以 2×SSC 封固，覆以盖玻片，盖片四周封以橡皮泥。

（3）紫外光照射 1～16h。

（4）蒸馏水洗和以 10%Giemsa（磷酸缓冲液稀释，pH6.8～7.2）染色 10min。

（5）蒸馏水冲洗，空气干燥，以 DPX 封固。

（6）光镜下观察，可见棕色的银斑点在染色体上的定位，并显示其与染色体分带的关系。

三、利用 ISHH 技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究（一）基本原理

在恶性的或癌前病变的组织，染色体组含量与结构的畸变在部分病例中与疾病的预后相一致。由于染色体基因的变化可能导致肿瘤的发生与进展，利用一些技术预测这些遗传物质的变化可为恶性肿瘤的检测及了解其进展和预后提供资料。流式细胞计（FCM）和染色体组型，即核型分析（karyothping analyses）等技术曾被用于这个领域的研究。FCM 可测定肿瘤细胞 DNA 的含量，但它不能显示特异性染色体的结构异常，而且对微量的 DNA 含量改变难以检测。核型分析可以显示染色体结构和含量的变化，但要分析肿瘤细胞的核型只有在细胞培养以后。细胞培养时细胞的高度分裂指数和细胞的生长会导致染色体物质的丢失，而且核型分析不能显示特异性 DNA 探针的原位杂交技术，能够检测在细胞分裂间期细胞核内染色体数量和结构的异常变化。因此，这项技术又被称为“间期细胞遗传学分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA）。间期细胞遗传学的基本原理是利用合成的特异性 DNA 探针，标记以同位素、生物素、地高辛或荧光素，对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养细胞的染色体铺片或切片进行 DNA-DNA 原位杂交，其杂交定位以荧光法、放射自显影或免疫组化法显示。目前 ICA 已广泛应用于生前诊断、肿瘤组织活检材料的诊断和基因异常的诊断。在肿瘤细胞方面，在乳腺癌，神经系统肿瘤、睾丸肿瘤，妇科肿瘤和膀胱肿瘤等均有实验报告。现已能提供的 DNA 探针有染色体 1，7，8，9，10，15，16，17，18 和性染色体 X、Y，以及识别一些染色体特征性部位如着丝点（centromeric region）、染色体端极区（telomere region）的特异性重复靶核苷序列和随体的 DNA 探针，多数为合成的寡核苷酸探针，在应用上采取 ISHH 和 FCM 以及免疫组化相结合（有时还结合核型分析）的综合研究法（图 21-2），也可用多种标记物显示不同颜色或不同标记在一张切片上同时显示多个染色体的结构或 DNA 含量异常，如异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明 200 结合，前者显示黄绿色，后者显示红色，ABC-DAB 显示法与地高辛 - 碱性磷酸酶系统相结合，前者反应物为棕色，后者为紫蓝色。这种联合应用法又叫多靶点原位杂交法（multiple-target ISH）。

图 21-2 肿瘤组织处理流程图

（二）基本操作方法

1．玻片与组织前处理

（1）肿瘤细胞混悬液的制备：新鲜的从活检或外科手术或尸检获得的材料建议按图 21- 2 的流程处理进行综合研究。用以制作细胞混悬液的组织在处理前可保存于液氮内。组织块在玻皿中切碎或用细胞打碎机打碎，用 100μm 孔直径的尼龙网过滤器滤过，固定在 70% 乙醇，-20℃，如保存于 -39℃可保存数月至数年。

（2）分离的细胞由于表面有细胞质的覆盖，在荧光显微镜下会显示强烈的自动荧光，从而掩盖了 ISHH 的信号。可采取下列两种方法移除覆盖的细胞质；

①乙醇固定后的细胞，应用以前在新鲜制备的甲醇 / 醋酸（3：1）固定液内 0℃，5min。滴 2～3 滴固定后的细胞混悬液于涂有粘附剂的载片上，空气干燥，然后快速浸入 70% 醋酸内 10～60s。应用蒸馏水洗，在 100% 乙醇内脱水，空气干燥。

②应用胃蛋白酶蛋白水解作用。加 5μl 细胞混悬液于载片上，空气干燥 30min 或在 80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500 单位 /mg 蛋白质，Sigma,USA）应用 0.01mol/L HCl 稀释至 50～400μg/ml，10min 37℃；再用 0.03% H2O2和 PBS 漂洗，以 4% 多聚甲醛固定，0℃，5min；载片脱水，空气干燥，在 80℃加热变性 30min。这个方法较①更好，能移除蛋白质、暴露核 DNA 和有助于探针的穿透，最重要的能较好的保持形态学的结构，以利于 ISHH 的荧光信号的显示。应用①法，细胞经常呈扁盘状，而且细胞质的自动荧光未完全消失，影响 ISHH 荧光信号的显示，但实验表明，必须严格掌握胃蛋白酶的浓度，过低，由于细胞质的覆盖，基因拷贝数会减低，而过高浓度的胃蛋白酶会导致过度消化影响细胞的形态结构。

（3）组织切片处理

①冷冻切片：切片厚 5μm，放置有粘附剂的载片上，空气干燥，固定在 4% 多聚甲醛 -PBS 溶液，0℃，15min。固定后以 PBS 和 0.01n HCl 漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用 0.01N HCl 配制），37℃，30min，PBS 漂洗 2×5min，在 4% 多聚甲醛内固定 15min（0℃），PBS 洗 2×5min，系列等级乙醇脱水，空气干燥。杂交前，在 80℃加热 30min 使之变性。

②石蜡切片：切片厚 5μm，漂洗在 40℃温水中，捞片于有粘附剂的载片上，空气干燥，56℃加热 1～16h，二甲苯脱蜡 2×3min 甲醇冲洗 2×5min。应用 1%H2O2（用甲醇配）溶液封闭内源性过氧化物酶活性。以甲醇冲洗，空气干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml, 用 0.2n HCl 配）37℃ 30min。消化后，载片以 PBS 冲洗。在杂交前，载片孵育于 1% 甘氨酸溶液 -PBS 中 15min，以 PBS 冲洗和系列酒精脱水，空气干燥。载片在 80℃孵育 30min 使之变性。

2．杂交本实验的杂交液略区别于其它实验，否则染色体 1 号和 18 号的 DNA 探针不仅结合 1 号和 18 号染色体，还会同时结合染色体 9，6，13，21。杂交液配方：

甲酰胺 60%（V/V，2×SSC 配，pH5.0）

鲱鱼精子 DNA 1μg/μl

余与一般杂交液配制相同

对多靶点 ISHH，须另加入 1mmol/L KCN 入杂交液，每张载片加 5μl 的含特异性 DNA 探针（2.5ng/μl）的杂交液，以盖片覆盖，四周用橡皮泥封固，先在 80℃热板上 5～10min 使 DNA 变性，细胞混悬液制片变性时间只需 2.5min，然后在 37℃杂交，孵育过夜。

3．杂交后漂洗同本节（二）杂交后漂洗步骤。

4．显示步骤根据标记物的种类（同位素、荧光素、生物素或地高辛）分别进行显示（与第二十章 中叙述相同）。

5．结果在光镜下可见染色体结构的改变，如在膀胱肿瘤细胞，其 DNA 含量经 FCM 显示高于正常组织 1 倍，在双靶 ISHH 显示载片上，可见肿瘤细胞间期核内，1 号染色体为 3 倍体，而 18 号染色体为 2 倍体。在肿瘤细胞内应用双重靶点或多重靶点 ISHH 技术可见细胞间期核内多个染色体的众多畸变相。

ISHH 技术作为一项快速与敏感的侦检细胞间期细胞核内染色体畸变的新技术，可结合病理材料的常规组织切片、免疫组化染色和 FCM 等对病检材料做出早期的、准确的诊断，并对肿瘤的预后与进展等有所了解。本技术成功的关键在于具有特异性的 DNA 探针和 ISHH 的侦检程序，比如染色体的拷贝数与肿瘤细胞前处理的方法有关，如移除蛋白质不彻底，就会使侦检到的染色体拷贝数减少。又如在切片上进行细胞间期染色体的 ISHH 时，常见到一些细胞核碎片呈不同形状的斑点状（在涂片上不会出现此种图像）。对 ISHH 所获得资料的分析，须经过反复的实践，比如模糊的或分裂的斑点可以是非整倍体（aneuoploidy）的假阳性反应，产生于细胞周期的 G 2期。

四、利用性染色体特异性 DNA 探针的 ISHH 技术（一）基本原理

利用性染色体 X 或 Y 的特异性 DNA 探针的 ISHH 技术进行胎儿生前（Prenatal）性别的诊断，样品取自于羊水、绒毛或胎儿的血液。近年，科技工作者又成功地进行了胚前（pre-embry-o）或植入前（preimplantation）的 ISHH 诊断。所谓胚前诊断是在受精卵植入子宫内膜前的 4～6 细胞期，以显微操纵器（micromanipulator）或微型吸管穿破透明带，将分裂球或其中的部分细胞吸出放入培养液内，应用 ISHH 技术进行性染色体的分析，如有染色体畸形，可及早移除，避免以后进行人工流产术。本技术可还用于鉴别精子是带 X 或 Y 染色体。如果 1 个妇女遗传性基因是与 X 染色体相联系的，那么可给予人工授精只带 X 染色体的精子以避免其子代有遗传疾病的危险。当然带 X 染色体的精子的分离技术还有待于研究和建立。目前这还是一种实验性设想。羊水可在 16～20 周妊娠期吸取。在 18～19 周时，20ml 的羊水内大约含 100 万个细胞，含大约 7μgDNA。绒毛膜的绒毛可在 3～6 月取，每次可获 5～50mg 的组织。应注意在应用前清除母体细胞。胎血 0.2～0.7ml 可在 17～40 周采取，在 15～21 周，胎血中含 2×109白细胞 / L 和类似数量的有核红细胞（Miller et al, 1985）。在 32～34 周，有核红细胞的比例数降至 0～50/ 每 100 个白细胞。这种以性染色体为探针的 ISHH 技术，可应用于分裂中期的染色体铺片上，也可以应用于间期细胞核制片。性染色体 ISHH 技术在下列场合特别有用，如（1）当无足够的分裂细胞供可靠的细胞遗传学分析时；（2）当胎儿面临性染色体连锁遗传性疾病的危险而需做迅速的性别确定时；（3）协助鉴别 45，X/46，XY 镶嵌和其它异常染色体的镶嵌类型；（4）当一雌性具有一 Y 染色体的杂交时，应检查其父母的血样品，因为在正常情况下有部分的雄性具有 2 个 Y 染色体。这里只叙述了性染色体在 ISHH 技术的应用，如用同样技术标记其它染色体也可能对其它遗传性疾病进行诊断，如 Julien 等（1986）曾应用染色体 21 号 DNA 探针于间期细胞核，出现 3 倍体，为常见遗传性疾病 Down 氏综合征的诊断特征（发病率为 1 /700 出生者），同样，在 Edward 氏综合症（遗传性疾病出现率 1 /3000 出生者）显示 18 号染色体为 3 倍体。West 实验室进行了大量的性染色体的 ISHH 实验，并比较了各种标记物的优缺点，他经反复实验后承认非放射性同位素标记物如生物素、地高辛具有许多优点，但在性染色体的 ISHH 显示，他认为至少在他的实验室同位素3 H 的标记优于其它的标记物。

（二）基本操作方法

1．Y 染色体3 H 标记 DNA 探针原位杂交技术

（1）探针标记，以3 H 标记 Y 染色体 DNA 探针（详见第 19 章）。

（2）原位杂交

①RNA 酶的前处理：取 1ml RNA 酶保存液（10mg/ml）于 250ml 2×SSC 内，预热于 37℃水浴中。选具有适量的细胞分布的载片孵育于稀释的 RNA 酶溶液中，37℃，1h。系列等级乙醇脱水，70%，90%，100% 乙醇各 2min，空气干燥。

②相当 250ml 的预杂交液（含 70% 甲酰胺，0.6×SSC 配），70℃水浴。置载片于此预杂交液内 2min 以使靶 DNA 变性，如（1）经系列等级乙醇脱水，空气干燥。

③DNA 探针准备与变性

杂交液：10×SSC20%

tRNA 10%

甲酰胺 50%

硫酸葡聚糖 20%

DNA 探针 -3H 20%

均匀混合，70℃水浴 5min 使探针变性，然后迅速置冰上冷却。

10×SSC：1.2mmol/L NaCl

0.15mmol/ L 醋酸钠

0．2mol/L NaPO4

tRNA(SigmaR1759)4mg/ml(用 TE 缓冲液配)，-4℃保存。

TE 缓冲液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。

每张载片加 20μl 含探针的杂交液，覆以盖玻片，四周用橡皮泥封固，于 37℃孵育过夜。可测定3 H 的放射比性，以了解每张载片的探针含量。

④杂交后漂洗，次日移除盖玻片，用缓冲液 39℃漂洗

50% 甲酰胺 1×SSC 4×5min

1×SSC 39℃ 4×5min

⑤系列等级乙醇脱水，70%，90%，100% 各 2min，空气干燥。

（3）放射自显影（详见二十章 第一节）：浸入核乳胶，暗盒于冷室或 4℃冰箱储存，显影，定影，复染，封固和观察。应用3 H 标记 pHY2.1DNA 探针，其曝光时间大约为 6～7 日。

2．杂交前精子的处理

（1）取 1ml 用缓冲液清洗过的精子，加 1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA 加 1940μl 的 BWW 培养基)。留置于室温 5～10min，离心（1000rpm(175×g)5min。

（2）弃上清液，沉淀的精子内加 1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT, 二硫苏糖醇)，配法：154μl 的 DTT 加 1846μl(4g/ml)BWW 培养基（Gibbers et al, 1971），置室温 45min, 再离心 1000rpm 5min。

（3）弃上清液，用 BWW 培养基再稀释、离心。

（4）加新鲜配制固定剂（甲醇：醋本以 =3：1），反复混匀或置于漩涡式的混匀器上混匀，室温 30～60min，离心。

（5）加数滴新鲜固定剂于离心管中，如上再混匀。迅速从混匀液中取 2～3 滴精液滴于载玻片上，空气干燥，以相差显微镜检查确有精子存在，保存在清洁的干盒中备用。

（6）在 ISHH 以前，取出载片，加数滴 0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/ 每 2ml BWW 培养基)，静置 5min，倾去 SDS（十二烷基磺酸钠，配制法见附录 2），以 2×SSC 漂洗，系列等级乙醇脱水，70%，90%，100% 各 2min，空气干燥。

（7）杂交步骤同上，杂交后以 0.5% 伊红黄（Eosin yellow）复染，自来水冲洗，空气干燥，DPX 封固。

本节 简要介绍了 ISHH 技术在染色体铺片应用的三个方面，并摘要介绍了它们的应用及操作方法。由于这一技术在国际上也处于刚起步阶段，其发展主要在近 10 年，国内尚未开展，因此，此一技术的应用还有待于不断的摸索与完善。必须说明的是 ISHH 在染色体制片的应用也需设置对照实验组（详见第二十章 第一节）。

第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用自 Gall 和 Pardue 建立了原位杂交技术以来近 20 余年内，这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其它技术难以取代的作用。近年来，此一技术的应用领域逐渐扩大并在两个主要进行了技术法的改进。一方面是应用一系列放大手段增强检测的灵敏度（详见二十二章），另一方面是提高其分辨率，即向电镜水平发展。Jacob（1971）首先用3 H 标记的核酸 RNA 探针与 DNA 杂交并在电镜水平显示获得成功，继后不少科技工作者在这方面做了大量的工作（Manning et al 1975,Steinert et al1976,Hutchison et al 1982）。但所应用的均是同位素标记核酸探针，直到 1986 年 Binder 首先用生物素标记的 rDNA 及 UI 探针，在蜂蝇（Drosophila）卵巢，应用 Lowicryl-K4M 低温包埋的切片上进行原位分子杂交，以蛋白 A 和胶体金复合物作为显示系统，较好的保存了组织的形态学结构和较高的信噪比例。Webster 等人（1986）应用生物素标记探针显示了细胞内 mRNA 的分布。Singer 等（1989）成功的用双标记原位杂交技术，一方面检测整装抽提细胞内与骨架结合的 mRNA，同时显示了该 mRNA 所表达的蛋白质。新近 Fischer 等利用地高辛标记 rRNA 探针在 Lowicryl-K4M 包埋的切片进行杂交，然后以抗地高辛等抗体结合胶体金颗粒进行显示，以银显示法加强获得极为满意的定位。总之，电镜水平的原位分子杂交技术在国外还处在不断提高和改进的阶段，在国内此一技术还刚起步。焦仁杰等（1992）报告了以生物素标记腺病毒的基因组探针与整装抽提的细胞进行电镜原位杂交技术，成功地证明了腺病毒 DNA 与核骨架的紧密结合关系，胶体金颗粒呈簇状与串珠状结合在核骨架上。向正华等（1994）应用地高辛标记探针结合 HRP 的包埋前染色法显示了 POMc mRNA 定位于神经元的粗面内质网上。下面列举几种代表性的电镜原位杂交技术。

一、应用同位素标记 cRNA 探针电镜原位杂交技术于染色体制片（Hutchison et al,1982）（1）将整封染色体铺片放置于金网上，在 70% 的酒精蒸汽固定 4～15h，空气干燥。

（2）以强碱使 DNA 变性，将金网置于 2×SSC 内（应用 0.1n NaOH 调整至 pH12），室温，2min。

（3）脱水，以 70% 和 95% 酒精各冲洗 3 次，空气干燥。

（4）杂交，金网覆于平面玻璃皿（Petri dish）内的杂交液滴上，每滴约 10～15μl，将此小碟置于盛于杂交缓冲的大塑料盒内，保持湿润，在 60～65℃孵育 4～24h。

杂交液的配制：6×SSC 或 6×TNS（1×TNs =0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris,Ph6.8, 含 30000～50000cpm/10μl3h cRNA）。

（5）杂交后冲洗，金网自杂交液中取出后立即用大量的 2×SSC 冲洗多次。RNA 酶溶液（20μg/ml）室温冲洗，然后再用 2×SSC 室温冲洗，冲洗后梯度酒精脱水（70%，95%）空气干燥。

（6）浸入乳胶膜，应用 L - 4 核乳胶液，水稀释 4 倍。浸膜后的金网，用胶带固定在载玻片上放在密封的黑色塑料盒内，4℃，时间根据同位素种类和靶 mRNA 含量而定，也可选择不同时间曝光，根据显影强弱确定最终显影的时间。

（7）显影。暗盒自冷房或冰箱中取出后，在室渐中回暖至少 30min，以防核乳胶膜皱缩。然后在显影液（Kodax Microdol X）显影 3～5min，温度 18～24℃。水冲，在 15% Kodax 快速定影液定影 5min，然后在空气中干燥。

所有溶液应尽可能新鲜配制。

（8）电镜观察。

二、应用生物素标记 DNA 探针电镜原位杂交技术（一）基本原理

应用 DNA 探针缺口翻译（nick translation）方法，通过碱基配对以一条 DNA 链为模板，将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如 Bio-dUTP 渗入有缺口的 DNA 链。将生物素标记的 DNA 探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种：一种是用 HRP 显示，类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法，利用地高辛 - 过氧化物酶 HRP 显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色，其步骤与第二十章 叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同，只是为了减少细胞微细结构的损伤，在包埋过程中减少 H 2O2和 Triton X-10 等易损伤细胞与组织结构的试剂用量（向正华等 1993）。在显色完毕后，取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定，脱水，包埋，切片和观察。此法利用 HRP 免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一，加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景，不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素 - 蛋白 A（PA）胶体金（gold）标记技术。用于原位杂交的电镜定位，取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后，利用抗生物素抗体 - 结合蛋白 A - 金标记杂交体的超微结构定位，类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面，有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂——Lowicryl-K4M，也有应用 LR-white 作为包埋剂的（详见第七章）。

（二）应用生物素标记 DNA 探针 -PA-gold 电镜杂交技术（Binder et al,1986）

1．固定现认为应用 4% 多聚甲醛加 0.1% 戊二醛在磷酸缓冲液中（pH7.4），为较理想的固定剂，也有主张单纯用 4% 多聚甲醛的，因经实验证明如应用高浓度 4% 的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低 60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精 / 醋酸混合液的。多聚甲醛 - 戊二醛固定时间在 15min 至 1h。然后放入 Ringer 氏液或 PBS，在 4℃含 7% 蔗糖的 0.15mol/ L 磷酸缓冲液中储存过夜。

2．脱水次日，用 0.15mol/ L 磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗 30min，然后进行脱水，①65% 乙二醇，0℃，60min；②80% 乙醇 -35℃，120min；③100%K4M：80% 乙醇 =1：1，-35℃，120min；④100%K4M：80% 乙醇 =2：1，-35℃，60min；⑤100%K4M -35℃，过夜。

3．包埋 按照 Roth et al（1981），组织块包埋于盛有 K4M 的胶囊中，在 -35℃紫外线灯（波长 360nm）照射聚合 24～48h。取出后置室温，用紫外线灯继续照射 24h，使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温，如需长期保存，宜置于 -70℃冰箱中，可保存近 1 年。

K4M 配制（中等硬度）

交联接剂（cross-linker）2.7mg

单体（monomer）17.3mg

引发剂（initiator）0.10mg

可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量，组织块的硬度增加。

4．切片超薄切片 50～60nm，捞于有覆有 Formavar 和碳膜的镍网上。

5．组织前处理和预杂交用含 0.2mol/l Tris 缓冲液的 0.1mol/ L 甘氨酸（Ph7.4）冲洗 15min，以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响，然后 2×SSC 冲洗 15min，再用变性液（70% 去离子甲酰胺，2×SSC）在 65℃处理样品 5～10min，以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中（50% 去离子甲酰胺，0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA,pH7.5）37℃预处理 15min。

6．杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴（约 20μl）上，置于湿盒内 37℃，1～2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同（详见第二十章），如为 DNA 探针须在沸水中先煮 2～3min，以使之变性，然后迅速移至冰浴。

整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。

7．杂交后漂洗

含 50% 甲酰胺的 2×SSC 液 37℃30min

含 50% 甲酰胺的 1×SSC 液室温 30min

无甲酰胺的 1×SSC 液室温 20min

样品置 1×SSc 4℃过夜

0.01mol/LPBS(pH7.2) 室温 10min

4%BSA 封闭 15min

8．羊抗生物素 IgG 抗体（sigma）1：100（稀释用 PBS 液：2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4,0.278% Na2HPO4, 另加 300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100）室温反应 2h。

9．含 0.1% BSA 的 PBS 液洗 3×30min。

10．兔抗羊 IgG 的 IgG 相连 10nm 胶体金（Sigma）1：100（稀释用 1%BSA 缓冲液：20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl,0.02mol/ L 叠氮钠，0.5%Triton X-100）, 室温反应 1h。

11．1%BSA 缓冲液 3×30min，PBS（pH7.2）15min，蒸馏水洗 5min，空气干燥。

12．醋酸双氧铀染色 20min，柠檬酸铅染色 15min，空气干燥后电镜观察。

应用本法标记有如下优点：（1）可获迅速的信号检测；（2）形态学保存较好；（3）与放射性同位素原位分子电镜杂交技术的信 / 噪比例相近。是目前公认在电镜水平应用同位素标记原位杂交技术较为理想的方法。胶体金颗粒电子密度高，明显地区别于非特异性染色与污染，能达到较为满意的超微结构定位。本技术的难点在于：①实验周期长；②亲水性低温包埋剂制作切片，由于亲水性强，捞取比较困难，切片易于破裂；③探针的纯度与杂交后彻底的漂洗，这是本实验成功的关系，而彻底的漂洗又易导致镍网切片的破裂，作用推荐应用大量漂洗液或漂洗中设置多个漂洗杯，勤换漂洗液，或用软塑料瓶加笔状喷头，增加水压等方法，但不论漂洗或喷水冲洗都必须注意水流与网面平行而不能垂直，否则更易导致切片的破裂。④杂交时间：Binder 等证明杂交 1h 即可出现特异性，到 5h 之内不断增加。Lawrence 和 Singer（1985）实验也表明杂交后 3～4h 杂交时特异性就可达到最大值，虽然此后杂交仍继续进行，杂交率并不再增加。焦仁杰等（1992）对整装细胞的试验也与上述实验相同，他们发现杂交 4h 和杂交 20h 相当，但前者的结构保存要好得多。他们实验表明，切片标本的杂交时间大约需 9～10h。因此，选择最短而又最有效的杂交时间对有效地保持形态学结构是十分重要的。Binder 认为生物素 PA-Gold 电镜杂交技术所需理想杂交时间为 1～2h。⑤应用含甲酰胺（formamide）的缓冲液漂洗易导致金粒聚集的非特异性背景，因此 Binder 在实验后建议试用以 PBS 缓冲液漂洗 5×10min 代替含甲酰胺的盐液，经证明可避免或减少这种非特异性染色；⑥多数作者发现应用 K4M 包埋剂在电镜杂交技术是最理想的，其结果可与无包埋剂的培养细胞涂片、染色体铺片等的信 / 噪比值相等。

虽然生物素 -PA-Gold 电镜杂交技术在 K4M 包埋切片获得了较为满意的结果，但 Lawarence 和 singer（1985）在比较了三种检测系统的信 / 噪（signal/Noise,S/N）得到的结果是32 P 标记为 70、3 H 标记为 20、而生物素标记的 S / N 值最低，为 10。Webster 等（1987）同时比较了生物素标记 P -HRP 糖蛋白 cDNA 探针（包埋前染色）和生物素标记 P - 糖蛋白 cDNA 探针 - 蛋白 A - 胶体金（包埋后染色）电镜杂交技术，观察 15 天大鼠三叉神经节 雪旺氏细胞髓鞘的标记，固定剂应用 PLA 溶液（4% 多聚甲，15%（V/V）饱和苦味酸）和 0.08% 戊二醛（用磷酸缓冲液配），二者均获显示，但作者仍认为应用 PA-Gold 电镜杂交技术在 K4M 包埋切片上进行载网杂交的显示结果以及形态保存更为理想。

三、应用地高辛标记 rRNA 探针的电镜原位杂交技术（一）基本原理

在地高辛标记核酸探针广泛用于光镜水平的原位杂交试验并获极为满意的结果后，科学工作者试图将其应用于电镜水平。其基本原理和生物素标记核酸探针 -PA-Gold 电镜杂交技术的基本原理相似，首先利用地高辛修饰核酸探针，与细胞或组织进行杂交，再用抗地高辛抗血清相连胶体金与之结合，进行细胞或组织特异核苷酸的超威结构定位。为增强金的显示效应，可用银加强法增强金粒的显示效应。

（二）基本操作方法（Fischer D et al, 1992）

1．组织处理

（1）固定：固定剂采用 4% 多聚甲醛（PFA，用 PBS 配制）加 0.5% 戊二醛（GA），保存在 4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝脏放入冷固定剂中（4%PFA，不含 GA），切成 1mm3左右的小方块。修整好的组织块移入另一玻皿中，内盛有 4%PFA 和 0.5%GA, 固定 2h。

（2）PBS（4℃）漂洗 3～5min。

（3）脱水

时间乙醇浓度温度

2×15min 30%4℃

30min 30%4℃

30min 50% -20℃

2×30min 70%，90%，96%，100% -20℃

注意勿使酒精挥发致使组织干燥。

（4）浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989）：由于 K4M 包埋剂有挥发性，因此，此步操作者必须带手套，在通风柜中进行，注意 K4M 包埋剂不要靠近 O 2，一切在低温下进行，最好设有恒低温的冷柜。

①Lowcryl K4M 配方

1）交联剂 A 2g

2）单体 B 13g

3）引发剂 0.075g

混合 1)，2)后，再加“3）”轻搅匀，混匀后置于 -20℃。

②浸透（infiltration），在 -20℃进行

时间液体

1h100% 乙醇：K4M（1：1，V/V）

2×1h K4M

过夜 K4M

2×3h K4M

③包埋：先将胶囊冷却，滴入几滴 K4M，然后每个胶囊内放入一个组织块，以 K4M 充满胶囊，在室温放置 30min，使包埋剂中气泡逸出。然后置于 0℃-40℃之间，利用紫外线灯 360nm 波长照射 5 天，温度必须保存恒定。然后移至室温使温度回升，胶囊变硬。

④切片：由于胶囊是透明的，包埋在内的肝组织很容易识别。修块后进行切片，由于 K4M 是亲水性的，在切片过程中注意组织块表面一定不要让水浸湿，用 200 个网眼的镍网覆以 For-mvar 膜和碳膜捞取切片，空气干燥备用于杂交。

2．探针准备 rRNA 探针以 Dig-UTP 标记，注意探针不宜过长，否则影响对组织的穿透性。如过长，可事先用第二十章 介绍的探针水解法处理。

3．杂交本步骤均在湿盒内进行，将杂交液滴滴于蜡膜上，将镍网载有切片面覆于液滴上，在 65℃杂交至少 3h。杂交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP 反意探针 10ng/μl(et 1×SSC 配，含 150mmol/L NaCl, 15mmol/ L 醋酸钠)。

4．杂交后漂洗在室温用 2×SSC 漂洗 3×5min，然后用 PBST（PBS,0.1%Tween）漂洗 2×10min。

5．显示

①以 PBST 加 BT 封闭（BT 配方：PBST，1%BSA）孵育 15min。

②应用抗地高辛抗体结合直径 1mm 的金粒，以 PBST 加 BG 稀释为 1：30，室温孵育 1h。

③以 PBST 漂洗 3×5min。

④以带笔尖嘴软塑料壶冲洗 6×15min。

⑤以银增强法，在暗室中孵育于显影液：促进液（Enhancer）1：1,4～20min。

⑥重复④。

⑦以 2% 醋酸铀（4min），枸缘酸铅 1min 染色，漂洗，空气干燥。

⑧电镜观察。

四、结语原位分子杂交技术在电镜水平的应用，或简称为电镜原位分子杂交技术是基因表达在超威结构定位的一项极有前景的新兴技术。但要使之完善，还需要做许多工作。必须说明的是电镜原位杂交技术和光镜原位杂交技术一样必须设置对照实验组，对显示的结果的解释应持审慎的态度。一般应在重复多次实验的基础上才能得出对本实验的结论，不能只凭一次实验或一张电镜照片就勿忙结论。因原位杂交技术是高度敏感、高度特异性技术，影响因素很多。电镜原位杂交技术的影响和干扰因素更多。相信在不久的将来，随着电镜原位杂交技术的广泛应用，科技工作者将从实践中对本技术的实验流程不断完善并有更多的新的电镜原位杂交技术方法涌现。

参考文献1.Bhatt Band MeGee JOD. Chromsomal assignment of gene. In：In situ hybridization, Principles andpractice (Eds：Polak JM and McGee JOD)OxFord Science Publication, 1991：149～164

2.HopmanAHN et al.Interphase cytogenetics of solid tumors. In：In situ hybridisation, principlesand practice (Eds：Polak JM and McGee JOD)OxFord Science Pulication, 1991：165～186

3.WestJD.Sexing the human conceptus by in situ hybridization. In：In situ hybridisation, applicationto developmental biology and medicine (Eds：Harris N and Wilkinson DG).CombridgeUniversity Press, 1990：205～240

4.KochJ,et al. Oligonucleotide –priming methods for the chromosome –specificlabelling of alpha satellite DNA in situ.Chromosome, 1989, 98：259～265

5.EvaniViegas –Pequignot et al.Mapping of single – copy DNA sequences on humanchromsomes by in situ hybridisation with biotinylated probes：Enhancement of detectionsensitivity by intensifield – fluorescence digital –image mieroscopy. Proc NatlAcad Sci USA. 1989,86：582～586

6.MclarenA. Prenatal diagnosis before implantation：opportunities and problems. PrenatalDiagnosis, 1985；5：85～90

7.JulenJC, et al. Rapid prenatal diagnosis of Down’s syndrome with in situhybridisation of fluorescent DNA probe. Lancet , Ⅲ：863～864

8.MillarDS, ET AL. Normal blood cell values in the early and –trimester fetus：Prenatal Diagnosis, 1985, 5：367～373

9.BuggersJD, et al. The culture of mouse embryos in vitro. In：Methods in mammalian Embryology,(Eds：Daniel JC Jr)San Francisco：Free man , 1971：86～116

10.HutchisonN et al. In situ hybridisation at the electron microscope level：Hybrid detection byautoradiography and colloidal gold, The J Cell Biology, 1982, 95：609～618

11. BinderM, et al. In situ hybridisation of the eletron microscope level：Localization of transcripts onultrathin sections of Lowicryl K4M-embedded tissue using biotinylated probesand Protein A-Gold Complexes. J. Cell Biology, 1986, 102：1646～1653

12.RothJM, et al. Enhancement of structural preservation and immunocytochemicalstaining in low temperature embedded pancreatic tissue. j Histochem. Cytochem,1981,29：663～667

13.LawrenceLB and Singer RH.Quantitative analysis of in situ hybridisation methods for thedetection of actin gene expression ,Nucleic Acids Res, 1985, 13：1777～1799

14.WeketerH deF,et al. Use of a biotinylated probe and in situ hybridisation for lightand electron microscopic localization of PmRNAin myelin –formingSchwann cells, Histochemistry, 1987, 86：441～444

15.CarlsmalarmE and Villger W. Low temperature embedding. In：Tehcniques in immunocytochemistry (EdsBullock GR and Petruoz P),Acad Press, 1989,4：29～44

16. 焦仁杰，等. 应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒 DNA 在宿主细胞内进行定位. 电子显微学报,1992,2：81～84

第二十二章 聚合酶链反应（PCR）技术的发展和应用第一节 概述聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），又称无细胞克隆技术 (“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的 DNA 片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个 DNA 分子扩增 107～108 倍，大大提高了 DNA 的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。

PCR 技术最早由美国 Cetus 公司人类遗传研究室 Kary Mullis 及同事于 1985 年发现并研制成功的；最早的应用报道是 Saiki 等 1985 年将 PCR 技术应用于 β - 珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了 1976 年 Chien 等分离的热稳定性 Taq DNA 聚合酶，使 PCR 操作大为简化，并使 PCR 自动化成为可能；1987 年 Kary Mullis 等完成了自动化操作装置，使 PCR 技术进行实用阶段。

国内复旦大学 1988 年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的 PTC-51A/ B 型 DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。

PCR 发明不到 10 年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。1991 年，期刊“PCR 方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR 技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。

1993 年度诺贝尔化学将已于 10 月 13 日揭晓，Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用 PCR 检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR 方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同 DNA 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”一名加拿大籍英国科学家 Michael Smith 因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与 Mullis 同享此荣。

第二节 PCR 技术的原理PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶 DNA 双链受热变性成为两条单链 DNA 模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA 模板结合，形成部分双链；在 Taq 酶的最适温度（72℃）下，以引物 3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以 5’→3’方向延伸，合成 DNA 新链。这样，每一双链的 DNA 模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA 分子。如此反复进行，每一次循环所产生的 DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA 特异区拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以 2 n的批数形式迅速扩增，经过 25～30 个循环后，理论上可使基因扩增 109倍以上，实际上一般可达 106～107倍。

图 22-1 PCR 基本原理示意图

假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增 30 个循环即 n =30 时，若 X =100%，则 y =230=1073741824(>109)；而若 X =80% 时，则 y =1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到 DNA 的特异扩增区带。

第三节 PCR 操作范例及反应体系的组成一、PCR 操作范例在一个典型的 PCR 反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板 DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的 DNA 引物。模板 DNa 94℃变性 1min，引物与模板 40～60℃退火 1min，72℃延伸 2min。在首次循环前模板预变性 3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸 3～5min 以上，确保扩增的 DNA 为双链 DNA。为便于了解 PCR 反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举 Perkin Elmer Cetus 公司 Gene Amp DNA 试剂盒提供的典型反应条件供参考。

表 22-1 PCR 反应混合液

成分加入体积（μl）最终浓度双蒸馏水53.510×反应缓冲液[1]10.0[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L4×dNTPs(各 1.25mmol/L)16.0各 200μmol/Lλ-DNA 模板（全长 48.5kD）10.01ng/ 次引物 1,2（各 25bp,20μmol/L）[3,4]5.01.0μmol/L（100pmol）Taq 聚合酶储存液[2]0.52U/100μl总体积（pH8.3）100.0石蜡油50～100.0扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s, 共 25～30 个循环。

注：[1]反应缓冲液 [10×] 含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）

[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50% 甘油，100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml 明胶

0.5% 吐温 20，0.5% Nonidet P40

[3][4]引物，1，2：扩增 λ - 噬菌体基因中 500bp 的片段

引物 1 序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物 2 序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意（3’）端有 2 个 bp 互补故易生成 50bp 的双体

二、PCR 反应系统的组成（一）PCR 缓冲液（PCrBuffer）用于 PCR 的标准缓冲液见 PCR 操作范例。于 72℃时，反应体系的 pH 值将下降 1 个单位，接近于 7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响 PCR 的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于 Mn2+，而 Ca2+无任何作用。

1．Mg2+浓度 Mg2+的最佳浓度为 1.5mmol/L(当各种 dNTP 浓度为 200mmol/ L 时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把 Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1～10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。

样品中存在的较高浓度的螯合剂如 EDTA 或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与 Mg2+结合而降低 Mg2+有效浓度。因此，用作模板的 DNA 应溶于 10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA 中。

dNTP 含有磷酸根，其浓度变化将影响 Mg2+的有效浓度。标准反应体系中 4×dTNPs 的总浓度为 0.8mmol/L，低于 1.5mmol/ L 的 Mg2+浓度。因此，在高浓度 DNA 及 dNTP 条件时，必须相应调整 Mg2+的浓度。

2．Tris -HCl 缓冲液在 PCR 中使用 10～50mmol/ L 的 Tris –HCl 缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris 缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa 为 8.3(20℃),△pKa 为 0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的 pH 值在 7.8～6.8 之间。

3．KCl 浓度 K +浓度在 50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl 浓度在 50mmol/ L 时，KCl 浓度高于 50mmol/ L 将会抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 对 PCR 结果没有太大影响。

4．明胶明胶和 BSA 或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为 100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和 PCR 结果，影响不大。

5．二甲基亚砜（DMSO）在使用 Klenow 片段进行 PCR 时 DMSO 是有用的；加入 10%DM-SO 有利于减少 DNA 的二级结构，使（G+C）% 含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入 DMSO 使 PCR 产物直接测序更易进行，但超过 10% 时会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此，大多数并不使用 DMSO。

（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）在 PCR 反体系中 dNTP 终浓度高于 50mmol/ L 会抑制 Taq 酶的活性，使用低浓度 dNTP 可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度 dNTPs 易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR 常用的浓度为 50～200μmol/L，不能低于 10～15μmol/L。四种 dNTP 的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。

决定最低 dNTP 浓度的因素是靶序列 DNA 的长度和组成，例如，在 100μl 反应体系中，4×dNTPs 浓度若用 20μmol/L，基本满足合成 2.6μg DNA 或 10pmol 的 400bp 序列。50μmol/ L 的 4×dNTPs 可以合成 6.6μgDNA, 而 200μmol/ L 足以合成 25μg/DNA。

购自厂商的 dNTP 溶液一般均未调 pH，应用 1mol/l NaOH 将 dNTP 贮存液 pH 调至 7.0，以保证反应的 pH 值不低于 7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用 NaOH 中和，再用紫外分光光度计定量。

（三）引物的量引物在 PCR 反应中的浓度一般在 0.1～1μmol/ L 之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成 30 个循环的扩增反应，则会降低 PCR 的产率。

（四）TaqDNA 聚合酶的量典型 PCR 反应混合物中，所用酶浓度为 2.5U/μl，常用范围为 1～4U/100μl。由于 DNA 模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。

由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的 TaqDNA 聚合酶性能也有所不同。

Cetus 公司酶定义是：1 个酶单位是指在以下分析条件下，于 74℃，30min 内使 10nmmol 的 dNTP 掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为 10min，折算成 30min 掺入量。

分析条件为 25nmol/L TAPS（三羟基 - 甲基 - 氨基丙烷磺酸钠 pH9.3,25℃）,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME（巯基乙醇），dATP、dTTP、dGTP 各 200mmol/L，dCTP 为 100mmol/L(由不标记及 α -32 P 标记混合)，12.μg 变性鲱鱼精子 DNA，最终体积 50μl。

（五）模板单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始材料是 RNA，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。虽然 PCR 可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的 DNA，但为了保证反应的特异性，还应用 ng 级的克隆 DNA，μg 水平的单拷贝染色体 DNA 或 104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。

DNA 的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的 DNA（如基因组的 DNA 时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如 Sal1和 Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列 DNA 的扩增效率略低于线状 DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng,0.1ng,0.001ng 等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。

（六）石蜡油PCR 扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少 PCR 过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加 5 倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。

三、电泳分析在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加 1% 溴化乙锭（EB）（每 100ml 加 100μl），然后将已经制备好的 1%～2% 琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品 10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离 DNA 片段的大小进行选择，一般用 1.5%～2%，电泳电压 75V，待样品进行凝胶内距胶末端 1cm 时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。

由于溴化乙锭可与双链 DNA 形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使 EB 的荧光强度增强 80～100 倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察 DNA 量可达 10ng，其荧光强度与 DNA 含量成正比。

DNA 分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照 DNA 分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析扩增的 DNA 片段。

表 22-2 电泳检测扩增结果，EB 荧光显色（254nm）

琼脂糖（%）kbPAGR(%)bp0.360～53.5100～10000.620～10.710～0.85.080～5000.97～0.58.060～4001.26～0.412.040～2001.54～0.220.0第四节 影响 PCR 的主要因素

PCR 技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品 DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买 PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR 自动热循环中影响因素很多，对不同的 DNA 样品，PCR 反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数在 PCR 自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共 25～30 个循环，扩增片段 500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要 30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度 500bp 的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度 变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。一般取 90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA 变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持 Taq DNA 聚合酶的活力，加入 Taq DNA 聚合酶后最高变性温度不宜超过 95℃。

2．引物退火温度 退火温度决定 PCR 特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由 37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）% 含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度 Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度 TTm(meltingtemperature)低 5℃，可按公式进行计算：

Ta = Tm -5℃= 4(G+C)+ 2(A+T)-5℃

其中 A，T，G，C 分别表示相应碱基的个数。例如，20 个碱基的引物，如果（G+C）% 含量为 50% 时，则 Ta 的起点可设在 55℃。在典型的引物浓度时（如 0.2μmol/L）, 退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

3．引物延伸温度 温度的选择取决于 Taq DNA 聚合酶的最适温度。一般取 70～75℃，在 72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达 35～100 个核苷酸 / 秒。每分钟可延伸 1kb 的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH 值、盐浓度与 DNA 模板的性质。扩增片段如短于 150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因 Taq DNA 聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于 100～300bp 之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于 1kb 以上的 DNA 片段，可根据片段长度将延伸时间控制在 1～7min，与此同时，在 PCR 缓冲液中需加入明胶或 BSA 试剂，使 Taq DNA 聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20% 的甘油有助于扩增 2.5kb 左右或较长 DNA 片段。

4．循环次数 常规 PCR 一般为 25～40 个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。

扩增结束后，样品冷却并置 4℃保存。

二、引物引物设计要扩增模板 DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶 DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5’端决定扩增产物的两个 5’末端位置。由此可见，引物是决定 PCR 扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。

引物设计的必要条件是与引物互补的靶 DNA 序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为 15～20 个碱基，可以用 DNA 合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：

1．引物长度 根据统计学计算，长约 17 个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为 1 次。因此，引物长度一般最低不少于 16 个核苷酸，而最高不超过 30 个核苷酸，最佳长度为 20～24 个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过 72℃）下不会形成稳定的杂合体。有时可在 5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物 5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。

有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。

2．（G+C）% 含量 引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）% 含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）% 含量时宜接近于待扩增片段，一般以 40%～60% 为佳。

3．引物内部 应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。例如：

4．引物之间 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物 3’端，即使无法避免，其 3’端互补碱基也不应大于 2 个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在 DNA 聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链 DNA 片段，是 PCR 常见的副产品，有时甚至成为主要产物。

另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续 6 个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶 DNA 或样品 DNA 的其它序列也不能存在 6 个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。

5．引物 3’端 配对 DNA 聚合酶是在引物 3’端添加单核苷酸，所以，引物 3’端 5～6 个碱基与靶 DNA 的配对要求必须精确和严格，这样才能保证 PCR 有效扩增。

引物设计是否合理可用 PCRDESN 软件和美国 PRIMER 软件进行计算机检索来核定。

人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或 PAGE 纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在 25% 乙腈溶液中 4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在 -20℃冰箱中，在液体中引物能保存 6 个月，冻干后可保存 1～2 年。

三、DNA 聚合酶早在 1956 年 Kornberg 等就从大肠杆菌提取液中发现了 DNA 聚合酶，并且得到了 DNA 聚合酶Ⅰ纯品。DNA 聚合酶Ⅰ是由分子量为 109000 的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为 76000，有聚合酶活性，并有 3’→5 外切酶活力，即 Klenow 片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为 34000，具有 5’→’3’外切酶活力。因此，DNA 聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以 DNA 为模板，将 dNTP 中的脱氧单核苷酸逐个加到 3 -OH 末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是 5’→3’外切酶活力，它能从 5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985 年 Mullis 等发明了 PCR 方法，以 Klenow 片段完成 β - 珠蛋白的 PCR 后，世界上许多实验室就考虑用耐热 DNA 聚合酶代替 Klenow 片段进行 PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于 60℃（B.Stearothermophilus）到 87℃（S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热 DNA 聚合酶，但有些酶不能耐受 DNA 变性所需温度，所以无法应用于 PCR。现就 PCR 反应中常用的 DNA 聚合酶等作一详细介绍。

1．Taq DNA 聚合酶 用 Taq DNA 聚合酶代替大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段是使 PCR 普及应用的关键。Klenow 片段不能耐受 95℃的双链 DNA 变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而 Taq DNA 聚合酶可以耐受 93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和 DNA 二级结构对 PCR 的干扰，增进了 PCR 特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：①Klenow 酶的最适温度为 37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq 酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为 74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow 酶为 20 个（均用 1μg 基因组 DNA 开始）而 Taq 酶为 30 个。③延伸片段长度 Taq 酶为 10kb 以内，而 Klenow 酶为 400bp 以内。

Taq 酶由水栖高温菌（Thermusaquatics）YT1 蓖株中分离而得。此菌于 1969 年由 Brock 分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为 70～75℃。最初从中分离到分子量 60～68KDa，比活性为 2000～8000U/mg 的 DNA 聚合酶。后来 Cetus 公司的 Kary Mullis 等又分离到比活为 20 万 U /mg 的纯酶，分子量为 93910。此种 9.4KDa 酶的最适温度为 75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达 150 核苷酸（nt）/ s 酶分子。以 M 13模板，用富含 G + C 的 30bp 引物延伸，70℃时 Kact>60nt/s；55℃可达 24nt/s；37℃时为 1.5nt/s，而 22℃时低至 0.25nt/s。高于 90℃时 DNA 合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。

在 PCR 反应混合液中，Taq 酶于 92.5℃,95℃及 97.5℃保持其 50% 活力的时间分别为 130、40 及 5～6min，在 50 次循环的 PCR 中当管内最高温度为 95℃。每循环为 20s 时尚可保持 65% 活力。Taq 酶在 95℃的半寿期为 40min，故在 PCR 循环中选用的变性温度，不宜高于 95℃。

Taq 酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为 Ampli Taq（Cetus 公司）。Taq 酶的完整基因长 2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含 832 个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ有 38% 是一致的，包括对 dNTP 结合，引物与模板作用区均存在于 Taq 酶中。

Taq 酶具有依赖 DNA 合成的 5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的 3’- 磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于 5’-32 P 标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响 PCR 结果。Taq 酶没有 3’→’5’外切酶活性，如果发生 dNTP 错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用 Taq 酶进行 PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为 1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs 浓度分别为 200μmol/L，Mg2+为 1.5mmol/L，在 55℃退火)。但不含 3’→5’外切酶活性对测序有利。

2．影响酶活力的因素 Taq 酶的活力受 Mg2+ 离子的影响。用鲱精 DNA 为模板，总 dNTP 浓度 0.7～0.8mmol/L,Mg2+为 2.0mmol/ L 时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达 40%～50%。dNTP 能与 Mg2+结合，故游离 Mg2+只是结合后剩余的量。若总 dNTP 浓度高至 4～6mmol/ L 时,Taq 酶活力要降低 20～30%，即底物抑制。

dNTP 浓度低时 PCR 产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当 100μl PCR 液中含 dNTP 各 40μmol/ L 时就足以合成 2.6μg 的 DNA（dNTP 消耗一半）。

表 22-3 有机溶剂对 Taq 聚合酶活力的影响

物质浓度活力（%）乙醇<3%10010%110尿素<0.5mol/L1001.0mol/L1181.5mol/L107DMSO<1%10010%5320%11二甲基甲酰胺<5%10010%8220%17甲酰胺<10%10015%8620%39SDS0.001%1050.01%100.1%<0.1%用鲱精 DNA，70℃，10min 内 dNTP 的掺入量计算，标准条件为 100%。

纯 9.4KDa Taq 酶不含 3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于 dNTP 浓度。但 Taq 酶具有 DNA 依赖的链移位 5’→3’核酸外切酶活力。对 5’→3’32 P 标记寡核苷酸单链，或与 MB 模板杂交时均只有极少的降解力。

中等浓度 KCl 能刺激 Taq 酶合成活力达 50%～60%，最佳 KCl 浓度为 50mmol/L，浓度更高有抑制作用，>200mmol/ L 的 KCl 可使酶失活。

加入 50mmol/L NH4Cl 或 NH4Ac 或 NaCl, 可产生中度抑制或无作用。

低浓度尿素、DMSO、DMF 或甲酰胺影响不大，吐温 20/NP40 可消除 SDS（0.01% 及 0.1%）的抑制作用。

3．第二代耐热 DNA聚合酶 Stoffel 片段：Cetus 公司的 Stoffel 将 TaqDNA 聚合酶的 5’→3’外切酶活性片段（N 端 289 个氨基酸）去除，称为 stoffel 片段。其 97.5℃的半衰期从 Taq DNA 聚合酶的 5～6min 提高到 20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合 PCR（Multiplex PCR）更为有利。

Vent™DNA 多聚酶：是美国 New England Biolabs 公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌 - 能生长于 98℃中的 Thermococcus litoralis 中分离纯化得到的，故名 Vent 酶。它的一些酶学性质较 Taq DNA 聚合酶更为优越，它能耐 100℃高温且 2h 以上仍有活力，并且具有 3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比 Taq 酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在 104℃生长的 Pyococcus 菌 GB- D 株植入 Deep Vent DNA 聚合酶基因而表达的 Deep Vent DNA 聚合酶，在 95℃的半寿期达 23h（Vent 酶为 6.7h,Taq 酶为 1h）。

4．RTth 逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录 -PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于 RNA 的 DNA 多聚酶的研究也有进展。有实验表明 Taq DNA 多聚酶有依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶活性，但活性较弱。Cetus 公司于 1991 年推出一种 rTth Reverse Tran-scriptase, 有很好的依赖于 RNA 的耐热 DNA 聚合酶活性和依赖于 DNA 的耐热 DNA 聚合酶活性，二种活性分别依赖于 Mn2+Mg2+，这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需 250ng 的总 RNA 即可有效地进行 RT-PCR，得到特异的 DNA 片段，从而非常有利于逆转录 PCR 的发展。

耐热 DNA 聚合酶的研究近几年来得到长足的发展，这在 PCR 发展中起到了重要的作用。我们相信随着进一步的研究，将使人们对耐热 DNA 聚合酶的认识和应用更进一步地发展。

我国的 PCR 研究发展很快，其关键试剂 - 耐热 DNA 聚合酶 - 也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为 Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热 F 4DNA 聚合酶，其酶学性质非常接近于 Taq DNA 聚合酶，为我国 PCR 的开展提供了保证。

四、影响 PCR 特异性的因素通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响 PCR 的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变 MgCl2(有时 KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对 Taq 酶的直接作用。⑤模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在 PCR 混合物中的 4×dNTPs 中加入 7 - 脱氮 -2’- 脱氧鸟苷 -5’- 三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用 de7GTP 与 dGTP 比例为 3：1 的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替 200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。

五、扩增平坡扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的 DNA 总量。所谓平坡就是批 PCR 循环的后期，合成产物达 0.3～1pmol 时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。

造成 PCR 进入平坡的原因有：引物和 dNTP 等消耗完毕、Taq 酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：

1．底物过剩因 DNA 合成量多于反应液中存在的 Taq 酶，在 100μl 反应液中含 2.5Utaq 酶而 DNA 合成量达 1μg（3nmol 脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加 Taq 酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍 Taq 酶，才能继续保持指数增长。

2．非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的 DNA 片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。

3．退火时产物的单链自己缔合两条单链的 DNA 片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达 10pmol/100μl 时即可发生此现象，除稀释外无法克服。

4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链 DNA）。

总而言之，PCR 的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。

第五节 PCR 各处应用模式一、兼并引物（DegeneratePrimer）PCR密码子具有兼并性，如表 22-4，单以氨基酸顺序推测编码的 DNA 序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物 3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶 DNA 的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物进行 PCR，可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基，DI 的特异性主要受 cDNA 浓度影响。

表 22-4 密码兼并性

氨基酸密码子数M、W1C、D、E、F、H、K、N、Q、Y2I3A、G、P、T、V4L、R、S6注：选择使用的肽链最好避开有 4～6 个密码子的氨基酸

二、套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物扩增 15～30 个循环，再用扩增 DNA 片段内设定的第二套引物扩增 15～30 个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或 Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞 AS52 的分子突变。AS52 细胞含有单拷贝的细胞 gpt（guanine phos-phribosytransferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物 PCR 减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶 DNA 的扩增是非常有效的。

若将套式 PCR 的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至 25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次 PCR，而灵敏度与套式二次 PCR 无异，在我们最近推出的 PTc 51 气流式 DNA 热循环仪上就可以完成全部程序。

套式一次 PCR 的成功，使 PCR 检测的全过程可以在 5h 内完成，使当天出检验报告成为现实，也使 PCR 检测走入临床有了现实的基础。

三、复合 PCR（Multiplex PCR）用多对引物同时扩增几条 DNA 片段的方法称为复合 PCR。这一方法最初是由 Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej 等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时 PCR 扩增的检测方法。两种不同的军团菌（legionella）基因，一为特异嗜肺 L 基因（mip），另一种为 L -5SrRNA 基因，通过引物摇摆（staggered）添加进行复合 PCR。首先 mip 引物 PCR 扩增 7 个循环，然后加入 5SrRNA 引物 PCR 扩增 38 个循环。加入不同量的 LacZ 和 LacB 基因引物进行 PCR 扩增可以检测大肠杆菌和与人类粪便污染有关的细菌包括 E.coli 大肠菌、肠源致病沙门氏菌和志贺氏菌。

在复合 PCR 中，所有引物 Ta 值应相近。如果两对引物 Tq 值差异超过±℃10%，会使扩增产物的量明显不同，其中一种扩增产物或目的 DNA 很难观察到。另外，靶 DNA 的长度也应相近，差别大时短片的靶 DNA 会优先扩增，因此，会产生不同产量的扩增产物，为此，须采用 DNA 摇摆扩增或加入不等量的引物方法进行解决。

四、反向 PCR（Inverse PCR 或 Reverse PCR）反向 PCR 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的 DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA（见图 22-2）。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补，但两引物 3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状 DNA 片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。

该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的 DNA 片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶 DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在 YAC 或 Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向 PCR 得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

利用反向 PCR 可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知 DNA 片段的序列，并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆，建立全长的 DNA 探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列 DNA 旁侧病毒整合位点分析等研究。

图 22-2 反向 PCR 原理示意图

波浪线代表靶 DNA，方块代表测翼序列，▲和△代表限制酶切位

点，寡核苷酸引物与模板互补处标有平箭头

五、不对称 PCR（Asymmetric PCR）不对称 PCR 的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链 DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为 1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备 ss-DNA。也可用普通 PCR 制备靶 DNA 双链 DNA（ds-DNA），再以 ds-DNA 为模板，只用其中一种过量引物进行单引物 PCR 制备 ss-DNA。

产生的 ds-DNA 与 ss-DNA 由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯 ss-DNA。

不对称 PCR 主要为测序制备 ss-DNA，尤为用 cD-NA 经不对称 PCR 进行 DNA 序列分析是研究真核 DNA 外显子的好方法。

六、标记 PCR（LP-PCR）和彩色 PCRLP-PCR（Labelled Primers PCR）是利用同位素、荧光素等对 PCR 引物 5’端进行标记，据此检测目的基因的存在与否，与常规 PCR 相比更为直观，省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤，而且一次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。目前该方法只对 PCR 产物进行定性鉴定。

彩色 PCR（Colorcomplement assay）直译为“着色互补性检测”，是 LP-PCR 的一种，彩色 PCR 意译更为明确：它用荧光染料标记引物的 5’端。荧光染料 JOE 和 FAM 呈绿色荧光；TAMRA 呈红色荧光；COUM 呈蓝色荧光。不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物 5’端的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可以根据不同荧光的色泽判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。通常仅需 2 种不同颜色的引物，一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照，即可诊断基因缺失、染色体易位或感染某种病毒。检测多种点突变时，可用更多的色彩，如多点突变的遗传病、几种可疑病毒感染、HLA 位点分析都可以用彩色 PCR 同时检测多个位点。

七、加端 PCR加端 PCR（add-PCR）是使扩增产物的 5’- 末端加一段 DNA 顺序的 PCR。设计加端 PCR 的引物时，除与模板配对的那一部分外再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外一段 DNA，如加上一个限制酶的识别顺序或特定功能的 DNA 片段。Stoflet 等报道在结构基因前加上噬菌体 T 7的启动子，当然也可用于 DNA 片段的末端标记或引入特定的点突变。末端可加碱基的数量与引物的长短有关，当引物足够长时扩增产物或末端甚至可以加上十几个到几十个碱基。

八、锚定 PCR 或固定 PCR锚定 PCR（AnchoredPCR, A-PCR）主要用于分析具有可变末端的 DNA 序列，Loh 等用 A -PCR 对人外周血淋巴细胞 T 细胞受体 α - 链的 mRNA 的多变性进行了分析。先合成 cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其 3’- 可变区末端加上一个 PolyG 尾巴。Loh 等恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具 5’-polyG 尾巴的引物。带有 PolyG 尾巴的引物是一个固定点，它可以并与 PolyG 尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述 mRNA 中检出至少 20 种不同序列，每一种都是独特的，表明 A -PCR 不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于 T 细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。

九、玻片 PCR在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行 PCR，而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行 DNA 扩增的方法就称为玻片 PCR（Slide-PCR）。

图 22-3 锚定 PCR 原理示意图

先将细胞涂片或呈单层细胞，然后用甲醇 / 醋酸（3：1，V/V）、Carnoy 溶液、无水乙醇或 4% 多聚甲醛溶液固定 5～15min。用蒸馏水冲洗，干燥，直接使用或保存于 -20℃备用。在玻片上划 20mm×28mm 为免疫组化反应区。加入 30μl PCR 反应混合液，其中含 10mmol/L TrispH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/ L 引物，0.01%（V/V）明胶，0.2%BSA, 2.5u/100μl Taq 酶。然后盖上 22mm×40mm 的盖玻片，边缘用石蜡油封好。把玻片放入 PCR 热循环仪金属块上，使金属块与样品呈最大程度接触，同在聚丙烯管中一样，进行 30～40 个循环。对于较短的扩增片段在后期循环中变性温度可降低。反应后，将致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蜡油，但不取出盖玻片，用一个尖镊子轻轻拈起盖玻片一角，在相对的一角中 PCR 反应混合液呈半月形液面，用移液器回收。一般可回收 25μl 混合液，将反应产物进行琼脂糖电泳或用套式 PCR 引物按标准 PCR 进行重新扩增。片上扩增物可做原位杂交显示。

在 Slide-PCR 中，需 0.1%～1% 的 BSA。加入 BSA 可以保证扩增结果，但效率不一定很高。明胶（至少 0.0001%）, 对扩增 1kb 左右的靶 DNA 十分重要。但对小片段扩增结果影响不大。不同的样品提取方法或固定法对 Slide-PCR 都可行。

Silde-PCR 的机理可能是在起始变性过程中一部分 DNA 从细胞中洗提出来，然后在细胞和玻片的水相中进行 PCR。用地高辛标记的人全基因组 DNA 探针杂交表明在起始循环中 DNA 极微量，而 30 个循环后很丰富。常规细胞染色表明只有少量的形态改变。

Silde-PCR 对于玻片上的细胞样品提供了一种较好的方法，而不必再把这些样品从玻片上括下来，使操作简便，污染减少。本方法对于原样品量极微且需病史追踪保存的（如子宫颈涂片或涂片）具有实用价值。

十、反转录 PCR 方法检测 RNARNA 的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以 RNA 为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip-tion, RT）与 PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10 个拷贝的特异 DNA，为 RNA 病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的 RNA 互补的 cDNA 提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA 扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成 RNA 的互补链 cDNA；②加热后 cDNA 与 RNA 链解离，然后与另一引物退火，并由 DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链靶 DNA，最后扩增靶 DNA。

在 RT-PCR 中关键步骤是 RNA 的逆转录，cDNA 的 PCR 与一般 PCR 条件一样。由于引物的高度选择性，细胞总 RNA 无需进行分级分离，即可直接用于 RNA 的 PCR。但 RT-PCR 对 RNA 制品的要求极为严格，作为模板的 RNA 分子必须是完整的，并且不含 DNA、蛋白质和其它杂质。RNA 中即使含有极微量的 DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与 RNA 结合后会影响逆转录和 PCR；残存的 RNase 极易将膜板 RNA 降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl 法或酸性硫氰酸胍 - 酚 - 氯仿法可提得理想的 RNA 制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。

常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosis virus, AMV）和莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloney murineleukemia virus, MO-MLV）的逆转录酶（RT）。一般情况下用 Mo-MLV-RT 较多，但模板 RNA 的二级结构严重影响逆转录时，可改用 AMV-RT，因后者最适温度为 72℃，高于 Mo-MLV-RT 的最适温度（37℃），而较高的反应温度有助于消除 RNA 的二级结构。

一步法扩增（one step amplification）是为了检测低丰度 mRNA 的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq 酶、4 种 dNTP 直接进行 mRNA 反转录与 PCR 扩增。发现 Taq 酶不仅具有 DNA 多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以 mRNA 为模板进行反转录和其后的 PCR 扩增，从而使 mRNA 的 PCR 步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总 RNA 中小于 1ng 的低丰度 mRNA。该法还可用于低丰度 mRNA 的 cDNA 文库的构建及特异 cD-NA 的克隆，并有可能与 Taq 酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。

最近 Cetus 公司推出 rTth 逆转录酶，兼具有 DNA 多聚酶的活性，对于 RNA 的发展起了很大的推动作用。有关 rTth 逆转录酶法参考第四节 有关内容。

十一、定量 PCR1．DNA-PCR 定量用同位素标记的探针与电泳分离后的 PCR 扩增产物进行杂交，根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板 DNA 进行定量。Abbot 等利用这种方法对人类 T 细胞白血病反转录基因进行了定量研究。

PCR 扩增产物用专为检测 ds-DNA 而设计的微量荧光计定量，利用染料 H33258 专与双链 DNA 结合而使荧光增强 50 倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增产物量曲线上读出样品中模板 DNA 的量或拷贝数，达到 PCR 定量的目的。

利用倍比稀释模板作系列稀释 PCR，求出最低（PCR-EB）检测限来比较，也是常用的半定量 PCR 方法。

2．mRNA-PCR 定量由于 MRNA-PCR 定量需经两个酶（RT 和 Taq）催化，因而影响因素较多。1989 年 Wang 等报道了低丰度 mRNA 绝对定量方法。利用浓度已知且与待测靶 mR-NA 序列相同的内对照 mRNA（其片段长短不同，便于 PCR 扩增后产物的分离），在同一体系中，用相同的由32 P 标记的引物与待测 mRNA 一同进行逆转录和 PCR 扩增，扩增产物电泳后，分别测定二者产物放射性强度，由预先制备的标准曲线推算出每个样本特异 mRNA 的量。Gilliland 等的结果表明，在 1ng 总 RNA 中可以对小于 1pg 的特异 mRNA 进行定量。这一定量方法在肿瘤、代谢失调、基因表达调控等研究中均有重要意义。

第六节 样品处理与注意事项一、样品处理DNA 是染色体的主要组成部分，是 PCR 的扩增模板。要进行 PCR，研究 DNA 结构与功能或者用于诊断目的，首先必须从生物体内提取 DNA。DNA 往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色体 DNA 平均大小为 3.0×109bp），提取 DNA 应尽量保持 DNA 完整性和纯度，即在提取中尽量避免机械张力引起的 DNA 分子降解，又要注意杂质及蛋白的去除，防止胞内酶解 DNA。因此，提取 DNA 的基本过程是：用 Proteinase K 及 SDS，在 EDTA 存在下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内 DNA 酶失活，然后用酚 / 氯仿多次提取去除蛋白质，在 DNA 中若混有少量 RNA，可用 RNase 去除，最后用乙醇沉淀得到 DNA。

理论上 PCR 对模板 DNA 纯度及完整性要求并不高，细胞经过热变性使 DNA 释出就可以作为模板，依赖引物的选择性进行扩增。这对拷贝数很多的基因组，确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功，其原因是：①非希望的扩增增多，掩盖了所需扩增的片段，使其数量减少至不能检测到的程度。②生物样品中的杂质会抑制 PCR 反应，最主要的是血液和琼脂糖。例如在 100μl 反应液中加入 1μl 全血就可引起抑制，0.8μmol/ L 的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品，可以用渗透压溶解红细胞，离心集取细胞核，洗除血红蛋白，再用蛋白酶 / 表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之，使释放 DNA，并沉淀 Hb，用上清液作 PCR。

现将 PCR 前处理各种标本的基本方法介绍如下：

1．所需溶液

（1）PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4pH7.0

（2）含表面活性剂及蛋白酶 K 的 PCR 缓冲液

50mmol/LKCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

0.1mg/ml 明胶，0.45%NP40,0.45% 吐温 20

高压灭菌，冷冻储存。临用前加 0.6μl 的 10mg/ml 蛋白酶 K（水溶液）至 100μl 溶液中。

（3）溶血缓冲液

0.32mol/ L 蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5

5mmol/LMgCl2,1% Triton X-100

2．提取方法

（1）用聚蔗糖 - 泛影葡胺梯度法从血液或培养细胞分离的单核细胞（当 PBC〈10% 细胞数时用此程序）

①将细胞样品用 PBS 稀释至 10ml，置 15ml 锥形离心管中；

②100×g 离心 2～5min，吸去上清；

③细胞再悬浮于 10ml PBS 中重新离心洗涤；

④沉淀物悬浮于溶液 2 中，使细胞浓度约为 6×106/ml，移至 1.5ml 管中；

⑤50～60℃保温 1h；

⑥95℃保温 10min 使蛋白酶变性；

⑦冷冻储存。

如果 RBC 多于细胞的 10%，则用 PBS 洗 1 次（步骤 1，2）后，悬浮于 1ml 溶液 3，并转移至 1.5ml 离心管中，如程序 B - 2 离心 1 次，再悬浮于溶液 2 中按程序 A - 4 继续进行。

（2）全血：此法使胞膜溶解故胞浆 DNA 丢失，约可得 20μg DNA/0.5ml 血。

①0.5ml 全血与 0.5ml 溶液 3 共置 1.5ml 管中；

②13000×g 离心 20s；

③吸去上清，加 1ml 溶液 3，旋涡混合使沉淀重新悬浮；

④重复第 2，3 步 2 次；

⑤13000×g 离心 2s，吸去上清，悬浮于 0.5ml 溶液 2 中；

⑥按程序 A5～7 步进行。

（3）拭子

①用 PBS 预温的试子从宫颈、阴道或阴茎采样；

②拭子置入 2ml PBS（含抗霉剂）于 15ml 离心管中，室温可保存 24h，置 4℃可保存更长时间。也可用旋涡混合器振荡使细胞加速游离；

③取去拭子，2000～13000×g 离心 5min，吸去上清；

④如含 RBC 则加 1ml 溶液 3，转移至 1.5ml E 管中，按程序 B - 2 开始进行；

⑤如不含 RBC 则加溶液 2，按程序 A - 4 进行。

（4）头发

①拔下头发，剪下头发近端 0.5cm 段；

②置入 0.4ml 溶液 2 中（1.5ml 管）；

③按程序 A5～7 步进行，用 50μl 体系作 PCR。

（5）血细胞 RNA 用焦碳酸二乙酯（DEP）抑制 RNase,NP-40 溶胞但不溶核。

①用聚蔗糖 - 泛影葡胺或其它方法分离单核细胞；

②置 2ml 离心管中，加 PBS 至细胞中，500×g 离心 5min；

③配制（DEP）溶液用无水乙醇将 DEP 作 9 + 1 稀释，再用 NP-400.5% 作 1：999 稀释（抑制 RNase）；

④细胞沉淀中加 200～400μl 此溶液，旋涡混合；

⑤13000×g 离心 10s；

⑥上清转移至新管中，37℃保温 20min，90℃，10min；

⑦离心，上清转移至新管。取 5～10μl 作反转录；

⑧如果反转录失败，可能因 DEP 残留，可将样品再在 90℃加热 5min，再做试验；

⑨本法也可用于培养细胞。

二、注意事项PCR 只需几个 DNA 分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量 DNA 模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。下例可形象说明污染的严重性。

典型的 PCR 反应可在 100μl 反应液中扩增 1012个 DNA，此液倾入 50nm×25m×2m 的游泳池中，充分混合取 0.1ml 池水, 其中含有 40 个分子的 DNA, 用 PCR 扩增即已可呈阳性，这一点对检测 HIV 更为重要。常规只要 15 个拷贝的核酸即可查出。假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

（1）DNA 处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

(2）PCR 在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。

超净台内设内供 PCR 用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

（3）PCR 操作应戴手套并勤于更换。

（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。

（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。

（6）最后加模板 DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板 DNA 后应更换手套。

（7）实验设阳性、阴性对照。

第七节 PCR 仪器的发展PCR 温度循环至关重要，PCR 扩增仪各参数必须准确。自 Perkin –Elmer Cetus 公司第一台 PCR 扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售 PCR 扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

为了便于了解和选购适宜的 PCR 实验设备，现将部分国内外 PCR 扩增仪列表如下（表 22-5）；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产 1109 型 DNA 扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。PTC-51A/ B 体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式 PCR，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节 省劳动力的目的。在采用这些仪器作 PCR 试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用 Eppendorf 管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷 PCR 反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。

表 22-5 国内外生产的几种 DNA 扩增仪

仪器型号生产厂家型式特点管数报价1109 型北京新技术所与军科院联合机械臂变温水浴电子调温40×0.5ml16400 元 / 台90A/ B 型中科院遗传所机械臂变温水浴电热14000 元 / 台PTC-51A/ B 型军事医学科学院变温气流电子调兼作套式30×0.5ml12000 元 / 台DNA Thermal CyclerPerkin –ElmerCetus(美)变温铝块压缩机致冷48×0.5mlUS $ 20000.-Thermocycler6000180B..BraunBiotech(德)变温水浴 98℃四档电热, 自来水冷却60×1.5ml100×1.5ml180×1.5mlDM 30000.-Automatic temperature Cy-cler Single Block Twin BlockEricomp Inc.(美)变温铝块 25～100℃电热, 自来水冷却29×1.5ml58×1.5mlUS $4985.-US $7980.-Grant AutogenGrant Instrumant Ltd(美)变温水浴 0～99℃电热, 自来水冷却或加冷循环器50×1.5mlor50×1.5mlUS $250. –plusUS $ 15.-forRack(x2)Techne PHC-1PHC-2Techne Ltd.(英)变温铝块 0～99℃三档电热 500W 水冷 100W54×0.5ml54×0.5ml24×1.5ml￡3383. –￡3997. –BioOvenBioThrm Corp(美)变温气流-150℃115V11A200’s of 4×96plateUS $ 2990. –Trio-Thermo-block TB-1Biomertra(德)半导体变温220V3×20 管分别控温DM12900. –Micro cycler EEppendorf(美)变温铝块220V/100V3×29 管US第八节 PCR 临床应用领域及特点一、PCR 应用特点1．操作简便目前 PCR 技术采用耐高温 Taq DNA 聚合酶，并且在有电脑控制的 DNA 扩增仪中进行，使操作大为简化，一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA 扩增仪能自动迅速升降温度，只需把反应所需的全部材料混匀，置入仪器内，反应便依所输入的程序进行。

2．省时应用 TaqDNA 聚合酶时，单核苷酸掺入速率较高，75～80℃时，每个酶分子每秒钟可完成 150 个核苷酸的合成。PCR 每一周期需数分钟，所以，一般常取用 20～30 个周期能使目的 DNA 达数到百万倍扩增的反应只要数小时即可完成。在基因分离、突变体构建、DNA 测序等方面，PCR 方法均较之常规法快速的多。例如，用常规方法建立 cDNA 库或染色体 DNA 库来分离基因，需花几个月，用 PCR 方法只需 1～2 个月星期；用 M13 法构建突变体需 1～2 个月，而 PCR 法只用数天；PCR 方法扩增的目的 DNA 片段可直接用作序列分析，较常用的通过克隆、培养扩增、纯化制备等步骤获得测序片段更为简便。

3．灵敏度高 PCR 产物的生成是以指数方式增加的，所以欲扩增 pg 量级的起始物到 μg 水平或放大真核细胞单拷贝基因，通过 PCR 方法都是不难完成的。PCR 方法可用单、双倍体细胞、一根头发、甚至单一精子进行 DNA 定型。

4．特异性强作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。Taq DNA 聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度。

5．对原始材料质量要求低由于 PCR 技术有较高的灵敏度和特异性，故仅含微量（pg,ng）的目的 DNA 的粗制品或者总 RNA，就可以用做反应起始材料来获取目的产物。部分降解的 DNA 材料也可以通过 PCR 多次反应周期，最终得到所需的全长 DNA 片段。

6．有一定程度的单核苷酸错误掺入由于 Taq DNA 聚合酶缺乏 3’→5’核酸外切酶活性，因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入，标准条件下，其错误掺入率可达 1.25×10-4～1×10-5。但是，这种错误并不意味着 PCR 产物一定会发生序列改变。Innis MA 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，这就使得发生了的错误不会再扩大。

二、PCR 应用领域单克隆抗体技术曾使免疫学理论与实践有了新的突破，近几年来 PCR 技术使分子生物学及相关学科发生了一次方法学的革命。在不到 10 年的时间内，在以下几个领域中 PCR 技术已具有实用价值，且其应用范围正在不断扩大中。

1．遗传病的产前诊断 用胎儿羊膜细胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD 等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献，对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均是当前研究的重点，近期内可望有突破。

2．致病病原体的检测 这些外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用 PCR、PT-PCR 或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物，PCR 诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。而且检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。

3．癌基因的检测和诊断 虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变异所导致的这一基本事实已无庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗转移基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的，临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中 P53 及 Rb 等抗癌基因的失活，神经质瘤 N -myc 基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阻断均已成为近代基因治疗的着眼点。

4．DNA 指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证 这一为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因，β- 珠蛋白基因、ApoB 基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。

5．动、植物检疫 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。

6．高科技生物医学领域中的应用 在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR 技术尚可应用于基因拼接、测序等领

第九节 其它链扩增技术及应用范围一、免疫 PCR所谓免疫（Immune PCR）就是利用抗体与 DNA 特异结合来检测抗原，把抗原抗体反应与 PCR 联合应用而建立的一种抗原检测系统。

在免疫 PCR 中，一个中介分子同时具有与 DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接 DNA（标记物），另一端连接抗原 - 抗体复合物，形成一个特殊的抗原 - 抗体 -DNA 连接物。作为标记物的 DNA 分子可用 PCR 的扩增，存在特异的 PCR 产物应证明作为标记物的 DNA 分子已特异地与抗原 - 抗体复合物结合，而且表明了抗原的存在。有人采用 SAP（streptavidin – protein A）嵌合体作为中介物。它具有双特异性结合能力，一端为链霉亲和素，可结合生物素；另一端为可与 IgG 的 Fc 段结合的蛋白 A。这样可特异地把生物素化的 DNA 分子和抗原 - 抗体复合物连接在一起。

选用 BSA 作抗原进行免疫 PCR 实验，结果表明，可检测出 580 个抗原分子（9.6×10-22mol/L），而且可以完全避免其它非特异信号的干扰。与采用碱性磷酸酶的 ELISA 相比，其灵敏度可提高 105倍，较常规的放名分析灵敏度也高出几个数量级。

免疫 PCR 产物在普通的琼脂糖电泳上就可以检测出来，如用更好的方法来检测 PCR 产物，如放射性同位素，荧光物或酶等掺入到 PCR 产物中，可进一步提高其灵敏度和适用性。另外，如果采用不同大小标准的 DNA 进行标记，在电泳时，可同时检测出多种不同的抗原分子。

PCR 产物的多少与抗原结合量有关，如果用标准反应作对照，则可以对抗原的量进行估算。因此，通过改变连接物的浓度就可以改变检测系统的灵敏性。其它因素，如抗体的浓度，PCR 循环周期数，PCR 产物的检测方法等也同样影响系统的灵敏性。

二、转录依赖的扩增系统（Transcription-basedAmplification System , TAS）扩增样本中的 RNA，一般要先将其逆转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，能否将 RNA 靶序列直接扩增出来呢？Kwok 等人发明了 TAS 来解决这一问题。结合应用葡聚糖珠寡核苷酸杂交技术可进一步提高方法的特异性和效率。其原理是：制备引物 A、B，引物 A 与待检 RNA3’端互补，并有一 T 7RNA 多聚酶的识别结合位点。逆转录酶以 A 为起点合成 cDNA；引物 B 与此 cDNA3’端互补，逆转录酶同时还具有 RnaseH 和 DNA 多聚酶的活性，又可利用引物 B 合成 cDNA 的第二链。RNA 多聚酶以此双链 cDNA 为模板转录出与待检 RN- 一样的 RNA，这些 RNA 又进入下轮循环。RNA 多聚酶从一个模板可以转录出 10～103个拷贝，因此反应中待检 RNA 拷贝数以 10 的指数方式增加，较 PCR 高得多。扩增产物用葡聚糖珠夹心杂交法检测：产物先与标记的探针杂交，再与包被在葡聚糖珠上的另一互补寡核苷酸（与标记探针互补的位置不同）杂交、检测。该方法同一般杂交检测技术相比，特异性要高出许多。

TAS 主要特点是扩增效率极高，由于拷贝数是以 10 指数递增，只有 6 个循环，靶序列即能达到 2×106个拷贝。由此而来的另一个特点是特异性很高，在一般的 RNa PCR 扩增中，由于逆转录酶和 Taq 多聚酶均无较对活性，要发生错掺，循环次数越多，错掺率越高。TAS 仅需循环 4～6 次，将错掺率降低了 4 /5。用葡聚糖珠夹心杂交法，又进一步提高了特异性。目前认为 TAS 是扩增 RNA 的首选方法。

三、再生式序列复制技术（3SR）这一反应依赖于 AMV 逆转录酶、RnaseH 和 T 7RNA 多聚酶的共同作用。当逆转录酶合成 cDNA 第一链后，RnaseH 降解模板 RNA，逆转录酶合成 cDNA 第二链，T7RNA 多聚酶以此 cDNA 为模板，转录出与样本 RNA 序列相同的 RNA。其 RNA 扩增过程与 TAS 相同。由于所使用的工具酶工作的适宜温度是 37℃，所以只要在第一步变性、复性后，整个反应过程不再需要温度循环。具体方法如下：制备引物 A、B，引物 A 有 T 7RNA 多聚酶识别、结合位点。将引物、样本加入扩增缓冲液中，65℃，1min，降温至 37℃，加入人工具酶，37℃保温 1h，冰浴中止反应。可用葡聚糖夹心法检测扩增产物。

这一方法有几点值得注意：（1）反应是在 37℃恒温中进行的；（2）产物中有 RNA，反义 RNA 的 cDNA，RNA 的拷贝数高于 Cdna（90：1）；（3）效率高于 PCR。使拷贝数扩增到 105，PCR 要 85min，3SR 仅要 15min；（4）逆转录酶也具有 RnaseH 活性，反应又是在 37℃中进行，因此推测某些病毒，如 HIV- 1 感染的细胞内可能存在类似 3SR 的病毒基因扩增机制。

四、连接酶链式反应（Ligase ChainReaction,LCR）该技术是 Landegren 等人于 1988 年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物 A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B 间留下一个缺口（nick），加入连接酶封闭缺品，两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。Lan-degren 用生物素标记引物 A，用32 P 标记引物 B。用亲和素包被的琼脂糖珠与连接产物反应，检测其放射性。显然，当靶序列中存在点突变时，检测结果是阴性的。用这种方式，Landegren 将人 β - 珠蛋白 βA、βC、βS 三个等位基因区别开来。Wu 等人又引入 PCR 的原理，在连接反应后，变性、退火、再连接，少量的靶序列就被扩增出来。Barany 于 1991 年报道了耐热连接酶 -Taq 连接酶的发现及其在 LCR 中的应用，为 LCR 的实用化奠定了基础。实际操作时引物为 4 个，A、A、A’和 B、B’，分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，靶序列以指数形式扩增出来。用上面提到的标记检测方法，即可检测靶序列中有无点突变。

LCR 的特异性首先取决于引物与模板的特异结合，其次 Taq 连接酶作用的特异性，即 Taq 连接酶是否仅连接与靶序列完全互补的引物。实验表明 Taq 连接酶的非特异活性是较低的（<1%）。控制模板、酶的浓度，使反应在接近 Taq 酶的温度下进行，还可进一步降低非特异连接率。Barany 用这一技术，将极少量（<200 个分子）的 βA、βC 和 βS 区别开来。

LCR 的扩增效率与 PCR 相当。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。用 Taq 连接酶做 LCR 只在两个保温点的循环（94℃、1min 和 65℃、4min）。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说 LCR 是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。

五、PCR-SSCP 分析技术近几年来，在 PCR 基础上完善和发展起来的多种基因变异检测方法是基因分析和检测的一次技术革命。其中日本学者创建的 PCR-SSCP（Single-Strand ConformationPolymorphism anal-ysis of PCR products）格外重要。它是指单链 DNA 分子在变性 PAGE 中电泳迁移率随其构象的改变而改变的性质。单链 DNA 分子的构象改变即可由 DNA 多态性引起，又可由基因突变引起。为此，有的学者试图用 PCR-SSGE（Single-Strand Gel Electrophoresisof PCR products）代替原命名。

PCR-SSCP 分析包括 PCR 扩增和单链产物电泳两个阶段。对于分析小于 400bp 的 PCR 产物十分有效，对于大于 400bp 的 PCR 产物需处理后再分析，必须注意的是 PCR-SSCP 分析不能确定基因变异部位和内容，泳动后必须进一步完成 DNA 测序。

六、结语PCR 技术以惊人的速度在研究与诊断领域得到应用，限于篇幅所限，在此不一一进行讨论了。本章 重点讨论了 PCR 技术发展的有关内容，尤为影响 PCR 的主要因素和 PCR 的各种反应模式及新进展，以求大家在实际工作中能够注意到这些问题，并有所创新，相信由于 PCR 自身高敏感性及实用性，在分子生物学研究与医学实践中 PCR 技术将越来越受到人们的重视。无论从哪一个角度，PCR 技术从分子水平对许多传染病、遗传性疾病和肿瘤进行诊断，使法医鉴定、生物进化的研究更为简便和强化，在遗传学、分子生物学、生物工程与医学研究中都占有重要的地位。

PCR 技术是以生物体内 DNA 复制为基础理论的，这一技术把基础理论与应用有机结合起来，给我们以辩证的思考。对于其它学科中有关理论与实践结合的问题具有指导意义。PCR 技术必将为我们提供大量有关核酸的知识，丰富我们的理论，改变我们以前的认识，推动学科的向前发展。

参考文献1．L．Z．Xu and D Larzul. The polymerase reaction：Basic Methodology andApplications. Comp.Immun. Microbiol. Infet Dis, 1991, 14(3)：209～221

2.MullisK, Faloona F, Scharf S, Horn G, et al. Specific enzymatic amplification of DNAin vitro：the polymerase chain reaction：Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol., 1986,51：263～273

3.Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic aniplification of β-globin genomicsequences and restriction site anylysis for diagnosis of sickle cellanemia.Sciencer, 1985；230：1350～1354

4.ChienA, Edgar D B, Tela J M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extremethermophile thermus aquaticus. J. Bacterial, 1976；127：1550

5.SaikiRK, Gefland D H, Stoffel S, et al. Primer –directed enzymatic amplification ofDNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988；239：487～489

6. 黄培堂, 等.PCR 技术的原理与应用. 科学出版社.1992

7. 朱平, 等.PCR 聚合酶链反应操作实验指南. 科学出版社,1992

8. 马立人, 等.PCR 技术的发展和文献, 内部资料.

9. 金冬雁, 等译. 分子克隆操作指南. 科学出版社,1992

10.Wang HC.PCRDESN and PCRDESNA for PCR primer design.Compt. Biol. Med, (insoftwaresurvery section),1991；21(1/2)：1

11.ToddLowe, John Sharefkin, Shi Qiyang, et al. Dieffenbach,A computer program forselection of oligonucleotide primers for polymerase chain Reaction, NucleicAcids Res, 1990；18：1757～1761

12.Erlich, Eds. New York：PCR Technology. Stockon Press, 1989：17～22

13.SaikiRK, et al. Amplifications, 1989；1：4～6

14.Stoffel.Amplifications , 1991；6：14

15. EricPH, Yap, James O’D DcGee. Slide PCR：DNa amplification from cell samples onmicroscpic glass slides, Nucleic Acids Res.,1991；19(15)：4294

16. 马立人. 基因诊断的发展和应用, 内部资料,1993

17.Takeshi Sano , Cassandral Smith, Charles R, et al. Immuno –PCR：Very sensitive antigen detectionby means of specific antibody –DNA conjugates. Science, 1992；258：120～122

18. D YKwoh, G R Davis, K M Whitefield , et al.Transcription – hased, amplificationsystem and detection of amplified human immunodefi-ciency virus type1 with a beadbased sandwich hybridization format.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989；86：1137～1177

19.BirkenmeyerL G. Isak Mushahwar. DNA probe amplification methods. J Virol. Methods, 1991；35：117～126

20.Barany Francis. Genetic desiease dectection and DNA amplification using clonedthermostable ligase. Proc. Natl. Acad, Sci, USA,1991；88：189～193

第二十三章 DNA 重组技术及其在基因诊断中的应用第一节 工具酶基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的 DNA 分子，要把不同基因的 DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要 DNA 连接酶（ligase）；要结合基因或其中的一个片段，需要 DNA 酶（DNa polymerase）等。因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。

一、DNA 限制性内切酶Lurva 和 Human（1952）以及 Bertani 和 Weigle（1953）发现了噬菌体 λ 的限制作用，即用一种 λ 噬菌体在一种宿主细胞生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的 DNA 受到后一种宿主的“限制”。由此发现了限制 - 修饰系统。

各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶切割 DNA 的双链，因为它们的功能就是切割 DNA，限制外源性 DNA 存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。合成限制酶的细胞自身的 DNA 可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的 DNA 顺序的结构，使限制酶不能起作用。限制 - 修饰系统是细胞的一种防卫手段。如果用噬菌体去感染限制 - 修饰系统有活性的细菌，噬菌体 DNA 没有先经修饰，它与先经修饰的噬菌体相比，感染效率要低几个数量级。未经修饰的噬菌体 DNA 进入细胞后被限制酶切成片段，片段的数目与 DNA 分子中限制酶的识别点数目成正比，这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解，就会开始裂解感染，由此产生的子代噬菌体全部带有修饰过的 DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制 - 修饰系统的细菌。目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已超过 175 种，其中 80 多种是切割 DNA 双链。

（一）命名原则

限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母，第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字母；接下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。现在列表举例说明如下（表 23-1）。

表 23-1 几种限制性内切酶命名原则举例

细菌原名细菌种名菌株名称限制酶名称ArthrobacterLuteusAluⅠBacillusamyloliquefaciensHBamHⅠEscherichiaColiRY13EcoRⅠHaemophilusinflueuzaeRdHindⅢ（二）分类和特性

限制性内切酶主要分成三大类。第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK 等。

第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的 DNA 片段，并能构建来自不同基因组的 DNA 片段，形成杂合 DNA 分子。因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸，少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、9 个、10 个和 11 个核苷酸的。如果识别位置在 DNA 分子中分布是随机的，则识别 4 个核苷酸的限制性内切酶每隔 46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的单倍体基因组据估计为 3×199 核苷酸，识别 4 个核苷酸的限制性内切酶的切点将有（3×109/2.5×102）约 107 个切点，也就是可被这种酶切成 107 片段，识别 6 个核苷酸的限制性内切酶也将有（3×109/4×103）约 106 个切点。

第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如 EcoRI 的识别顺序为：

↓ |

5’……GAA | TTC……3’

3’……CTT | AAG……5’

| ↑

垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。实线剪头表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G 和 AATTC……3’、3’……CTTAA 和 G……5’二个 DNA 片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过形成氢键而“粘合”。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如 HaeⅢ的识别位置是：

↓

5’……GG↓CC……3’

3’……CC↓GG……’

↑

在箭头所指处切割，产生的两个 DNA 片段是：

5’……GG CC……3’

和

3’……CC GG……5’

有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如 HpaⅡ和 MspⅠ的识别顺序都是 5’……GCGG……3’，如果其中有 5’- 甲基胞嘧啶，则只有 HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同切酶或异源同工酶（isoschizomer）。

第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆 DNA 片段没有多大用处。

二、甲基化酶细胞的限制 - 修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护 DNA 不被限制性内切酶切开。

真核生物中目前只发现 5 - 甲基胞嘧啶（M5C）。M5C 占整个胞嘧啶中的 2～7%（果蝇和某些昆虫例外）。M5C 大多以 M5CpG 的形式存在，不同物种或同一物种的不同组织中，M5C 出现的频率也不尽相同。目前已经纯化作为商品出售的甲基化酶见表 23-2。

将限制性内切酶和甲基化酶同时作用，可使有几种可能识别顺序的限制性内切酶只对其中一种识别顺序有效。例如限制性内切酶 AvaⅠ的识别顺序是：

5’……CPyCGPuG……3’

3’……GPuGCPyC……5’

Py 可以是任何一种嘧啶，pu 可以是任何一种嘌呤。因此可以有 4 种识别顺序。如果同时使用甲基化酶 TaqⅠ和甲基化酶 HpaⅡ，则 AvaⅠ的识别顺序将只是 5’……CCCGAG……3’。现用图解说明（图 23-1）。

如果有一个 DNA 片段，有 AvaⅠ的 3 个识别顺序，当用 AvaⅠ处理后可得 4 个片段。可是，如果先用 TaqⅠ甲基化酶和 HpaⅡ甲基化酶使 DNA 顺序中的有些碱基甲基化，然后再用 AvaⅠ去切，结果只有 1 个识别顺序可被 AvaⅠ作用，只产生 2 个 DNA 片段。

图 23-1 几种限制性内切酶和甲基化的碱基

表 23-2 甲基化酶及甲基化的碱基

甲基化酶名称甲基化的碱基AluⅠ5’……AGC*T……3’BamHⅠ5’……GGATC*C……3’ClaⅠ5’……ATCGA*T……3’damⅠ5’……GA*TC……3’EcoRⅠ5’……GAA*TTC……3’HaeⅢ5’……GCC*C……3’HhaⅠ5’……GC*GC……3’HpaⅡ5’……CC*GC……3’HphⅠ5’……TC*ACC……3’MspⅠ5’……C*CGG……3’PstⅠ5’……CTGCA*C……3’TaqⅠ5’……TCGA*……3’* 表示甲基化

三、分子克隆化的另一些酶（一）DNA 聚合酶（DNa polymerase）的作用是将 1 个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的 3’-OH 上，释放出一个焦磷酸分子（ppi），如下式表示。

聚合酶主要有以下几种：

1．大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ大肠杆菌 DNA 聚合酶（E.ColiDNA polymerase）主要有 3 种作用：①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补 DNA，填补 DNA 上的空隙或是切除 RNA 引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的 DNA。它在切口平移（nick translation）中的应用，将在下面介绍。

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段是完整的 DNA 聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在 5’→3 聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性，失去了 5’→3 外切酶活性。它可用于填补 DNA 单链末端成为双链。如果供给 32P 标记的三磷酸核苷酸，则可使 DNA 带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的 DNA 片段，要用被切成平头末端的 DNA 片段连接时，可以先用 Klenow 片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在 DNA 连接酶作用下把两个 DNA 片段连接起来。

另外还有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅱ和大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅲ。前者不能利用单链 DNA 或 poly(dA-dT)为模板。需有镁离子和 dNTP 时才能表现出酶活性，无自发合成 DNA 的作用。后者没有 5’→3 外切酶活性，也不能用单链 DNA 作为模板。

2．噬菌体 DNA 聚合酶这里以 T4DNA 聚合酶为例。它也具有 5’→3 聚合酶活性，但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高 200 倍。因此，它也可用来补齐单链末端或标记同位素。

（二）RNA 聚合酶RNA 聚合酶（RNapolymerase）的作用是转录 RNA。有的 RNA 聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌 RNA 聚合酶有四条多肽链，另有一个促进新 RNA 分子合成的 σ 因子，因此它的组成的是 α2ββσ。这种结构称为全酶（holoenzyme）, 除去了 σ 因子的酶称为核心酶。噬菌体 RNA 聚合酶则没有亚基。

真核生物的 RNA 聚合酶分三类。RNA 聚合酶Ⅰ存在于核仁中，转录 rRNA 顺序。RNA 聚合酶Ⅱ存在于核质中，转录大多数基因，需要“TATA”框。RNA 聚合酶Ⅲ存在于核质中，转录很少几种基因如 tRNA 基因如 5SrRNA 基因。有些重复顺序如 Alu 顺序可能也由这种酶转录。上面提到的“TATA”框又称 Goldberg –Hogness 顺序，是 RNA 聚合酶Ⅱ的接触点，是这种酶的转录单位所特有的。它在真核生物的转录基因的 5’端一侧，在转录起点上游 20 至 30 个核苷酸之间有一段富含 AT 的顺序。如以转录起始点为 0，则在 -33 到 27 个核苷酸与 -27 至 21 核苷酸之间，有一个“TATA”框。一般是 7 个核苷酸。RNA 聚合酶Ⅱ转录单位的典型结构如图 23-2。原核生物中也类似“TATA”框的结构。RNA 聚合酶作用在“TATAAT”（Pribnow）盒和“TTGA-CA”框附近。

图 23-2 反转录酶的作用机理

（三）反转录酶反转录酶（Reverse transcripatase）是以 RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补 DNA（cDNA）的酶。哺乳类 C 型病毒的反转录酶和鼠类 B 型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类 RNA 病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以 mRNA 为模板时，先合成单链 DNA（ssDNA），再在反转录酶和 DNA 聚合酶Ⅰ作用下，以单链 DNA 为模板合成“发夹”型的双链 DNA（dsDNA），再由核酸酶 S1 切成二条单链的双链 DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的 mRNA 反转录成 cDNA 拷贝，然后可大量扩增插入载体后的 cDNA。也可用来标记 cDNA 作为放射性的分子探针。

（四）核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exonucleaseⅢ）是从带 3’-OH 末端的双链 DNA，按 3’→5’方向切除 5’单核苷酸：

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ则是从单链 DNA 的 3’端和 5’端切除寡核苷酸（两种形式）：

（1）（2）

前一种酶需要镁离子作辅助因子才有活性；后一种酶则不需镁离子，因此即使在有螯合剂 EDTA 的情况下也有活性。另一种从噬菌体 λ 感染的大肠杆菌中提取的 λ 核酸外切酶是从带有 5’磷酸末端的双链 DNA 上，逐个切除 5’单核苷酸，在反应时需要镁离子：

（五）核酸酶 S1核酸酶 S1（nucleaseS1）主要是降解单链 DNA 或单链 RNA。对单链 DNA 的活性更高。它的用途是切除 DNA 片段的单链末端使之成为平头末端，切开合成 dscDNA 时形成的“发夹”环以及分析 DNA-RNA 杂合子的结构。

（六）DNA 酶DNA 酶Ⅰ（DNaseⅠ）是随机水解双链或单链 DNA 的一种内切酶，使 DNA 分子降解成带有 5’磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物：

在进行重组 DNA 研究时，必须注意防止 DNA 酶的污染，否则制备的 DNA 样品将会降解。因此器皿或试剂高温处理，样品中加 EDTA，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。

（七）RNA 酶RNA 酶 A（ribonuclease A）作用于嘧啶核苷酸的 3’磷酸根上，切开与相邻核苷酸连接的 5’磷酸键。另一种 RNA 酶 T1 只作用于鸟嘌呤核苷酸的 3’磷酸根，切开与相邻核苷酸连接的 5’磷酸键。人体的分泌物如唾液，汗液中都含有 RNA 酶。因此在操作 RNA 样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经 250℃烘烤 4h（RNA 酶耐热），或用 RNA 酶的抑制剂处理。

（八）连接酶最常用的是 T4DNA 连接酶（T4DNa ligase），催化双链 DNA 中相邻的 3’OH 与 5’磷酸根之间形成磷酸二酯键，它可用来连接具有粘性末端的两个 DNA 片段，或连接两个平头末端的 DNA 片段，使之成为一个重组 DNA 分子。可是这种酶只能连接双链 DNA 而不能连接单链 DNA 分子。T4RNA 连接酶则可在单链 DNA 分子或 RNA 分子的 5’磷酸根和 3’-OH 之间催化生成共价键。

（九）末端转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidetransferase）的作用是将脱氧核苷酸加到 DNA 分子的 3’-OH 末端。

（十）碱性磷酸酶从 DNA 或 RNA 的三磷酸脱氧核糖核苷酸或三磷酸核糖核苷酸上除 5’- 磷酸根残基。一般的用途是用这种酶处理 DNA 或 RNA 后，在 5’端上标记 32P。在经限制性内切酶酶切 DNA 片段后，用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）处理可以阻止酶切的片段自身连接，这在克隆 DNA 片段时特别有用。

第二节 分子克隆载体载体（vector）是指运载外源 DNA 有效进入受体细胞内的工具。载体同外源 DNA 在体外重组成 DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源 DNA 插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源 DNA 片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源 DNA 已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源 DNA 表达的调控区。

重组 DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体 λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体 M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源 DNA 一起复制；②都很容易同细菌 DNA 分开并加以纯化；③都有一段 DNA 对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源 DNA 可以插入这一段 DNA 中，或是置换这一段 DNA 而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。

一、质粒质粒（plasmid）是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链 DNA 分子，大小从 1kb 直到 200kb 以上。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。

在天然条件下，许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。在实验室条件下，质粒则可通过转化过程进入受体细胞。此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细胞暂时易于让小的 DNA 分子透过。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。如对某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细胞。

质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。每个细菌中可以有 10～200 份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数，可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。

图 23-3 pBR322 的基本结构

（一）大肠杆菌质粒应用的最广泛的质粒载体是 pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。它全长 4352 个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图 23-3。

当需要用 pBR322 来克隆 BamHI 酶切的一个 DNA 片段时，一般的做法是如图 23- 4 所示。

图 23-4 pBR322 克隆 DNA 片段的程序

从图 23- 4 可见，外源 DNA 片段同 pBR322 都经 Bam HⅠ酶切，所以有相同的单链“粘性末端”，通过 DNA 连接酶可以构成重组 DNA 分子。由于 pBR322 的 BamHⅠ酶切点在四环素的抗性基因中，所以 Bam HⅠ酶切后使这个抗性基因失活。如果酶切后的质粒 pBR322 自身又重新连接，则恢复对四环素的抗性，转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。如果 pBR322 中插入外源 DNA，则转化子失去了四环素抗性表型，而只有对氨苄青霉素的抗性，这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出，然后扩增细菌，大量回收质粒 DNA，从而达到大量扩增外源 DNA 的目的。

（二）真核生物中的质粒真核生物中的酵母是国内外广泛研究的载体 - 受体系统之一。这是一个共价闭环 DNA 分子（cccDNA），平均周长 2μm，所以称为 2μm DNA 质粒，在每个酵母细胞里约有 100 个拷贝。已有人把 2μm DNA 同 pBR322 DNA 构建成双功能质粒，可在大肠杆菌和酵母菌中复制。这种质粒带有啤酒酵母的二个基因（his 3 和 Leu 2），所以很容易用酵母的营养缺陷型菌株来选出。

二、噬菌体和病毒载体噬菌体 λ 是最主要的一种载体。自从 1974 年以来，已用野生型 λ 改造和构建出一系列噬菌体载体。

噬菌体 λ 是温和噬菌体。基因组是长约 50kb 的双链 DNA 分子。在噬菌体 λ 颗粒中，DNA 是线状双链分子带有单链的互补末端。末端长 12 个核苷酸，这称为粘性末端，简写 COS。当噬菌体感染宿主细胞后，双链 DNA 分子通过 COS 而成环状。在感染早期，环状 DNA 分子进行转录。在此期间，噬菌体有两条复制途径可供选择：一是裂解生长。环状 DNA 分子在宿主细胞里复制若干次，合成了大量的噬菌体基因产物，形成子代噬菌体颗粒，成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体 DNA 整合进宿主菌的基因组，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。

（一）噬菌体 λ 载体的构建野生型噬菌体 λDNA 全长约 50kb，上有 65 种限制酶酶切点，除 ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和 XhoⅠ等 7 种限制酶各有一个切点外，其余都多于 2 个。有些酶切点在 λ 增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌体 λ 必须经过改造才能用作载体。现在用的 λ 载体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作为载体的噬菌体 λ 都短于野生型。

噬菌体 λ 载体有两种类型：①插入型。由于改建后的噬菌体 λDNA 都短于野生型，所以可插入外源 DNA。只要插入的位置不影响噬菌体增殖。而且噬菌体 DNA 缺失越长，插入片段就可越大。②置换型。噬菌体 λ 的基因组可分为三个区域，左侧区包括使噬菌体 DNA 成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约 20kb。右侧区内包含所有的调控因子、与 DNA 复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长 12kb。中间区域约长 18kb，这一段 DNA 可以被外源置换而不会影响噬菌体 λ 裂解生长的能力。置换型噬菌体 λ 是使用最广泛的载体。

噬菌体 λ 裂解生长的能力同包装在头蛋白中的 λDNA 的大小有关。当 DNA 的长度短于野生型的 78% 或超过 105% 时，噬菌体的活性就急剧下降。因此要求 λ 载体 DNA 和外源 DNA 长度之和在 39～53kb 之间。

置换型载体 DNA 用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源 DNA 片段连接，包装成重组噬噬体。这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源 DNA 的连接。区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法是用 Xgal 蓝色噬菌斑试验。有些噬菌体载体的中间片段带有编码 β 半乳糖苷酸的基因。当这种噬菌体感染 lac 宿主细胞并在含有 Xgal（5 溴 4 氯 3 吲哚 βD 半乳糖苷）的培养基上生长时，半乳糖苷酸与 Xgal 反应的产物为不溶性的靛蓝染料。因此，含有中间片段的重新恢复的噬菌体形成蓝色噬菌斑；而同外源 DNA 连接的重组噬菌体形成的噬菌斑是无色透明的。

（二）单链噬菌体载体最常用的单链噬菌体载体是 M13 和它的改建噬菌体。M13 是丝状噬菌体，有长约 6500 个核苷酸的闭环 DNA 基因组。M13 附着在大肠杆菌的 F 性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌，即 F’或 Hfr 细菌。当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体 DNA 转变成双链复制型（RF）。从细胞中分离的 RF 可用作克隆双链 DNA 的载体。当每个细菌细胞里积聚了 200 到 300 份 RF 型拷贝时，M13 开始不对称的合成，即只大量合成 DNA 双链中的一条链。单链 DNA 掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13 感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。

M13 的基因组中除有一段 507 个核苷酸，其余都含有与其复制有关的遗传信息。因此，只有在这一段中可插入外源 DNA 而不致影响噬菌体的活性。用 M13 作为分子克隆载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链 DNA，其中包含了克隆 DNA 片段的二条互补链中的一条，因此可用来作为对 DNA 测序的模板。另外，可用来产生单链的 DNA 探针以选择和分离互补的 RNA。M13 的 RF 型是双链 DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源 DNA。从细菌培养液中大量抽取单链 DNA。问题是插入 M13 的外源 DNA 超 1000bp 时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说，插入 300～400bp 是相当稳定的。

（三）猴病毒 40（SV40）猴病毒 40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源 DNA 转入哺乳类细胞。猴病毒 40 是球形动物病毒，直径 40nm，呈 20 面体，有一个共价闭环的双链 DNA 基因组，全长 5244bp。它在猴肾中增殖。被 SV40 感染的细胞都会出现 SV40 的 T 抗原。早已证明完整的小鼠染色体 β 珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在 SV40 中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠 β 珠蛋白的初级转录本。

可是，SV40 作为克隆载体有其局限性：①SV40 基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源 DNA 的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组 DNA 片段的大小受体限制。

（四）逆转录病毒逆转录病毒是 RNA 病毒，它有三个基因：gag- 编码病毒的核心蛋白；pol- 编码逆转录酶；env- 编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。Hock 等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的 DNA 顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helpervirus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的 RNA 进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒 RNA，进入骨髓细胞，病毒 DNA 插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。

三、柯斯质粒1978 年 Collins 和 Hohn 构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为 cosmid（柯斯质粒）。它是用正常的质粒同噬菌体 λ 的 cos 位点构成。例如，柯斯质粒 pHC79 系由质粒 pBR322 和噬菌体 λ 的 cos 位点的一段 DNA 构成（图 23-5），全长 43.kb。在包装时，cos 位点打开而产生噬菌体 λ 的粘性末端。由于 pHC79 有 pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。图 23- 5 说明了克隆基因时有用的限制酶切点。所以可以说柯斯质粒是一类特殊的重组质粒。

图 23-5 柯斯质粒 pHC79

设计构建的柯斯质粒一般长 4～6kb。其上的 cos 位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有 cos 位点的任何 DNA 分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体 λ 的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源 DNA 可大于 40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体 λ 一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞 DNA 总量的 50% 左右。

采用柯斯质粒作载体的困难是：①载体自身只相当于可以插入片段的 1 /10 左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出 30～45kb 的外源 DNA 插入载体 DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一 DNA 片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源 DNA 有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。

现将上面提到的四种载体作一比较（表 23-3）

表 23-3 四种载体的比较

质粒 λ 噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆 DNA 大片段±*++–构建基因组文库–++–构建 cDNA 文库+–––常规的亚克隆化+–––构建新型的 DNA 结构+–––序列分析+––+单链探针+**––+外源基因在大肠杆菌中的表达+–––* 外源 DNA 如超过 10kb，则重组质粒的转化率和 DNA 得率都非常低

** 已有个别质料可用于此目的

四、其他载体现在提到的分子载体有的不是用于克隆某基因，而是作为外源基因进入受体细胞的运载工具。

（一）转座子载体这里主要提一下有关果蝇转座因子（P 因子）作为基因载体。因为这是很有希望的真核生物基因工程的载体，果蝇的 P 因子约长 3kb，每端各有反向重复顺序，当它插入基因组时，可以激活或灭活近旁的基因，当它从基因组上切下来时，也可能把近旁的基因或 DNA 顺序一起切下而引起突变。现在已能把带有某种限制酶切点的 P 因子克隆到质粒 pBR322 中，然后在 P 因子酶切点上插入外源 DNA。经过扩增后，将这种重组 DNA 用微量注射仪直接注入果蝇的受精卵中。结果所克隆的基因能随 P 因子插入受体细胞的基因里，并且得到表达。

（二）人工微小染色体包括人体在内的高等生物基因工程中遇到的一个难题是缺乏合适的基因载体。要求载体对受体细胞没有危害，能安全、稳定地转给后代，使基因的性状得到连续的表达。这对校正某种遗传缺陷或改进某种性状都是十分有用的。目前一些实验室正致力于构建人工微小染色体（microchromosome）。

构建染色体应包括：基因、复制起点、着丝粒和端粒。染色体上需带有基因是不言而喻的。复制起点是染色体复制所不可缺少的。着丝粒保证复制后的染色体均等地分配到两个子细胞中。端粒具有某种特定结构以保证染色体的个体性。

首先，构建的是酵母的人工微小染色体。天然的酵母染色体为 150～1000kb。人工构建的微小染色体长 55kb，在细胞内很稳定，只是每个细胞里的拷贝数很少。比如已构成的人工微小染色体为 7～15kb，每个细胞里的拷贝数虽然增多，但不够稳定。

人工构建酵母微小染色体的具体步骤见图 23-6。从图中可以看到，先用质粒 pBR322 为材料，连接酵母的标记基因 Leu2（亮氨酸）后去转化大肠杆菌，然后再接上酵母染色体上分离得到的着丝粒 CEN3，再去转化大肠杆菌以增殖重组质粒，取得下一步实验用的 DNA。接下去是连接从酵母（真核生物）中分离得到的 ARS1。ARS 是指自主复制顺序（autonomouslyreplicat-ing sequence），这个顺序中可能包含着复制起点。目前已从非洲爪蟾的线粒 DNA，衣藻和烟草叶绿体和核 DNA 中分离 ARS。最后一个步骤是接上染色体端粒。用的是四膜虫（Te-trahymena）的 rDNA 末端（Tr 末端）。这样构建成的质粒去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状重组 DNA 分子，可以象天然染色体一样地复制和分离，这就是酵母线状质粒 YLp4。

图 23-6 构建酵母人工微小染色体的步骤

第三节 DNA 重组实验中常用的技术一、质粒 DNA 的提取及鉴定（一）质粒 DNA 的提取及鉴定

1．

（1）将 2ml 含相应抗生素的 LB 液体培养基加入到通气良好的 15ml 的试管中，接入一单菌落，于 37℃剧烈振荡培养过夜。

（2）将 1.5ml 培养物倒入 1.5ml 离心管中，用台式离心机于 4℃以 12000g 离心 5min，将剩余的培养物贮存于 4℃。

（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

2．碱裂解法小量抽提质粒

（1）将细菌沉淀 [上述步骤（3）所得] 重悬于 100μl 预冷的溶液Ⅰ（50mmol/ L 葡萄糖，25mmol/lTris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。

（2）加 200μl 新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴 5min。

（3）加 150μl 预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸 11.5ml, 水 28.5ml），缓和振荡，冰浴 5min。

（4）4℃以 12000g 离心 5min，将上清转移到另一离心管中。

（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复 2，（4）。

（6）用 2 倍体积无水乙醇室温沉淀双链 DNA，振荡混合，于室温放置 2min。

（7）4℃以 12000g 离心 5min。

（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

（9）用 75% 乙醇于 4℃洗涤 DNA，同上离心去上清真空抽干。

（10）加 50μl 的 1×TE（含 20μg/ml 无 DNA 酶的胰 RNA 酶），振荡，贮存于 -20℃。

（二）质粒 DNA 的大量制备

（1）同上 1.（1）

（2）将 1ml 含菌液倒入含相应抗生素的 Lb 100ml 中，37℃振荡培养至 A 590=1.0(5～6h)。

（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。

（4）收集菌液于离心管中，冰浴 10min。3000rpm, 离心 10min，去上清。

（5）加溶液Ⅰ5ml 悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴 5min。

（6）加溶液Ⅱ10ml 轻轻混匀，室温下 5min。

（7）加溶液Ⅲ7.5ml 轻轻混匀，冰浴 30min。15000rpm，4℃离心 20min。

（8）取上清液于高速离心管中，加 2 倍体积的无水乙醇，混匀，入 -20℃3～5h。

（9）15000rpm4℃ 离心 20min。

（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。

（11）用 5ml1×TE 溶解，加入 RNase A 15～20μl，42℃水浴 4h 于过夜。

（12）加入 5ml 饱和酚，混匀，4000～5000rpm 离心 5min，取上清液入 5ml 离心管内。

（13）分别加入 2.5ml 饱和酚，2.5ml 氯仿，混匀后同样离心收集上清。

（14）加等体积氯仿 / 异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。

（15）加入 1 /10 体积的 3mol/l NaAc 及 2 倍体积的无水乙醇于 -20℃3～5h。

（16）10000rpm4℃离心 20min。

（17）弃上清，加入 75% 乙醇洗涤 2 次。

（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量 1×TE 溶解质粒 DNA。

（三）质粒 DNA 的鉴定

1．酶切反应

（1）在 0.5mlEppendorf 管中加重蒸水 6μl，10×Buffer1μl，DNA 2μl，酶 1μl，混匀，37℃水浴 1h 以上。

（2）取反应物点样，观察酶切效果。

（3）酶切完全后，70℃5min 终止反应。

2．琼脂糖电泳

（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。

（2）在待测的 DNA 样品中加 1 / 5 体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

（3）打开电源开关，5V/cm 电泳。

（4）在 UV 灯下观察电泳结果。

二、DNA 的重组（一）DNA 的酶切与连接

（1）酶切反应

同质粒 DNA 的鉴定，只不过是质粒 DNA 换为载体 DNA。若大量酶切，则成比例增加。

（2）加 2 倍体积的预冷无水乙醇和 1 /10 体积的 3mol/l NaAc 混匀，-20℃2h 以上。

（3）15000rpm 离心 15min，弃上清。

（4）加入 75% 乙醇洗涤 2 次，离心弃上清，真空抽干。

（5）加入适量 1×TE 溶解。如此可得线性化载体 DNA。

（6）测定 DNA 的含量。

（7）加入线性载体 DNA 和含量 3～4 倍于载体的待插入 DNA 片段，连接缓冲液及 T4 连接酶适量至总体积为 20μl，在 12～14℃反应 12～16h。

（8）连接反应液可置 -20℃保存，供转化用。

（9）关于待插入 DNA 片段的获得参见附注。

（二）大肠杆菌感受态的制备及重组 DNA 的转化

1．感受态的制备

（1）接种单菌落于 2mlLB 培养液中，37℃过夜。

（2）取 0.25ml 过夜菌入 25ml LB 培养液中，37℃振摇 4～6h 至 A 590=0.4～0.6。

（3）倒入 50ml 管内，水浴 10min，以 2500～3000rpm 离心 5min，弃上清。

（4）缓慢加入 75mmol/ L 预冷 CaCl25ml 悬浮菌体，冰浴 20min，同上离心弃上清。

（5）缓慢加入 75mmol/ L 预冷 CaCl21.0ml 轻轻混匀后分装在 1.5ml Eppendorf 管中，每管 200μl，冰浴 1～2h。

2．重组 DNA 的转化

（1）将 3 只 Eppendorf 管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

转化项目受体菌DNA总体积DNA 对照组10μl200μl受体菌对照组200μl200μl转化组190μl10μl200μl（2）冰浴 30min 至 1h。中间摇动 3 次，以防受体菌沉底。

（3）42℃90s。

（4）37℃水浴 5min。

（5）加入无相应抗生素的 Lb200μl，混匀后，37℃水浴 30～60min。

（6）分别取 3 组反应物各 50μl 在含相应抗生素的固体 LB 培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于 37℃温箱中培养过夜。

（三）转化子 DNA 的快速鉴定-快速细胞破碎法

（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的 2ml LB 中，37℃振荡培养至 A 590值为 0.6～0.8。

（2）取 1ml 菌液至 1.5ml Eppendorf 管中，9000rpm 离心 9min，去尽上清。

（3）加入 70μlCracking Gel 缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml, 蔗糖 27.2g, 1.2% 溴酚蓝 1.67ml，加双蒸水至 200ml]，混匀后，37℃水浴 30min 以上。

（4）15000rpm 离心 15min。

（5）吸取上清点样电泳，观察。

（四）转化子 DNA 的酶切鉴定

1．转化子 DNA 的快速少量抽提

（1）同本节 二.（三）.1.

（2）菌液移至 5mlEppendorf 管中，9000rpm, 离心 9min，去上清。

（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴 10min。

（4）15000rpm 离心 15min。

（5）吸取上清，加入异丙醇 1ml 混匀，置室温 15～30min。

（6）15000rpm 离心 15min，弃上清，加入 75% 乙醇洗涤 2 次。

（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量 1×TE 溶解 DNA。

（8）取少量 DNA 电泳，观察浓度。

2．转化子 DNA 的小量酶切鉴定同质粒 DNA 的小量酶切鉴定，见本节 一（三）。

（五）重组子 DNA 的进一步鉴定

可用 Southern 印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节 四。

[附]电泳洗脱法回收酶切 DNA 片段

（1）用合适的酶切割 DNA 并电泳。

（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的 DNA 带，装入含 1×TBE 缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。

（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm 电泳至 DNA 贴紧袋壁。

（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入 1.5ml 的离心管内，10000rpm 离心 5min。

（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm 离心 5min，吸出上清放入新的离心管内。

（6）加入 1 /10 体积的 3mol/L AaAc,2 倍体积预冷的无水乙醇，于 -20℃放置 4～5h。

（7）于 4℃，10000rpm 离心 15min，弃上清。

（8）用 75% 的酒精洗涤 2 次，每次均于 4℃，10000rpm 离心 5min，弃上清。

（9）真空抽干，并用适量 1×TE 溶解沉淀。如此即得所需 DNA 片段。

三、地高辛配基随机标记 DNA 探针法（一）概述

基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备 DNA 探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针 DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记 DNA 探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在 dUTP 上（Dig-dUTP）。用随机引物及 DNA 多聚酶，以探针 DNA 为模板，合成互补 DNA，化学修饰过的 dUTP 同时掺入到标记的 DNA 探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针 DNA 中的 Dig-dUTP 结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。

1．标记 本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至 10ng，多至 3μg 的 DNA。能在新合成的 DNA 链每 20～25 个核苷酸，掺入一个 Dig-dUTP，反应时间约为 1h。

2．杂交 按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于 -20℃，重复使用。

3．免疫学检测 封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记 DNA 结合，出现杂交的半抗原 - 标记 DNA，显色反应起始是在碱性 pH 条件下加入无色的显色剂 X - 磷酸盐和 NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续 3d。典型的例子是在 24h 后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。

4．应用 地高辛配基标记 DNA 探针及检测试剂盒，能检测 0.1pg 的同源 DNA，能检测 1μg 哺乳动物 DAN 中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从 DNA 的标记和杂交至见到检测结果 24h 内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括 DNA- 印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。

（二）试剂盒成份

1．无标记对照 DNA1 此管内有 20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328 分别用 BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化，它们的混合比例为 2：3：3，共有 16 个 Pbr328 片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220 和 154×2bp。

2．无标记对照 DNA2 此管内有 20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用 EcoRⅠ线性化。

3．DNA 稀释缓冲液 有两管，每管 1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精 DNA（50μg/ml）。

4．标记对照 DNA 此管内有 50μl 线性化 pBR328DNA，按标记方法已标记有地高辛配基 dUTP, 含 20μg 模板 DNA，每毫升含 5μg 合成的标记 DNA。

5．六聚核苷酸混合物

6．标记用混合底物 此管内有 50μl10 倍浓度的 dNTP 标记用混合底物，含 dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和 Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

7．DNA 聚合酶Ⅰ大片段（标记级）此管内有 25μl DNA 聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl。

8．（Dig）AP 结合物 此管内有 200μl 多克隆羊抗地高辛配基 Fab- 片段，结合有碱性磷酸酶 750U/ml。

9．NBT 有两管，每管 1.25ml，是溶于 70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。

10．X- 磷酸盐 有两管，每管 0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的 5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

11．封阻试剂 有两瓶，每瓶有 50g 粉剂。

（三）需配制的溶液

EDTA（0.2mol/L）,pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED-TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N- 十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/ L 柠檬酸三钠；pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

（四）操作方法

1．标记 DNA 探针 每次标准的反应可标记 10ng 至 3μg 线性的 DNA，也可标记更大量的 DNA，但所有的成分和体积要相应增加。

（1）DNA 探针热变性，煮沸 10min，迅速冷却于冰 / 乙醇中 5min 以上，待用。

（2）取 Eppendorf 管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：

新鲜变性的 DNA 1-3μg

六聚核苷酸混合物 2μl（管 5）

dNTP 标记用混合底物 2μl（管 6）

加无菌重蒸水至 19μl

DNA 聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）1μl（管 7）

（3）在 37℃保温至少 60min，可到 20h。

（4）煮沸 5min，终止反应。

（5）15000rpm 离心 30s，置于冰上待用。

2．预杂交 按 100cm2膜用 20～40ml 预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成：5×SSC

0.5%（W/V）封阻试剂（管 11）

0.1%（W/V）N- 十二烷酰肌氨酸钠

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在 65℃预杂交过夜。

3．杂交 按 100cm2 膜用 2.5ml 杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

杂交液组成：50% 甲酰胺（V/V）

5%（W/V）封阻试剂

5×SSC

0.1（W/V）N- 十二烷酰肌氨酸钠

0．02%(W/V)SDS

新变性标记 DNA（150ng/ml）

杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于 42℃杂交过夜（16～20h）。

4．洗膜按 100cm2膜用 250ml 洗膜液计算。

（1）在室温下用 2×SSC/0.1%（W/V）SDS 溶液漂洗，5min，2 次。

（2）在 65℃条件下用 0.1×SSC/0.1%SDS 溶液漂洗，10min，2 次。

（3）在室温下用 2×SSC 溶液漂洗 1 次。

5．免疫测定

（1）配制溶液

缓冲液 1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）

缓冲液 2：0.5%(W/V)封阻试剂(管 11), 配制于缓冲液 1 中(封阻试剂不会快速溶解, 因此应预早 1h 前配制此溶液, 将试剂溶于 50～70℃, 此溶液保持混浊)。

缓冲液 3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

缓冲液 4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液：新鲜配制，在 10ml 缓冲液 3 中，加 45μlNBT 溶液（管 9）和 35μlX- 磷酸盐缓冲液（管 10）。

2． 显色过程

A．膜在缓冲液 1 中短暂洗涤（1min）。

B．在 100ml 缓冲 2 中保温 30min。

C．再用缓冲液 1 短暂洗涤。

D. 用缓冲液 1 稀释的抗体结合物 (管 8) 至 150U/L(1:5000); 稀释后的抗体结合物在 4℃只能稳定 12h。

E. 膜在 20ml 稀释的抗体结合物溶液中保温 30min。

F. 用 100ml 缓冲液 1 洗膜, 以除去未结合的抗体结合物,15min,2 次。

G. 膜在缓冲液 3 中平衡 2min。

H. 在黑暗条件下, 膜与 10ml 显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内, 几分钟内开始出现颜色, 一般显色反应在 1 天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

I．当要求的点或带已被检测时，可用 50ml 缓冲液 4 洗膜 5min 终止反应。

J．摄相。

说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。

（五）排除实验中问题的方法

1．DNA 不能有效地被标记时考虑

（1）用酚 / 氯仿抽提和 / 或乙醇沉淀，重新纯化 DNA。

（2）标记反应的保温时间延长（增至 20h）。

（3）DNA 变性或许不完全，这时对大片段 DNA 特别重要。

2．不能达到预期的灵敏度时考虑

（1）DNA 标记率。

（2）增加标记 DNA 的浓度或增加杂交时间。

（3）显色反应的时间可延长至 3d。

3．若显色时背景过深，可采取

（1）在杂交溶液中减少标记 DNA 量。

（2）增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。

（3）某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

（4）在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。

四、核酸的分子杂交核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术，转移技术及其它常用的杂交技术。

（一）斑点杂交的直接点样法

斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization），其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，灵敏度高。一个点样品只含 0.25～1pg 的 DNA 也能检测到。但不知道杂交片段的大小（碱基对数）。

1．DNA 的打点法（DNa Dot Blot）

（1）膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。

（2）DNA 变性：将 DNA 溶液于 1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量 DNA 样品加于小塑料管中，在 100℃沸水中煮 10min，迅速入冰水中。

（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取 1～5μl 变性 DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使 DNA 慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。

（4）固定：将凉干的滤膜夹在滤纸中，于 80℃干烤 2～3h，然后进行杂交。

2．RNA 的打点法（RNa Dot Blot）

（1）膜的处理：同 DNA 的打点法。

（2）RNA 变性：将提取的 RNA 与 50μl 20×SSC/ 甲醛（30μl20×SSC 加 20μl 甲醛）混合，65℃水浴 15min。

（3）点样：同 DNA 的打点法。

（4）固定：同 DNA 的打点法。

（二）DNA 的吸印转移法（Southern Blot）

DNA 经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链 DNA 从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异 DNA 序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。

试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl

中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaClpH8.0

20×SSC:0.3mol/ L 柠檬酸钠，3mol/l NaCl

1．电泳 取 DNA 约 5μg 加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后的 DNA 点样于 0.8%～1.2% 的凝胶上，以 0.8～1V/cm 电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘 0.5cm 处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射 10～20min 后拍照。

2．变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中 25℃振荡 60min。蒸馏水洗胶 1min，将凝胶放入中和液中 25℃振荡 60min。

3．转移 取托盘一只，放入 10×SSC 溶液约 500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形 Wateman paper（滤纸）搭在桥上，两边浸入 10×SSC 溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入 2×SSC 溶液中浸湿后放在凝胶上（如 NC 膜浸湿不均匀，则考虑更换 NC 膜，操作时手切勿触及 NC 膜），去掉凝胶与 NC 膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比 NC 膜小 1mm）放在 NC 膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约 500～1000g。转膜 24h，中间更换吸水纸。

图 23-7 Southern 转膜示意图

4．固定用 2×SSC 溶液洗膜 5min 去掉残余凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入 EB 液中 30min，取出在 UV 灯下观察是否有 DNA 残余。80℃烤膜 2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。

（三）RNA 的吸印转移法（Northern blot）

在 RNA 凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂处理 RNA，再在适宜条件下电泳使充分变性的 RNA 直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。

试剂：

乙二醛：4mol/L（约为 30%），经过阴阳离子交换树脂纯化，使 pH 为 5.5～6.0

磷酸缓冲液：80mmol/L pH6.5～7.0

磷酸缓冲液：10mmol/L pH6.5～7.0

Tris-HCl:20mmol/L pH7.8

二甲基亚砜：分析纯

20×SSC：0.3mol/ L 柠檬酸钠，3mol/l NaCl

1.RNA 变性 吸取 1μl 80mmol/ L 磷酸缓冲液，1μl RNA 样品（最多 100μg），2μl，4mol/l 乙二醇，4μl 二甲基亚砜。混匀后，50℃水浴 1h，然后放入冰中。

2．电泳 变性结束后，加入含有 50% 甘油的 10mmol/ L 磷酸缓冲液 2μl 和少量溴酚蓝，混匀后点样于 1.0% 的凝胶上，以 4～5V/cm 电压电泳。凝胶电泳液为 10mmol/ L 磷酸缓冲液，pH6.5～7.0。

3．转移 变性处理后的 RNA 可以转移并结合到硝酸纤维膜上，转移过程和转移变性与 DNA 相同。

4．固定 用 20×SSC 转移 RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后，80℃烤膜 2h

5．乙二醛附加物消除 RNA 膜固定后，放入 20mmol/l Tris-HCl 中，100℃处理 5～10min，去除乙二醛，然后进行杂交。

（四）硝酸纤维膜固相杂交

核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上，固定后，可以进行杂交反应。在杂交溶液中，硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。

试剂及操作方法见本节 三。

五、真核细胞基因组 DNA 的制备从不同组织细胞或血细胞中提取 DNA 是进行基因诊断的先决条件。制备 DNA 的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持 DNA 分子的完整。蛋白酶 K 的应用使这两个原则得到了保证。在提取 DNA 的反应体系中，SDS 是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶 K 可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使 DNA 分子尽量完整地分离出来。具体方法如下：

（一）白细胞 DNA 的制备

（1）采集外周静脉血 10ml，加 1.7ml ACD（柠檬酸 0.48g、柠檬酸钠 1.32g、葡萄糖 1.47g、加水至 100ml,0.6kg/cm2灭菌 30min）抗凝。

（2）将血液放入已灭菌的 50ml 塑料离心管内，加 30mlSTMT[0.32mol/ L 蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。

（3）冰浴 10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT 重复处理 1～3 次。

（4）弃上清，白色沉淀物加 10mlSTE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加 10mg/ml 蛋白酶 K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置 37℃水浴 15～20h。

（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm 离心 5min。

（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿 - 异戊醇（24：1）抽提，3000rpm 离心 5min。

（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿 - 异戊醇（24：1），抽提，3000rpm 离心 5min。

（8）小心吸取上层水相，加入 1 /10 体积 3mol/l NaAc,2.5 体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。

（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入 Eppendorf 管内，加 1ml 75% 乙醇 4℃静置 1h，离心，10000rpm10min。

（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。

（11）加 200μl1×TE 溶解，置 4℃保存。

（12）对所提 DNA 用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

（13）取 2～4μl DNA 样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提 DNA 的质量及降解情况。

（二）组织 DNA 的制备

（1）将 200mg 组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加 4ml 1×RSB 缓冲液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入 10ml 带盖的塑料管中。

（2）加 SDS 至浓度为 1%（可加 0.4ml10%SDS），混匀。由于 DNA 从核中释放出来，样品变得粘稠。

（3）加 10mg/ml 蛋白酶 k 44μl，终浓度为 100μl/ml，37℃保温 1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加 0.4ml 5mol/L NaCl。

（4）用等体积饱和酚、1/ 2 体积饱和酚和 1 / 2 体积氯仿 - 异戊醇及等体积氯仿 - 异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm 离心 5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。

（5）加 2.5 倍体积预冷无水乙醇沉淀 DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段 DNA，并移入一新管，吸干 DNA 中的无水乙醇。

（6）DNA 溶于 4ml 0.1×SSC 中，4℃过夜可作进一步纯化。

（7）加 20μlRNase A(10mg/ml),37 ℃保温 5h。加 0.4ml5mol/L NaCl。

（8）同上法用饱和酚、氯仿 - 异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。

（9）75% 乙醇洗涤 2 次，离心，弃上清，真空抽干。适量 1×TE 溶解，保存在 4℃。

六、转移基因最常用的将克隆重组的 DNA 片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的 DNA 可能是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。

（1）配制下列溶液

①2×HEPES- 缓冲盐溶液（HBS）

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装贮存于 4℃。

④DNA：将 DNA（约 20μg/106细胞）溶于 0.1×TE（pH8.0），使用浓度为 40μg/ml。为使转化效率达到最高，质粒 DNA 应用 CsCl- 溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用 DNA 量较少，应加入载体 DNA 将 DNA 浓度调至 40μg/ml。实验室制备的真核载体 DNA 转染效率通常要比商品化的牛胸腺 DNA、鲑鱼精 DNA 高。载体 DNA 用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。

（2）转染前 24h 用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞，以 1～2×105细胞 /cm2的密度重新种入 60mm 组织培养皿中。在 37℃、5%～7%CO2及一定湿度的培养箱中培养 20～24h。

（3）每转染一个 60mm 培养皿中的单层细胞，须依如下方法制备磷酸钙 -DNA 共沉淀物：取步骤一所制备的 DNA[40μg/ml，溶于 0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl, 放入一次性使用的灭菌 5ml 塑料管中，缓慢加入 31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合 30s 左右）。于室温育 20～30min，其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。

通常采用的另一方案是将氯化钙和 DNA 的稀释混合液加入 2×HBS 溶液中，逐滴加入并小心混合 250μl 按步骤一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）的 DNA。按照前述方法温育之。

如果需要转染更为大量的细胞，上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番，则须使用更大的塑料管，一般在 25cm2细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿上，可将 0.5ml 磷酸钙 -DNA 共沉淀物加入 5ml 培养液中，而在 90mm 细胞培养皿上，一般将 1ml 沉淀物加入 10ml 培养液中。

已经发表的方案中，混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外，其它措施均无济于事，并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入 DNA 溶液时连续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物，以致降低转化效率。实际上，除了混合的速度之外，还有其它若干因素包括 DNA 的浓度和大小（让高分子量 DNA 从细针头中通过，可将之剪切变小）、缓冲液的精确 pH（有些工作者配制了几批 pH 范围从 6.95 至 7.1 不等的 HBS 缓冲液，逐批试验沉淀物的质量及转染效率）。如果必须使转染效率达到最高，就要花时间针对特定的系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验的试剂，只需依照前面方法进行配制和贮存，即可在长期内获得可重复的结果。

（4）将磷酸钙 -DNA 悬液转移至细胞单层上的培养液中 [在 60mm 培养皿中，可将 0.5ml 悬液加入 5ml 培养液中]，轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合，此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一方法是吸出培养液，直接把沉淀物加到细胞上，将细胞置于室温温育 15min，然后再将培养液加回到培养皿中，此时细胞上有许多细小颗粒。采用以上两种方法，都要在 37℃、5%～7%CO2 及一定湿度的培养箱中将转染细胞培养长达 24h[时间的长短取决于后续处理步骤的不同，见步骤（5）]。

（5）然后，转染细胞可依以下任一种方法处理：

①如果不进行其它处理（如用氯喹、甘油或丁酸钠等试剂处理，见后），可在细胞培养 16～24h 后，吸出培养液和沉淀物，用 PBS 将单层细胞再洗一次。然后按下述③d 操作。

②在许多情况下，同时用氯喹处理细胞，可提高 DNA 摄入率。氯喹可能是通过抑制溶酶体水解酶类对 DNA 的降解而起作用的。氯喹浓度及其处理时间不能超越细胞对其毒性作用的耐受能力。因此必须通过预实验来决定适于所用特定型别细胞的最佳氯喹浓度。但对于大部分型别的细胞，用终浓度为 100μmol/ L 的氯喹处理 3～5h，都可取得良好效果。可在磷酸钙 -DNA 共沉淀物加入细胞之前或之后（见步骤（4）介绍的其它方法），直接将氯喹二磷酸贮存液（过滤除菌并贮于 -20℃用金属泊密封的管中，100mmol/L）稀释（1：100）于培养液中。在氯喹处理过程中，细胞呈现泡状是正常的。经用 DNA 和氯喹处理 3～5h 后，弃去培养液和沉淀，用 PBS 洗，然后按下述 d 操作。

③用甘油短暂处理细胞，同样可提高转化效率或导入 DNA 的瞬时表达水平。这一步骤可以在氯喹处理之后进行。由于不同细胞对甘油的毒性作用的敏感性相差悬殊，因此每种型别的细胞都必须通过预实验决定最佳处理时间（从 30s 至 3min）。耐受甘油的细胞可以暴露于含磷酸钙 -DNA 共沉淀物（含或不含氯喹）的生长液 3～5h 后进行休克。

a. 吸出生长液，用 PBS 将单层细胞洗 1 次；

b. 在单层细胞中加入 1.5ml 溶于 1×HBS 的 15% 甘油，在 37℃培养 0.5～3min；

c. 吸出甘油，用 PBS 将单层细胞洗 1 次；

d. 加入 5ml 预加温的完全生长液，放入培养箱中继续培养 24～60h 后，检测 DNA 的瞬时表达或将细胞重新种入适当的选择性培养基中，分离稳定的转化体。

④业以表明，丁酸钠也可以在猴源和人源细胞中增强带 SV40 早期启动子 / 增强子的重组质粒的表达。可直接在生长液中加入有关试剂，也可以使经过甘油休克的细胞接受丁酸钠处理。须视细胞型别的不同，采用不同浓度的丁酸钠（500mmol/ L 贮存液，在化学通风橱中用 NaOH 中和丁酸制备而成），例如：

CV-110mmol/L

NIH-3T3 7mmol/L

HelaS3 5mmol/L

CHO 2mmol/L

不加完全生长液，然后重复步骤 d。

（6）转移基因表达和细胞集落形成

①瞬时表达：在转染后 48～60h 收获细胞，进行 RNA 或 DNA 杂交分析。新合成的蛋白质可以用放射免疫测定 Western 印迹，体内代谢标记-免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性的测定等方法来进行分析，如果测定中有重复品或者转染细胞要经过多种不同条件或在一段时间历程以内取不同时间进行处理，就要避免皿与培养皿之间转染效率的偏差。在这些情况下，最好转染大片的单层细胞（90mm 培养皿），培养 24h 后用胰蛋白酶进行消化，再分接到若干较小的培养皿上。

②稳定转化：在非选择性培养基中培养 18～24h，使所转移基因得到表达之后，用胰蛋白酶消化细胞，种入适当的选择性培养基中。这种培养基在 2～3 周内每 2～4d 须更换 1 次，以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。

可以克隆单个细胞集落，增殖后进行测定。可以用冰预冷的甲醇将仍保留在培养皿内的细胞固定 15min，再于室温用 10%Giemsa 染色 15min，最后用自来水冲洗，这样即可得到细胞集落数的永久记录。Giemsa 染液可用 PBS 或水现用现配，并用 Whatman 1 号滤纸过滤。

重新接种细胞以便取得分隔良好的细胞集落所要求稀释倍数，主要由稳定转化的效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级，它起决于：a. 受体细胞的型别（即使同一细胞系，克隆不同或传代数不同，也表现出显著差异）；b. 导入基因的特性及其转录调控信号强弱；c. 转染中所用供体 DNA 的量。

第四节 遗传病与肿瘤的基因诊断从 DNA 水平上寻找确诊遗传病的指标或探讨遗传病和肿瘤的病因等方面，已取得很大成绩，这对产前诊断，早期确诊和突变基因携带者的检出等都有重要意义。所用的方法大体有以下几种。

一、分离基因进行结构分析利用 DNA 离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定载体中插入 DNA 片段的特性等一系列技术，可以设法分离出目的基因或某一特定的 DNA 顺序。然后通过 DNA 核苷酸顺序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如，人体癌基因的分离和研究癌基因同原癌基因在 DNA 的结构与功能上的差别，对了解细胞癌变的机制起了很大的作用。分离目的基因或专一 DNA 顺序更常用的是制备分子杂交探针，通过 Southern 印迹杂交或 Northern 印迹杂交等，了解某些遗传病患者基因结构上的差别，从而找到可靠的诊断方法。比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段长度的多肽现象等。

二、DNA 限制性片段多态性连锁分析DNA 限制性片段长度多态性（restricitionfragment length polymorphism, RFLPs）连锁分析法是指由于缺失、重排或碱基置换的结果，使 DNA 分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，或是消失或是增加，所以酶切后生成的 DNA 片段的长度也随之改变。这种 DNA 限制性片段长度的变化往往同某种疾病的连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标。

如果所分析的 DNA 分子不太大，比如人体线粒体 DNA，长 16569bp。在这种 DNA 分子上每种限制酶的识别点不过几个到几十个，因此，当某种限制酶的识别点发生改变并经过这种酶切后，可清楚地看到 DNA 电泳带的图型发生改变，条带或者增加或是减少，条带所处的位置也有变化。可是，遗传病病例分析时所用的是基因组 DNA，而基因组 DNA 从限制酶酶切后至少会生成 100 万个片段，多的可达 1000 万个片段。如果其中有一、二个片段发生改变，不可能从电泳凝胶上直接观察分辨。此时就必定要用合适的探针。某个目的基因或某一特定的 DNA 片段，在同酶切后的 DNA 作分子杂交后，可在曝光的 X 线片上看到 RFLP。图 23- 8 是用分子杂交法检测 RELP 示意图。

图 23-8 分子印迹杂交法则 RFLPs 的示意图

这是通过限制酶 A 识别点的改变出现 DNA 的 RFLP，再以合适的 DNA 片段作为分子杂交的探针，在探针上标记了放射性同位素，同分别经酶 A，酶 B 完全酶切的 DNA 作印迹杂交。在曝光后的 X 线片上可看到不同的杂交带图型。①是正常个体，经酶 A 和酶 B 切后的 DNA 同探针杂交，都只看到一条带。②是一个杂合子即隐性突变基因携带者的杂交图式，由于它的一条染色体的 DNA 分子中酶 A 的识别点发生改变，酶切后的 DNA 片段较原来的长，所以出现一长一短两个片段。③是突变基因纯合子，也就是患者，酶 A 和 B 的酶切片段虽然是各有一个，但 A 的片段比正常的个体长，所以杂交带出现的位置也有改变。从图 23- 8 可以看出研究 RFLP 的两个重要因素，一是要制备合适的探针，二是要用尽可能多的各种限制性内切酶进行酶切和杂交。

1974 年首次用 RFLP 作为遗传学分析的方法。1978 年简悦威和 Dozy 等第一次用人体 β 珠蛋白基因作为探针，同限制酶 Hpa Ⅰ酶切的 DNA 做杂交，发现了 DNA 的 RFLP 与镰形细胞贫血之间的关系（表 23-4）。

表 23-4 DNA 的 RFLP 与镰形细胞贫血的关系

Hb 基因型Hpa Ⅰβ 珠蛋白基因片段（kb）总计13.0kb 片段的频率7.6/7.67.6/7.07.0/13.07.6/13.013.0/13.0黑人 AA862150.03AS5119160.31SS411150.87白人 AA1212亚洲人 AA1515由此可以看出，HpaⅠβ 珠蛋白基因 13.0kb 片段可作为检出镰形细胞贫血及携带者的一种指标。1981 年 Geever 等根据镰形细胞贫血是 β 珠蛋白第 6 个密码子的一个核苷酸置换的结果，用限制酶 DdeⅠ酶切 DNA 后与 β 珠蛋白基因杂交。结果是：Hb 基因型 AA 的正常个体有 175bp 和 201bp 二条带。SS 个体即患者只有一条带，是正常人两个 DNA 片段长度之和，即 376bp。AS 杂合子则有三条带：175bp、201bp、376bp。其原因是第 6 个密码子中的 A 被 T 置换，使 Hb A 变成了 HbS。限制酶 DdeI 的识别顺序为 C↓TNAG，当 A 变成 T 后，该部位 DNA 顺序变成 CTNTG，从而丢失了一个 DdeI 识别位点，所以 HbA 的 2 个 DdeI 片段（175bp、201bp）变成了 HbS 的一个 DdeI 片段（175+201=376bp）。

除了用基因作探针直接检测基因内的核苷酸变化引起的 RFLP 外，还有两种途径：一是用基因作探针，检测该基因两侧顺序中核苷酸变化引起的 RFLP，确定这些 RFLP 与遗传病之间有无连锁关系。另一种是用克隆的专一 DNA 顺序作探针，检测基因两侧顺序 DNA 的 RFLP 与遗传病的连锁关系。迄今用上述三种方法已查明近 30 种遗传病可通过 RFLP 来检测。表 23-5、6、7 为部位举例。

表 23-5 用基因作探针检测基因内的结构变化来直接分析遗传病

遗传病探针年代抗凝血酶Ⅲ缺乏症抗凝血酶Ⅲ基因1983α1 抗胰蛋白酶缺乏症合成的寡核苷酸1983动脉粥样硬化症载脂蛋白 A - 基因1983糖尿病胰岛素基因1983Ehlers-Danlos 综合症α（1）胶原蛋白基因1983生长激素缺乏症生长激素基因1981乙型血友病凝血因子ⅠⅩ基因1983遗传性胎儿血红蛋白持存症 β 珠蛋白基因1979，1983HPRT 缺乏症HPRT 基因1983自毁容貌综合征HPRT 基因1983成骨不全原 α 1（1）胶原蛋白基因1983视网膜母细胞瘤Rb 基因1983镰形细胞贫血合成的寡核苷酸1983地中海贫血 β 珠蛋白基因1981 α 和 β 珠蛋白基因1978，1980甲型血友病凝血因子Ⅷ基因1985表 23-6 用克隆的 DNA 片段作探针检测连锁的 RFIP 间接分析遗传病

遗 传 病探 针探针与疾病基因座位间距离（cm）*年 代脆性 X 综合征PN1，VK21，U6-2<51989慢性进行性舞蹈病G8<101983Menkes 钢发症L1，28161983肌营养不良良性假肥大型XJ 和 per+87 系列?/FONT>1983假肥大型XJ 和 per+87 系列?/FONT>1986强直性肌营养不良补体 C 3基因71983类固醇 - 硫酸酯酶 - X 链锁甲癣λRC8251983视网膜劈裂症（Retinoschisis）λRC8151983表 23-7 用基因作探针检测紧密连锁的 RFLP 间接分析遗传病

遗传病基因探针年代糖尿病（Ⅱ型）胰岛素基因1981，1983生长激素缺乏症（Ⅰ型）生长激素基因1982高甘油三酯血症载脂蛋白 A - 1 基因1983苯酮尿症苯丙氨酸羟化酶基因1983除了遗传病与 RFLP 之间的关系的资料，还发现人体癌基因 Ha-ras 的 Bam HI 片段的长度可在 6.75～8.7kb 之间变动。这种 RFLP 是由于 Ha–ras 基因有一段可变串联重复顺序（vari-able tandem replication,VTR）。重复顺序长 28bp、重复次数可以不同，所以造成 BamHⅠ片段的长度变化。图 23- 9 中左图箭头是某种酶的切点，黑框代表可变串联重复顺序。右图代表某种酶切割后，不同个体显示的电泳图谱。1/1、2/2、3/ 3 代表 1、2、3 等位基因的纯合子；1/2、1/2、2/ 3 代表三种可能的杂合子，由于重复顺序数目不同改变了该酶的切点位置，因而形成不同长度的 DNA 片段。除 Ha-ras 癌基因外，成人多囊肾（adult polycystic kidney）基因旁也出现 VTR，现已用它作携带者及产前诊断。

图 23-9 可变串联重复顺序（VTR）示意图

三、聚合酶链反应1988 年 Higuchi 等报道，可以从人的单根毛发的毛囊细胞中抽提 DNA，并结合运用 DNA 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，分析了单根毛发细胞中抽提的线粒体 DNA 的 D 环区（D-loopregion）的“DNA”指纹图”。

PCR 技术由 Mullis 等首创（详见第二十二章）。它又称为 DNA 体外扩增技术，是用 DNA 聚合酶在体外扩增一段 DNA 顺序达百万倍以上。这样就可直接观察而不用印迹杂交法。这项技术的基本原理是，将有待扩增的 DNA 分子加热变性成为单链，然后加入按欲扩增 DNA 片段两端核苷酸顺序合成的一对引物和耐高温的 DNA 聚合酶，这样就可以单链 DNA 分子为模板合成了它的互补链。接着再加热使 DNA 双链解链。由于这类 DNA 聚合酶是耐高温的，所以在热变性处理后仍保持酶活性，在有引物分子存在的条件下又继续合成该 DNA 片段。如此循环往复 20～30 多个周期，微量的 DNA 分子可增加 10 万～100 万个拷贝。

这种技术在医学上有很大的用途。先是 Saiki 等（1985）将其用于镰形表细胞性贫血的快速诊断。继而 Chehab 等将其用于 Barts 胎儿水肿综合征的前诊断（缺失纯合型）。我国吴冠芸、曾溢滔、蔡仕萍、张基增等在不同实验室将 PCR 结合寡核苷酸探针法用于已知点突变的 β 地中海贫血的产前诊断，并不断简化技术。目前 PCR 技术已用于许多疾病的诊断及产前诊断（如血友病、假肥大性肌营养不良、α1抗胰蛋白酶缺乏症、艾滋病等）。原则上已知 DNA 顺序的基因及突变性质的遗传病都可以应用此技术。此外，PCR 还可用于直接做 DNA 顺序分析。

第五节“DNA 指纹”与法医鉴定1979 年 Teffreys 根据 β 珠蛋白基因座位近旁出现的 RFLP 频率同测定的核苷酸总数，推算出人体基因组的遗传异质性约为每 100 个核苷酸中有一个差异。后在人体 DNA 随机片段的文库中分离出高度变异的超变区。从 1982 年起，分别在人的胰岛素基因，α 类珠蛋白基因，肌动蛋白基因和 C -Ha-ras- 1 基因中陆续发现了这些超变区。这是一些很短的顺序或称“小卫星顺序”串联重复所组成。不同等位基因的重复数目也不相同。只要用重复顺序内不含切点的限制性内切酶切割，就可产生长度不等的限制性片段。

短的重复顺序分别长 16、17、32、33、37、41、62、64 和 376bp，但这些重复顺序几乎都共有一种“核心顺序”。“核心顺序”长 10～15bp。如果人工合成很短的重复顺序作为 DNA 分子杂交的探针，同经限制性内切酶酶切的人体 DNA 作 Southern 印迹杂交，可以得长度不等的杂交带。杂交带的数目的分子量大小几乎不可能有两个人会完全相同的，因此把这种杂交带的图型称为“DNA 指纹”（DNafinger-printing），意思是 DNA 的杂交带型同指纹一样，也是每个人所特有的。

表 23- 8 比较了用两种探针进行印迹杂交后，出现杂交带的长度和数目。根据计算，如果只用一种探针，则 A 个体 DNA 所呈现的杂交带型，同样出现在 B 个体 DNA 中的概率为 3×10-11。如果同时用两种探针进行比较，则两个个体完全相同的概率小于 5×10-19。目前全世界人口为 50 亿，即 5×109。因此，两个个体的 DNA 杂交带型完全相同的可能性极小。

表 23-8 随机匹配的个体间“DNA 指纹”相同的概率

探针DNA 片段大小（k）每一个体中片段出现的数目±SD A 个体中的片段也出现于 B 个体的概率A10～202.8±1.00.116～105.1±1.30.184～65.9±1.60.28B10～202.9±1.00.086～105.1±1.10.204～66.7±1.20.271985 年 Teffreys 等将“DNA 指纹”应用于法医鉴定。他们从血斑、精斑或新鲜毛发根部抽提微量 DNA 后作印迹杂交。从 4 年前的精斑、血斑样品中仍能提取出来未降解的 DNA，特别是设计出一些方法可从妇女阴道分泌物中，把混在里面的精子分离出来。从中提取 DNA 后可明确无误地鉴定谁是精子的供体。为法医鉴定提供一种新的有效方法。

参考文献1．Drake JW, etal.Updating the theory of mutation. American Scientist, 1983; 71:621

2.Jukes TH, et al. Evolutionarynucleotide replacements in DNA.Nature, 1979;281:605

3. 赵寿元. 自然科学年鉴. 上海翻译出版公司，1987

4．Maniatis T, etal. Moleculer cloning: A laboratory Manual. Cold Sping Harbor Laboratory, 1982

5.Myers RM, et al. Dctection ofsingle base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNAduplexes. Sicence, 1985;230:1242

6.Mullis K, et al. Specificenzymatic amplificaton of DNAin vitro. The polymerase chain reaction. ColdSpring Harbor Symposia on Qantitative Biol,1986; L1:263

7. 金冬雁，等译. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社,1992

8. 孙乃恩, 等编著. 分子遗传学. 南京: 南京大学出版社,1993

9. 邱泽生, 主编. 基因工程. 北京: 首都师范大学出版社,1992

10. 张昌颖, 主编. 核酸生物化学. 北京: 人民卫生出版社,1993

11. 杜传书, 刘祖洞, 主编. 医学遗传学. 第二版, 北京: 人民卫生出版社,1992

附录附录一 免疫细胞化学常用试剂介绍一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和 / 或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。

目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。

1. 4% 多聚甲醛 -0.1mol/ L 磷酸缓冲液（pH7.3）

试剂：多聚甲醛 40g

0.1mol/ L 磷酸缓冲液至 1000ml

配制方法：称取 40g 多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入 500～800ml 0.1mol/ L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer 以下简称 PB），加热至 60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许 1n NaOH 才能使溶液清亮，最后补足 0.1mol/ L 的 PB 于 1000ml，充分混匀。

该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定 2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。

2. 4% 多聚甲醛 - 磷酸二氢钠 / 氢氧化钠

试剂：A 液：多聚甲醛 40g

蒸馏水 400ml

B 液：Na2HPO4·2H2O16.88g

蒸馏水 300ml

C 液：NaOH 3.86g

蒸馏水 200m

配制方法：A 液最好在 500ml 的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B 液和 C 液配制好后，将 B 液倒入 C 液中，混合后再加入 A 液，以 1nNaOH 或 1N HCl 将 pH 调至 7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至 1000ml 充分混合，4℃冰箱保存备用。

该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为 0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。

3． Bouin’s 液及改良 Bouin’s 液

试剂：饱和苦味酸

40% 甲醛 250ml

冰醋酸 50ml

配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于 4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良 Bouin’s 液即不加冰醋酸。

该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH 为 3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。

4．Zamboni’s(Stefanini’s)液

试剂：多聚甲醛 20g

饱和苦味酸 150ml

Karasson-Schwlt’s PB 至 1000ml

配制方法：称取多聚甲醛 20g，加入饱和苦味酸 150ml，加热至 60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加 Karasson-Schwlt’s PB 至 1000ml 充分混合（Karasson –Schwlt’s 磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。

该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用 2.5% 的多聚甲醛和 30% 的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为 6～18h。

5．PLP 液 PLP 液即过碘酸盐 - 赖氨酸 - 多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde-hyde fixative）

试剂：过碘酸钠

赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：

多聚甲醛

蒸馏水

配制方法：

（1）贮存液 A（0.1mol/ L 赖氨酸 -0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐 1.827g 溶于 50ml 蒸馏水中，得 0.2mol/ L 的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入 Na2HPO4 至 0.1mol/L，将 pH 调至 7.4，补足 0.1mol/ L 的 PB 至 100ml，使赖氨酸浓度也为 0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为 300mOs mmol/L/kg。

（2）贮存液 B（8% 多聚甲醛溶液）：称 8g 多聚甲醛加入 100ml 蒸馏水中，配成 8% 多聚甲醛液（方法见前）。过滤后 4℃冰箱保存。

（3）临用前，以 3 份 A 液与 1 份 B 液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使 NaIO4 终浓度为 2%。由于 AB 两液混合，pH 从约 7.5 降至 6.2，故固定时不需再调 pH 值。固定时间为 6～18h。

该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean 和 Nakane 等认为，最佳的混合是：含 0.01mol/ L 的过碘酸盐、0.075mol/ L 的赖氨酸、2% 的多聚甲醛及 0.037mol/ L 的磷酸缓冲液。

6．Karnovsky’s 液（pH7.3）

试剂：多聚甲醛 30g

25% 戊二醛 80ml

0.1mol/L PB 至 1000ml

配制方法：先将多聚甲醛溶于 0.1mol/L PB 中，再加入戊二醛，最后加 0.1mol/ L 的 PB 至 1000ml，混匀。

该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在 4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定 10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。

7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）

试剂：对苯醌 4.0g

0．01mol/L PBS1 000ml

配制方法：称取 4.0g 对苯溶于 1000ml 0.01mol/ L 的 PBS 即可。

对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。

8．PFG 液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative, PFG）

试剂：对苯醌 20g

多聚甲醛 15g

25% 戊二醛 40ml

0.1mol/ L 二甲酸钠缓冲液至 1000ml

配制方法：先以 500ml 左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至 1000ml 充分混合。

对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。

9．碳二亚酰胺 - 戊二醛（ECD-G）液

试剂：0.05mol/L PB500ml

0.01mol/L PBS 500ml

Tris 约 14g

浓 HCl 少许

ECD 10g

25% 戊二醛 3.5ml

配制方法：先以约 500ml 的 PB 与相同体积的 PBS 混合，加入 Tris（使其终浓度为 1.4%）溶解，以浓 HCl 调 pH 至 7.0，再将事先称取好的 ECD 和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用 pH 计检测，约 2～3min 时，pH 降至 6.6，再以 1N 的 NaOH 在 4min 内调 pH 至 7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经 PBS 漂洗过）的器皿中，在 23℃固定 7min 后，以 PBS 洗去固定液，即可进一步处理。

ECD 即乙基 - 二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi-imidehydrochloride]，简称乙基 -CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD 单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris 及 PB 联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。

10．四氧化锇（锇酸 Osmic Acid, OsO4）

配制：将洗净装有 OsO4 的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。

（1）2% OsO4 水溶解：取 OsO41g 溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。

（2）1% OsO4-PB：

试剂：A、2.26%NaH2PO4·2H2O4.15ml

B2.52%8.5ml

C、5.4% 葡萄糖 5ml

D、OsO4 0.5g

配制方法：先分别配好 A、B、C 三种液体，取 A 液 41.5ml 与 B 液 8.5ml 混合，将 pH 调至 7.3～7.4，取 A-B 混合液 45ml 再与 5ml C 液混合即为 0.12mol/L PBG。

（3）1%OsO4/0.1mol/ L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：

试剂：2% OsO4 水溶液 10ml

0.2mol/ L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml

配制方法：取 2%OsO4 储备液 10ml 与等量 0.2mol/L、pH7.2～7.4 的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。

OsO4 是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管 OsO4 主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽 - 蛋白质或肽 - 脂交联。过氧化物酶的反应产物经 OsO4 处理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于 OsO4 的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用 1% 的高锰酸钾，在电镜水平则常用 H2O2 来处理。

以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如 70%～90% 的酒精、丙酮、醋酸酒精（含 0.1%～1% 醋酸的 70%～90% 的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但 Zenker-Formalin 可进行短时的固定）。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用 4℃的 Karnovsky’s 液灌注固定 10～30min 后，接着在 pH7.3、0.1mol/ L 的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试 PFG、PLP 及 Zamboni’s 液等混合固定液。

二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。

1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（PhosphateBuffer, PB）

试剂：NaH2PO4·2H2O

Na2HPO4·12H2O

配制方法：配制时，常先配制 0.2mol/ L 的 NaH2PO4 和 0.2mol/ L 的 Na2HPO4，两者按一定比例混合即成 0.2mol/ L 的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的 PB 和 PBS。

（1）0.2mol/ L 的 Na2HPO4；称取 Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至 1000ml 溶解。

（2）0.2mol/ L 的 Na2HPO4：称取 NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g 或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至 1000ml 溶解。

（3）0.2mol/LpH7.4 的 PB 的配制：取 19ml 0.2mol/ L 的 NaH2PO4 和 81ml 0.2mol/ L 的 Na2HPO4·12H2O, 充分混合即为 0.2mol/ L 的 PB（pH 约为 7.4～7.5）。若 pH 偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。

2．0.01mol/ L 磷酸盐缓冲生理盐水（PhosphateBuffered Saline, PBS）

试剂：0.2mol/L PB 50ml

NaCl 8.5～9g(约 0.15mol/L)

重蒸水 至 1000ml

配制方法：称取 NaCl 8.5～9g 及 0.2mol/ L 的 PB 50ml，加入 1000ml 的容量瓶中，最后加重蒸水至 1000ml，充分摇匀即可。若拟配制 0.02mol/ L 的 PBS，则 PB 量加倍即可，依此类推。

PB 和 PBS 是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/ L 的 PBS 主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其 pH 应在 7.25～7.35 之间，否则需要调整。0.1mol/ L 的 PB 常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB 的 pH 值稍高些，稀释成 0.01mol/ L 的 PBS 时，常可达到要求的 pH 值，若需调整 pH，通常也是调 PB 的 pH。

3．Karasson –Schwlt’s 磷酸盐缓冲液

试剂：NaH2PO4·H2O3.31g

Na2HPO4·7H2O 33.77g

重蒸水 至 1000ml

配制方法：同前

该缓冲液主要用于配制 Zamboni’s 固定液。

4．0.5mol/L pH7.6 的 Tris- HCl 缓冲液。

试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57g

1N HCl 约 420ml

重蒸水 至 1000ml

配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解 Tris, 加入 HCl 后，用 1N 的 HCl 或 1N 的 NaOH 将 pH 调至 7.6，最后加重蒸水至 1000ml。此液为储备液，于 4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的 Tris-HCl 缓冲液浓度为 0.05mol/L，用时取储备液稀释 10 倍即可。

该液主要用于配制 Tris 缓冲生理盐水（TBS）、DAB 显色液。

5．Tris 缓冲生理盐水（TrisBuffered,Saline,TBS）

试剂：0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液 100ml

NaCl 3.5～9g(0.15mol/L)

重蒸水至 1000ml

配制：先以重蒸水少许溶解 NaCl, 再加 Tris-HCl 缓冲液，最后加重蒸水至 1000ml，充分摇匀使 Tris 终浓度为 0.05mol/L。

TBS 主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。

6．Tris-TBS(PBS)

试剂：Triton X-100 10ml(1%)或 3ml(0.3%)

0.5mol/L Tris 缓冲液（pH7.6）1000ml(50ml)或(0.2mol/ L 的 PB)

NaCl8.5～9g

重蒸水 至 1000ml

配制方法：先以重蒸水少许溶解 NaCl 后，加入 Triton X-100 及 Tris 缓冲液或（PB），最后加重蒸水至 1000ml，充分摇匀。

该液常用浓度为 1% 及 0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。

7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液

试剂：0.2mol/ L 二甲胂酸钠 500ml

0.1N HCl28ml

蒸馏水 至 1000ml

配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g, 加蒸馏水至 1000ml，使 0.2mol/ L 的二甲胂酸钠溶液；再取 HCl 1.7ml 加蒸馏水至 1000ml , 配成 0.1N，最后 取 0.2mol/ L 二甲胂酸钠溶液 500ml 及 0.1n HCl 28ml 混合，加蒸馏水至 1000ml，即为 0.1mol/ L 的二甲胂酸钠缓冲液。

8．几种常用的不同 pH 值缓冲液的配制表

（1）0.2mol/ L 磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）

pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.793.56.55.892.08.05.990.010.06.087.712.36.185.015.06.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851.049.06.945.055.07.039.061.07.133.067.07.228.072.07.323.067.07.419.081.07.516.084.07.613.087.07.710.589.57.88.591.57.97.093.08.05.394.7(2)0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.19～9.10）

pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L HCl(ml)H2O7.1910.018.012.07.3610.017.013.07.5410.016.014.07.6610.014.015.07.7710.014.016.07.8710.013.017.07.9610.012.018.08.0510.011.019.08.1410.010.020.08.2310.09.021.08.3210.08.022.08.4110.07.023.08.5110.06.024.08.6210.05.025.08.7410.04.026.08.9210.03.027.09.1010.02.028.0(3)0.2mol/ L 醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）

pH0.2mol/ L 醋酸（ml）0.2mol/ L 醋酸钠（ml）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2(4)0.1mol/ L 二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）

pH0.2mol/ L 二甲胂酸钠（ml）0.2N HCl(ml)蒸馏水5.02523.551.55.22522.552.55.42521.553.55.62519.655.55.82517.457.56.02514.860.36.22511.963.16.4259.265.86.6256.768.36.8254.770.37.0253.271.87.2252.172.97.4251.473.6注：HCI 可由 NCO3 代替，配制成二甲胂酸钠 -HNO3 缓冲液。

（5）0.2mol/ L 碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）

pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)9.24.046.09.37.542.59.49.540.59.513.037.09.616.034.09.719.530.59.822.028.09.925.025.010.027.522.510.130.020.010.233.017.010.335.514.510.438.511.510.540.59.510.642.57.510.745.05.0三、显色液免疫细胞化学中，由于抗原 - 抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：

1．DAB（Diaminobenzidine）显色液

DAB 即 3，3- 二氨基苯联胺

试剂：DAB（常用四盐酸盐）50mg

0.05mol/L TB 100ml

30% H2O2 30～40μl

配制方法：先以少量 0.05mol/L(pH7.6)的 TB 溶解 DAB，然后加入余量 TB，充分摇匀，使 DAB 终浓度为 0.05%, 过滤后显色前加入 30% 的 H2O230～40μl，使其终浓度为 0.01%。

DAB 显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP 法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经 OsO4 处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB 溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB 浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外 DAB 有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触 DAB 的实验用品最好经洗液浸泡 24h 后使用。

2．4- 氯 -1- 萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液

配方 1：4-Cl-1- 萘酚 100mg

纯乙醇 10ml

0.05mol/L TB(pH7.6)190ml

30% H2O2 10μl(0.003%)

配制方法：先将 4 -Cl-1- 萘酚溶解于乙醇中，然后加入 Tb 19ml，用前加入 30% H2O2 使其终浓度为 0.005%，切片显色时间通常为 5～20min。

配方 2：4-Cl-1- 萘酚

N- 二甲基甲酰胺（DMF）

0.05mol/L TB(pH7.6)

30% H2O2

配制方法：先将 4 -Cl-1- 萘酚加入 DMF 中，加热溶解使呈乳白色，再加入 TB，乳白色变为絮状，在 7.5℃加热 5min 后加入 H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于 50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为 5min 左右。

4-Cl-1- 萘酚的终产物显示蓝色。

多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但 Larsson 等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解 4 -Cl-1- 萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。

3．3- 氨基 -9- 乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液

试剂：AEC 20mg

二甲基甲酰胺（DMF）2.5ml

0.05mol/ L 醋酸缓冲液（pH5.5）50ml

30%H2O225ml

配制方法：先将 AEC 溶于 DMF 中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入 30%H2O2。切片显色时间为 5～20min。

该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

4．TMB 显色液

试剂：TMB

HCl

亚硝基铁氰化钾

无水酒精

配制方法：

（1）醋酸盐缓冲液：取 1.0mol/ L 的 HCl 190ml 加入 1.0mol/ L 的醋酸钠 400ml 中混合，再加蒸馏水稀释至 1000ml，用醋酸或 NaOH 将 pH 调至 3.3。

（2）A 液：取上述缓冲液 5ml，溶解 100mg 亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水 92.5ml 混合。

（3）B 液：称取 5mg TMB 加入 2.5ml 无水酒精中，可加热至 37℃～40℃直到 TMB 完全溶解。

（4）孵育液：放入标本前数秒，取 2.5ml B 液及 97.5ml A 溶于试管中充分混合。（液体在 20min 内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为 0.005% 的 H2O2。

（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或 PBS）中漂洗数次（每次约 10～15min）后放入未加 H2O2 的孵育液中作用 20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入 H2O2（每 100ml 孵育液中加 0.3% 的 H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液 20min 左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共 30min 左右）。在 0～4℃条件下可在漂洗液放置 4h 直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在 1% 的中性红中负染 2～3min，也可在 1% 派诺宁（pH3.3～3.5）中负染 5min 后贴片、脱水、封片。

TMB 即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的 HRP 反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在 HRP 活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得 TMB 成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得 HRP 的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB 的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而 DAB 则被限制在其内），故 TMB 反应的检测阈较低。由于上述优点，目前 TMB 常用于光镜及超微结构水平的 HRP 及 HRP-WGA 神经投射的研究。需要注意的是：TMB 显色液中的 A 液和 B 液应在 2h 内新鲜配制。另外，TMB 是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

5．NBT 显色液

试剂 A 液：5%NBT：称取 0.5gNBT 溶于 10ml 70% 的 DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于 4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。

B 液：5% BCIP：称取 BCIp 0.5g 溶于 10ml 100% 的 DMF 内，混匀。4℃或分装存于 -20℃，用前恢复至室温。

C．显色液：取 A 液 40μl，加入到盛有 10ml 的 0.1mol/lTris-HCl(pH9.5, 钤 0.1mol/L NaCl、5mmol/LMgCl2)管内，充分混匀；再加入 B 液 40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。

NBT 即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818, 为深蓝色无定形微溶物质。BCIP 即 5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 - 磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT 被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。

四、粘附剂在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。

1．铬矾明胶液

试剂：铬矾 0.5g

明胶（Gelatine）5g

H2O ~1000ml

方法：在 1000ml 的烧杯或烧瓶中，以 500～800ml H2O 加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在 70℃。如有明显残渣，过滤后使用。

2．

试剂：40% 甲醛 2.5ml

明胶 0.5g

蒸馏水 至 100ml

配制方法：用少许蒸馏水（约 80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至 100ml 混匀即可。

3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）

试剂：多聚赖氧酸 5g

蒸馏水 ~1000ml

配制方法：称取 PLL，溶于 H2O，充分混合即可，此液浓度为 0.5%，可适当稀释配成 0.01～0.5% 浓度。4℃保存，也可 -20℃备用。PLL 可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释 10～50 倍。

4．Vectabond 试剂该试剂 是 Vector 公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成 350ml 工作液（用丙酮配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：

干净载玻片→丙酮 5min→Vectabond 试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml 丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入 Vectabond 试剂 1～2 次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。

注意：避免污染（尘埃等）。

综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。

五、封固剂1．甘油 -TBS 及甘油 -PBS

配制方法：按比例将甘油和 TBS（或 PBS）充分混合后，置 4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。

2．甘油 - 明胶（冻）

试剂：明胶 10g

甘油 12ml

蒸馏水 100ml

香草酚 少许

配制方法：称取 1g 明胶于温热（约 40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入 12ml 甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。

3．液体石蜡 液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。

4．DPX

试剂：Distrene 10g

酸二丁 5ml

二甲苯 35ml

DPX 为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX 现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。

六、酶消化液1．0.1% 胰蛋白酶

试剂：胰蛋白酶 0.1gm

0.1% 氯化钙（pH7.8）100ml

配制方法：先配制 0.1% 的 CaCl2, 用 0.1mol/ L 的 NaOH 将其 pH 调至 7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至 37℃（载有标本的玻片也在 TBS 中予热至同样样温度）。该消化液时间约为 5～30min。

2．0.4% 胃蛋白酶

试剂：胃蛋白酶 400mg

0.1N HCl 100ml

配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在 37℃约为 30min。

3．0.06% Pronase

试剂：Pronase 0.06g

0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml

配制方法：同前。

在免疫细胞化学染色中，有时经 Formalin 过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。

七、其它1．蔗糖溶液 免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为 5%～30%。一般光镜研究，仅用 20% 蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20% 及 20% 蔗糖 -5% 甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。

（1）20% 蔗糖液：

试剂：蔗糖 20g

0.1mol/L PB(pH7.5) 至 100ml

配制方法：先以少许 0.1mol/ L 的 PB 溶解蔗糖，再加 0.1mol/l PB 至 100ml 充分混合，置 4℃冰箱保存。

该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在 20% 蔗糖液中过夜。都能达到要求。

（2）20% 蔗糖 -5% 甘油：

试剂：蔗糖 20g

甘油 5ml

0.1mol/L PB 至 100ml(约 95ml)

配制方法：先用少许 PB 溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足 PB 至 100ml，于 4℃保存备用。

该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为 2h 左右）。

蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较为方便。若无试剂蔗糖（Sucrose）也可用普通蔗糖（Cane Sugar）。配制好的蔗糖溶液，放置时间超过一个月时，应重新配制。

2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)免疫细胞化学中，Triton X-100 常用浓度为 1% 和 0.3%，但通常是先配制成 30% 的 Triton X-100 储备液，临用时稀释至所需浓度。

30% Triton X-100 的配制：

试剂：Triton X-100 28.2ml

0.1mol/L PBS(pH7.3)或 0.05mol/l TBS(pH7.4)72.8ml

配制方法：取 Triton X-100 及 PBS（或 TBS）混合，置 37℃～40℃水浴中 2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。

Triton X-100 是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为 646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1% 的 Triton X-100 常用于漂洗组织标本，0.3% 的 Triton X-100 则常用于稀释血清，配制 BSA 等。

3．甲醇 -H2O2 液

试剂：纯甲醇 10ml

30% H2O2 0.1ml

配制方法：吸取 30% 的 H2O20.1ml，加入 100ml 纯甲醇中，充分混匀即可，使 H2O2 终浓度为 0.3%（也有的用 0.03%、0.5% 等）。

甲醇 -H2O2 处理组织标本，具有封闭内源性过氧化物酶活性的作用，但其具体机制至今仍不详。通常处理时间在室温约为 5～30min。注意，用 H2O2 处理标本，对某些抗原的抗原性有影响，故建议在使用新的抗血清或抗原时，最好同时设立非处理对照组。

4．常用生理盐液

常用生理盐液的成分（g/1000ml）

KerbsKerbs-Hen-selsitLockeTyrodeRingerNaCl5.546.929.008.006.50KCl0.360.350.420.200.14MgCl2–––0.10–MgSO4·7H2O0.290.29–––CaCl20.280.280.240.200.12NaH2PO4–––0.050.01KH2PO40.160.16–––NaHCO32.102.100.151.000.20Glucose2.10–1.001.002.00Pyruvic acid0.43––––Fumaric acid0.62––––Glutamic acid0.72––––配制方法：精确称取各种药品（如上表），加入 500ml 重蒸水中，待完全溶解后，补足重蒸水至 1000ml，充分混匀即可。

在免疫细胞化学实验中，某些物质不宜经固定剂作用或经固定剂作用后仍易丢失，而需浸泡在生理盐液中。这些生理盐液的成分与正常哺乳动物血清的成分相似，能使组织离体后能处于尽量接近生理状态时的环境。Glucose 通常是在用前临时加入。有的（如 Kerbs 液）在使用时通常需通入含 CO2/O2 为 2.5～5%/97.5～95% 的气体。这些生理盐液中的 CO2 和二碳酸盐，主要起缓冲作用，Glucose 主要是提供离体组织有限的代谢所需的能量。

附录二 原位杂交组织化学常用试剂及处理一、杂交前准备（一）DEPC 水是经 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水。

DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。方法是：取市售 DEPc 1ml，加入 1L 待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解 DEPC（DEPC 分解为 CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入 DEPC，终浓度一般为 0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用 DEPC 处理，或用 DEPC 水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需 DEPC 水洗涤。

注意：①DEPC 是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有 Tris 缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC。

（二）载玻片的处理

组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：

（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗 2～3 次，置 160℃以上烤箱中烧烤 4h 以上，或经 15 磅高压灭菌 20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。

（2）HCl 处理法

（三）硅化

【方法1】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于 0.1mol/ L 的 HCI 中煮 20min, 等其冷却后, 倒掉盐酸。

（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。

（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。

（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的 petri 氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。

（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于 180℃烘烤 4h 过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。

附：2%DMDC

配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。

用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。

【方法 2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约 1m 二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约 5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于 250℃以上烘烤 4h 以上，最好过夜。冷却后备用。

本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于 60℃烧干。

【方法 3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法

【方法 4】

（1）49ml 氯仿与 1mg 二甲二氯硅浣（DMDC）配液；

（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡 5min 后用乙醇或重蒸水冲洗；

（3）玻璃器皿使用前位于 180℃以上烘烤 2h 以上，塑料器皿应于 60℃烘烤过夜。

注意：DMDC 有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。

（四）载片的包被（粘贴）

1．沾附剂

（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)

储备液（0～5%）

按上述剂量充分混合，即为浓度为 5mg/ml(0.5%)的 PLL 液。常分装成 1ml 的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。

工作液（0.01%）：

充分混合，静止待气泡消失。

（2）明胶液

配法：先称取明胶溶于 500～800ml DEPC 水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在 60℃左右，效果最佳。方法同 PLL 包被玻片。

2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）

（1）将事先准备好的经 160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在 0.05%（也有用 0.1%）的 PLL 液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温 1 月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。

（2）多聚赖氨酸 1mg 溶于 10ml 灭菌的去离子水或 1mmol/ L 的 Tris-HCl 缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。

（3）将 PLL 工作液滴至盖玻片上 5μl/ 片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上 PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有 PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。

多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于 4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。

（4）Vectabond 粘附剂

该试剂是 Vector 公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而 Vectabond 试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装 7ml 可配成 350ml 工作液使用。操作程序：

标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond 试剂工作液（5min）→dH2O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。

注意：制备和保存过程中避免污染。

经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。

（五）硅鱼精子 DNA 的制备

（1）在 50ml 灭菌聚乙烯管中加入 1g 鲑精 DNA，加入 15ml DEPC 水使其浸泡 5min 至 2h；

（2）加入 2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA 形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；

（3）加入 5.0ml 2mol/ L 的 NaOH。摇动小管使 DNA 悬浮、溶解，将小管置 50℃15min 助溶；

（4）用 DEPC 水将混合物稀释至 175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；

（5）加入 20ml/l 1mol/ L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）；

（6）用 2mol/ L 的 HCl 滴定至 DNA 溶解 pH 为 7.0～7.5；

（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm 测定溶液的 OD 值，方法是：取 20μl DNA 液混合于 980μl 水中，混匀后测定，吸收值乘以 50 即为 DNA 浓度（μg/ml）；

（8）制备好的 DNA 液储于 -20℃备用，用前取出冻融后煮沸。

二、关于探针的标记（一）cRNA 探针的同位素标记

1．标记液（转录标记）

2．转录缓冲液

※：用地高辛或生物素标记时，用 UTP 替代。

3．标记终止液

4．标记探针水解液

先用 dH2 O 悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于 60℃条件下反应。

5．探针水解时间

注：LO-探针初始长度（kb）

Lf-探针的终长度（kb）

K-0.11kb/min

6．探针水解终止液

每次加入充分混合，临用前配。

7．探针沉淀液

每次加入，充分混合，新鲜配制。

（二）寡聚核苷酸 3’端标记（cRNA 探针）

1．标记反应液

2．终止液：0.2mol/L EDTA

3. 探针沉淀液

（三）cRNA 探针非同位素标记（地高辛及生物素）

1．标记液

△：生物素标记时为 10mmol/ L 的生物素 -11-UTP

※：为检测标记率而加。

2．转录标记终止液

（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法

（2）生物素标记终止液：

（四）DNA 探针标记常用试剂的配制

（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4 含 50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ- 巯基乙醇、1mg/ml BSA。

（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

（3）DNaseⅠ: 干粉状 DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于 20mmol/l Tris-HCl, pH7.5 中（1mg/ml）,10μl 分装，-20℃保存一年。

（4）10×DNA 聚合酶Ⅰ（Klenow 片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg-Cl2;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/LDTT; 1.0mmol/ L 亚精胺。

（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/Lβ- 巯基乙醇；500μg/ml BSA。

（7）1×加尾缓冲液：100mmol/ L 二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl20.2mmol/L DTT。

（8）1mol/L MgCl2:MgCl247.60g 溶于 500ml 水中，100ml 分装，高压灭菌，室温保存。

（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g 溶于 400ml 水中，调 pH 至 8.0，加水至 500ml，100ml 分装，高压灭菌，室温保存。

（10）4mol/ L 醋酸钠：取无水醋酸钠 82g 溶于 200ml 水中，用醋酸调 pH 至 6.5，加水至 250ml，高压灭菌，或 0.45μm 膜过滤，室温保存。

（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于 50ml 水中，加水至 100ml，分装后室温保存。

（12）20×SSC：取 NaCl 175.3g; 柠檬酸钠 88.2g; 加水至 1000ml，用 10mol/l NaOH 调 pH 至 7.0；高压灭菌，室温保存。

（13）无菌水：100ml 去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。

（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/lDTT;10mmol/ L 亚精胺（非必需）。

（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。

（16）TE 缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/ L 贮存液)，1.0mmol/l ED-TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至 100ml，室温保存。

（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g 溶于 850ml，加浓 HCl 75ml , 边加边缓慢搅动，至 pH7.4, 于加水至 1000ml。

（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT 溶于 20ml 水中，分装，于 -20℃贮存。

（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入 300ml 水，加入 93.5g EDTA-Na2·2H2O, 充分混匀，加 10mol/l NaOH 调 pH 至 8.0, 加水至 500ml。

（20）10mol/L NaOH：200g NaOH 溶于 450ml 水中，混匀，再加水至 500ml。

（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl, 加水至 1000ml。

（22）1mol/L HCl：加 86.2ml 浓盐酸至 913.8ml 水中。

（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O, 溶于 1000ml 水中, 高压灭菌, 室温保存。

三、固定剂进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织 / 细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。

1．4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）

配法：称取 40g PFA 溶于装有 500ml DEPC 水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至 60～65℃，使成乳白色悬液。用 1.0mol/ L 的 NaOH 值至 7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约 500ml 2×PBS※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下 pH，过滤后定容至 1000ml，室温或 4℃保存备用。

注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为 60～65℃，否则，PFA 降解失效；③配制好的 PFA 虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。

附：固定液用 PBS 的配制：

配法：按上述比例称取试剂，溶于 DEPC 水（也可用蒸馏水加 DEPC）500～800ml 中，过滤后，加水定容至 1000ml，高压灭菌。通常配制成 10×PBS 的储备液，2×PBS 和 1×PBS 可用 DEPC 水稀释获得。

除用 DEPC 水配制 PFA 外，也有用灭菌蒸馏水或经 DEPC 处理的 0.01～0.1mol/ L 的 PBS 配制的，方法及注意事项同上。

4% PFA 是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的 RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定 4～12h，载片固定时间在 10～15min 以内，RNA 含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

2．甲醛

①10% 甲醛（Formaldehyde,FA）

量取二者充分混合而可。较适于检测 RNA 的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。

②10% 福尔马林试剂：

较适于固定细胞。

③10% 中性福尔马林

市售甲醛 100ml

Na2HPO44g

NaH2PO46.5g

DEPC 水 ～1000ml

常用于石蜡样品切片的固定。

10% 的甲醛由于有促进 DNA 双链分子交联的作用，干扰 DNA 变性，故不适于 DNA 杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含 50% 甲酰胺的杂交液使 DNA 变性解链而解决。这类固定液在 DNA/RNA 杂交中有较好的效果。

3．4% 戊二醛 效果较 40% 差。

4．0.1% 戊二醛 常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测 DNA 的原位组织杂交方法。

5．乙醇 / 醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按 3：1 的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测 DNA 时。

乙醇 / 醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但 RNA 保留较差，可本底很低，即背景染色淡。

6．甲醇 / 醋酸（3：1）用前按体积比 3：1 比例充分混合即可。

7．甲醇 / 丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。

8．4% 多聚甲醇-0.5%～1% 戊二醛溶液在 pH7.4 磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。

四、LB 培养基（一）液体 LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）

配制：取一 1000ml 的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加 H 2 O 约 500～800ml 搅拌使其溶解完全。用 5N 的 NaOH 调 pH 至 7.0, 加入 H 2 O 定容至 1000ml。15 磅高压灭 20min。

（二）琼脂糖平板培养基

细菌培养用琼脂（或琼脂糖）15g

液体培养基（如 LB）～1000ml

按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如 LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15 磅高压灭菌 20min。

五、小量质粒提取主要液体1．溶液Ⅰ

2．溶液Ⅱ

3．溶液Ⅲ（3mol/ L 醋酸钠）

加热溶解后，再用冰醋酸（约 40ml）调 pH 至 4.8，补足 H 2 O 至 200ml。

六、杂交前处理1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K）蛋白酶 K 主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约 0.025mg/ml）。配制方法：

精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。

（2）工作液（临用前配）：

取储备液（1mg/ml）按 1：40 稀释，充分混合，即得约含 Pro.K 为 25mg/ml 的工作液。

（3）关于 P - K 缓冲液的配制：

称取上述试剂，充分混合即可。

②1mol/L 的 Tris-HCl(pH8.0)：

先将 Tris 于 800ml ddH2 O 中溶解，用 HCl 将 pH 调至 8.0,ddH2 O 定溶于 1000ml，高压灭菌，室温备用即可。

③0.5mol/ L 的 EDTA：

称取 EDTA 溶于约 600ml ddH2 O 中，常需 60℃持续搅拌以助溶，滴加 NaOH 至 pH 接近 8.0 时，EDTA 才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH 调 pH 至 8.0,ddH2 O 定溶至 1000ml，高压灭菌，室温备用。

2．甘氨酸

（1）1mol/ L 甘氨酸：

称取甘氨酸 75g 溶于 ddH2 O 或 DEPC 水中，最后补足 ddH2 O 定容至 1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。

（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：

将二者按 1：10 比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

甘氨酸有终止蛋白酶 K 作用的作用，以防过度消化。

3．0.25% 醋酸 -0.25% 醋酸酐

配制：按上述配方，先以少许 DEPC 水溶解 NaCl，然后加入三乙醇胺及浓 HCl。DEPC 水定容至约 1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓 HCl 溅出，最好在通风条件下进行。

生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。

4．RNA 酶溶液

取 RNA 酶 A 溶解于 100ml DEPC 水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。

临用前，取 RNA 酶 A 储备液，用 2×SSC 溶解配成工作液（0.01mg/ml）.

5.0.2%

取 2ml Triton X-100 加入 998ml PBS 中，充分振荡使其充分混合。

七、杂交用液1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）

通常配成 10×，20×，50×的储备液，如下：

配制：先称取上述两种试剂，溶于约 800ml ddH2 O 中，滴加 10N 的 NaOH，将 pH 值调至 7.0，补足 ddH2 O 至 1000ml，加入终浓度为 0.1%～0.2% 的 DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。

该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用 5×的 SSC 以保持一定湿度。

2．Denhardt’s 液

通常配成 10×，50×或 100×的储备液

配制：称取上述试剂，溶于 800ml 左右灭菌 ddH2 O 中，定容至 1000ml 后，过滤后于 -20℃保存备用。

该液用于配制杂交液及予杂交液等。

3．杂交液及予杂交液

※：临用前加；△予杂交液不加

配制：先以去离子甲酰胺与 SSC 于室温混合，加入硫酸葡聚糖于 50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于 4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。

变性被打断的无关 DNA（常为鲑精 DNA 或鲱精 DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。

配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至 50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常 RNA 探针分子浓度为 0.5～2μg/ml，DNA 探针浓度为 1μg/ml, 此外，如使用35 S 标记的探针，还需加入终浓度为 100mmol/ L 的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。

八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。

该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。

该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用 2×SSC，10%（0.1%）SDS 洗脱。

主要是洗去残留的 RNA，降低背景。用于以 RNA 为探针的原位杂交方法中。

4．Dig 标记探针杂交后处理液

用 ddH2 O 溶液并定容至 1000ml。

用 ddH2 O 溶解并定容至 1000ml。

配制同上。

左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。

九、原位杂交信号显示目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。

1．A- B 显影液

称取上述试剂，按配方分别溶于 50ml ddH2 O 中，于显影前，在室温将两者（A 液及 B 液）按 1：1 混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应 5～15min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的 AB 显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB 显影液要求临用前配制，在显影时才将 AB 二液混合。否则，A 液过久会产生黄色沉淀，增加背景。

AB 液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。

2．DAB-H2 O 显色液

配制方法见附录一。

该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。

3．NBT-BCIP 显色液

配制方法，详见附录一。

该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。

4．Kodak D-19 显影液

配制：先将 500ml 水中加温 50℃，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至 1000ml 充分混合，室温或 4℃避光保存。最好包上纸。

该液用于放射自显影时的显影。

5．Kodak F- 5 定影液（酸性坚膜定影液）

※：28% 醋酸为 3 份冰醋酸和 8 份水混合液。

配制：同 Kodak D-19 显影液。

附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制一、国内实验室应用试剂配制（一）培养液

（1）RPMI1640 培养液：称取 RPMI 培养基 9.8g，碳酸氢钠 1.9g、青霉素 100u/ml，加双蒸水至 1000ml，调节 pH7.2～7.4 无菌过滤冻存备用。

（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。

（3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。

（4）pH 调整液：5%NaHCO3溶液高压灭菌（8 磅 15min），0.1N 稀盐酸液 100ml。

（5）秋水仙素：10mg/ml 无菌过滤高压灭菌（8 磅 10min）。

（6）磷酸缓冲液：pH7.4。

磷酸氢二钠 28.8g(H2O)、磷酸二氢钾 2.67g(无水)，溶于 1000ml 双蒸水中，加肝素，终浓度为 100u/ml。

（7）Giemsa 染色液：

Giemsa 粉剂 1g

甘油 66ml

在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温 2h，冷却后加入甲醇 66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用 pH7.4 磷酸缓冲液稀释 10 倍，随配随用。

（二）固定液

（1）甲酸：冰乙酸 3：1 混合即用。

（2）PBS 缓冲液配制：

NaCl 16gNa2HPO4(12H2O)5.65g

KCl 0.4g KH2PO40.4g

加双蒸水至 1000ml pH7.0。

取 5% 胰酶（生理盐水配制）1ml 加入 50ml PBS 液中（最终浓度为 0.025%），4℃冰箱待用。

二、细胞培养（Bhatl B 和 McGee JOD,1990）1．完全培养基

RPMI76.0ml

胎牛血清 20.0ml

植物凝集素 2.0ml

抗生素 / 抗菌素溶液（100×）1.0ml

L- 谷氨酰胺（100×）1.0ml

2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’- 溴 -2- 脱氧尿嘧啶)溶解 10mg/ml BudR 于 dH2 O 中，0.2μm 滤膜过滤除菌，分装后 -20℃储存，BudR 要在柔光（弱光）下操作。

3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd）按 250μg/ml 溶解于 dH2 O 中，过滤后分装储存于 -20℃。

4．Colcemid(Sigma)5.0μg/ml 溶于 dH2 O 中，过滤后分装储存于 -20℃。

5．KCl（0.75mol/L）溶解 560mg 于 100ml dH2 O 中，新鲜配制 37℃保存。

6．固定剂甲醇冰醋酸按 3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。

7．缺口平移试剂盒（Amersham 和 BRL 公司）

8．生物素 7 -dATP(BRL)

9. 糖原（BRL）

10．RNA 酶 A（Sigma）

（1）储备液

称取 RNA 酶 A 1g 溶于 100ml 醋酸钠中，置沸水中煮 10min，分装后储于 -20℃。

（2）工作液

用储备液按 1：100 稀释。

11．20×SSC

NaCl 175g

柠檬酸三钠 88g

dH2O1000ml

固定试剂溶解后，dH2 O 定容至 1000ml，调 pH 至 7.4，高压灭菌。

12．杂交液（高深度，HMmix）

去离子甲酰胺 6.0ml

100×Denhardt’s 液 1.0ml

50% 硫酸葡聚糖 2.0ml

1% 人或鲑精 DNA※20×SSC

※：临用前加入，终浓度为 100～200μg/ml。

该液为高浓度杂交液，存于 4℃。

13．PBT 液

BSA 5%

TristonX-100/(PBS) 0.1%

注：BSA 液用前应用 Whatman 3mm 滤纸过滤。

14．兔抗生物素（α- 生物素）单克隆抗体

用 PBT 液 1：100 稀释。

该单抗现可从英国 Dako 公司购得。

15．金（10～20nm）标羊抗兔二抗

用 PBT 液 1：50 稀释。

16．银溶液（Janesen）

17.Hoedst33258（Sigma）

储备液（100×）

Hoedst 染料 5mg

甲醇 10ml

工作液：用 2×SSC 1：100 稀释储备液。

附录四 实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据1．

化合物分子量λmax(pH7.0) 1 摩尔溶液（pH7.0）中 λmax 时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712．常用核酸的长度与分子量

核酸核苷酸数分子量λDNA48502（双链环状）3.0×107pBR3224363（双链）2.8×10628SrRNA48001.6×10623SrRNA37001.2×10618SrRNA19006.1×10519SrRNA17005.5×1055SrRNA1203.6×104tRNA（大肠杆菌）752.5×1043．常用核酸蛋白换算数据

（1）重量换算

1μg=10-6g 1pg=10-12g

1ng=10-9g 1fg=10-15g

（2）分光光度换算：

1A260双链 DNA=50μg/ml

1A260单链 DNA=30μg/ml

1A260单链 RNA=40μg/ml

（3）DNA 摩尔换算：

1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol 末端

1μg pBR322 DNA=0.36pmol

1pmol 1000bp DNA=0.66μg

1pmol pBR322=2.8μg

1kb 双链 DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿

1kb 单链 DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿

1kb 单链 RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿

（4）蛋白摩尔换算：

100pmol 分子量 100，000 蛋白质 =10μg

100pmol 分子量 50，000 蛋白质 =5μg

100pmol 分子量 10，000 蛋白质 =1μg

氨基酸的平均分子量 =126.7 道尔顿

（5）蛋白质 /DNA 换算：

1kb DNA=333 个氨基酸编码容量 =3.7×104MW 蛋白质

10，000MW 蛋白质 =270bp DNA

30，000MW 蛋白质 =810bp DNA

50，000MW 蛋白质 =1.35kb

100，000MW 蛋白质 =2.7kb DNA

4．常用蛋白质分子量标准参照物

（1）高分子量标准参照（2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶 B 97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500β- 半乳糖甘酶 B 116，000谷氨酶脱氢酶55，000抑制剂磷酸化酶 B 97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶 `57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制剂肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶14，4005．常用 DNA 分子量标准参照 物

λDNA/HindⅢλDNA/EcoRⅠλ/HindⅢ+EcoRⅠpBR322/HaeⅢ23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125续上表

pBR322/HinfⅠφχ174/HinfⅠφχ174/Hae Ⅲφχ174/TapⅠ16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用缓冲液1．分子克隆常用缓冲液

2．磷酸缓冲液

（1）25℃下 0.1mol/ L 磷酸钾缓冲液的配制※

pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2（2）25℃下 0.1mol/ L 磷酸钠缓冲液的配制※

pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8※: 用蒸馏水将混合的两种 1mol/ L 贮存液稀释至 1000ml，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH 值：

pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

在此，pK’=6.86(25℃)。

3．电泳缓冲液

测序凝胶加样缓冲液

98% 去离子甲酰胺

10mol/L EDTA(pH8.0)

0.025% 二甲苯青 FF

0.025% 溴酚蓝

甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与 Dowex XG8混合床树脂共同搅拌 1 小时进行去离子处理，并用 Whatman 1 号滤纸过滤 2 次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于 -70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris- 乙酸（TAE）1×：0.04mol/L Tris- 乙酸50×：242gTris 碱0.001mol/L EDTA57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris- 磷酸（TPE）1×:0.09mol/L Tris- 磷酸10×:10gTris 碱0.002mol/L EDTA15.5ml85% 磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris- 硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/L Tris- 硼酸5×：54gTris 碱0.001mol/L EDTA27.5 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1×:50mmol/L NaOH1×:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris- 甘氨酸c1×:25mmol/L Tris5×:15.1gTris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）0.1% SDS50ml 10% SDS(电泳级)说明：

①TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存 5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

以片都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但 0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液。

进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1×TBE 以提供足够的缓冲容量。

②碱性电泳缓冲液应现用现配。

③Tris- 甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2×SDS 凝胶加样缓冲液：

100mmol/L Tris·HCl(6.8)

200mmol/ L 二硫苏糖醇（DTT）

4%SDS（电泳级）

0.2% 溴酚蓝

20% 甘油

不含 DTT 的 2×SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/ L 贮存液现加于上述缓冲液中。

4．凝胶加样缓冲液

缓冲液类型6×缓冲液贮存温度Ⅰ0.25% 溴酚蓝4℃0.25% 二甲苯青 FF40%（W/V）蔗糖水溶液Ⅱ0.25 溴酚蓝室温0.25% 二甲苯青 FF15% 聚蔗糖(Ficoll400)Ⅲ0.25% 溴酚蓝4℃0.25% 二甲苯青 FF30% 甘油水溶液Ⅳ0.25% 溴酚蓝4℃40%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTAⅤ18% 聚蔗糖(Ficoll400)4℃0.15% 溴甲酚绿0.25% 二甲苯青 FF使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以 0.5×TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为 0.5%～1.4% 的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

5．各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制

各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制所需 pH 值（25℃）0.1mol/L HCl 的体积7．145．77．244．77．343．47．442．07．540．37．638．57．736．67．834．57．932．08．029．28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定 pH 值的 0.05mol/LTris 缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml

（2）温度对 50mmol/LTris·HCl 液 pH 值的影响

4℃25℃37℃8．17．57．28．27．67．38．37．77．48．47．87．58．57．97．68．68．07．78．78．17．88．88．27．98．98．38．09．08．48．19．18．58．29．28．68．39．38．78．49．48．88．5（6）常用缓冲液的 pKa 值

缓冲液分子量pKa 值缓冲范围Trisa12.18.087.1～7.9HEPESb283.37.477.2～8.2MPOSc209.37.156.6～7.8PIPESd304.36.766.2～7.3MESe195.26.095.4～6.8a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2- 羟乙基哌嗪 -N’-2- 乙磷酸；c：3-（N- 吗啉代）丙磺酸；d：N，N’- 双（2- 乙磺酸）哌嗪；e：2-（N- 吗啉代）乙磺酸。

7．温度对常用缓冲液 pH 的影响

缓冲体系pKa(20℃)△pKa/10℃Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1．溶菌酶

用水配制成 50mg/ml 的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于 -20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。

2．蛋白水解酶 类

贮存液贮存温度反应浓度反应缓冲液温度预处理0.01mol/L Tris(pH7.8)链霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37℃自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶 K c20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/ml0.005mol/L EDTA37～56℃无须预处理0.5% SDSa：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomycesgriseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

b：自消化可消除 DNA 酶和 RNA 酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于 10mmol./lTris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl 中，配成 20mg/ml 浓度，于 37℃温育 1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存 -20℃。

c：蛋白酶 K 是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个 Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去 Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失 80% 左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶 K 消化过程中通常加入 EDTA（以抑制依赖于 Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶 K 具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有 1mmol/l Ca2+而不含 EDTA 的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入 EGT（pH8.0）至终浓度为 2mmol/L, 以鳌合 Ca2+。

3．无 DNA 酶的 RNA 酶

将胰 RNA 酶（RNA 酶 A）溶于 10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl 中，配成 10mg/ml 的浓度，于 100℃加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于 -20℃。

四、常用抗生素溶液抗生素贮存液a工作浓度浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml羧苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-20℃25μg/ml170μg/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml链霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml四环素b5mg/ml(溶于乙醇)-20℃10μg/ml50μg/mla：以水为溶剂的抗生素贮存液通过 0.22μm 滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如 LB 培养基）。

五、常用贮存液的配制1．30% 丙烯酰胺溶液

【配制方法】

将 29g 丙烯酰胺和 1g N，N’- 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中。加热至 37℃溶解之，补加水至终体积为 100ml。用 Nalgene 滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的 pH 值应不大于 7.0，置棕色瓶中保存于室温。

【注意】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约 0.2 体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用 Whatman 1 号滤纸过滤以纯化之。

在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

2．40% 丙烯酰胺

【配制方法】

把 380g 丙烯酰胺（DNA 测序级）和 20g N，N’- 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 600ml 的蒸馏水中。继续按上述配制 30% 丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为 1L。

【注意】

见上述配制 30% 丙烯酰胺的说明，40% 丙烯酰胺溶液用于 DNA 序列测定。

3．放线菌素 D 溶液

【配制方法】

把 20mg 放线菌素 D 溶解于 4ml 100% 乙醇中，1：10 稀释贮存液，用 100% 乙醇作空白对照读取 OD440值。放线菌素 D（分子量为 1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为 21，900，故而 1mg/ml 的放线菌素 D 溶液在 440nm 处的吸光值为 0.182，放线菌素 D 的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于 -20℃。

【注意】

放线菌素 D 是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素 D 制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在 440nm 波长处的光吸收确定放线菌素 D 的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4．0.1mol/ L 腺苷三磷酸（ATP）溶液

【配制方法】

在 0.8ml 水中溶解 60mgATP, 用 0.1mol/L NaOH 调至 pH 值至 7.0，用蒸馏水定容 1ml，分装成小份保存于 -70℃

5．10mol/ L 乙酸酰溶液

【配制方法】

把 770g 乙酸酰溶解于 800ml 水中，加水定容至 1L 后过滤除菌。

6．10% 过硫酸铵溶液

【配制方法】

把 1g 过硫酸铵溶解于终量为 10ml 的水溶液中，该溶液可在 4℃保存数周。

7．BCIP 溶液

【配制方法】

把 0.5g 的 5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于 10ml 100% 的二甲基甲酰胺中，保存于 4℃

8．2×BES 缓冲盐溶液

【配制方法】

用总体积 90ml 的蒸馏水溶解 1.07g 盐溶液 BES[N，N- 双（2- 羟乙基）-2- 氨基乙磺酸]、1.6g NaCl 和 0.027g Na2HPO4，室温下用 HCl 调节 该溶液的 pH 值至 6.96、然后加入蒸馏水定容至 100ml，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成小份，保存于 -20℃。

9．1mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在 200ml 蒸馏水中溶解 54gCaCl2·6H2O，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 10ml 小份贮存于 -20℃。

【注意】

制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至 100ml，用 Nalgene 滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，然后骤冷至 0℃。

10．2.5mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在 20ml 蒸馏水中溶解 13.5gCaCl2·6H2O，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于 -20℃。

11．1mol/ L 二硫苏糖醇（DTT）溶液

【配制方法】

用 20ml 0.01mol/ L 乙酸钠溶液（pH5.2）溶解 3.09g DTT，过滤除菌后分装成 1ml 小份贮存于 -20℃。

【注意】

DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。

12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

【配制方法】

把每一种 dNTP 溶解于水至浓度各为 100mmol/ L 左右，用微量移液器吸取 0.05mol/l Tris 碱分别调节 每一 dNTP 溶液的 pH 值 7.0（用 pH 试纸检测），把中和后的每种 dNTP 溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种 dNTP 的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为 50mmol/ L 的 dNTP，分装成小份贮存于 -70℃。

碱基波长（nm）消化系数（ε）[L/（mol·cm）]A2591.54×104G2531.37×104C2719.10×103T2607.40×103比色杯光径为 1cm 时, 吸光度 =εM

13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液

【配制方法】

在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节 溶液的 pH 值至 8.0（约需 20g NaOH 颗粒）然后定容至 1L，分装后高压灭菌备用。

【注意】

EDTA 二钠盐需加入 NaOH 将溶液的 pH 值调至接近 8.0，才能完全溶解。

14．溴化乙锭（10mg/ml 溶液）

【配制方法】

在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

【注意】

小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

15．2×HEPES 缓冲盐溶液

【配制方法】

用总量为 90ml 的蒸馏水溶解 1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4·2H2O、0.2g 葡聚糖和 1gHEPES，用 0.5mol/lNaOH 调节 pH 值至 7.05，再用蒸馏水定容至 100ml。用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 5ml 小份，贮存于 -20℃。

16．IPTG 溶液

【配制方法】

IPTG 为异丙基硫代 -β-D- 半乳糖苷（分子量为 238.3），在 8ml 蒸馏水中溶解 2g IPTG 后，用蒸馏水定容至 10ml，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于 -20℃。

17．1mol/ L 乙酸镁溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 214.46g 四水乙酸镁，用水定容至 1L 过滤除菌。

18．1mol/L MgCl2溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 203.4gMgCl2·6H2O，用水定容至 1L，分装成小份并高压灭菌备用。

【注意】

MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如 100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。

19．β- 巯基乙醇（BME）溶液

【配制方法】

一般得到的是 14.4mol/ L 溶液，应装在棕色瓶中保存于 4℃。

【注意】

BME 或含有 BME 的溶液不能高压处理。

20．NBT 溶液

【配制方法】

把 0.5g 氯化氮蓝四唑溶解于 10ml 70% 的二甲基甲酰胺中，保存于 4℃。

21．酚 / 氯仿溶液

【配制方法】

把酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的 0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液层，保存于 4℃。

【注意】

酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

22．10mmol/ L 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液

【配制方法】

用异丙醇溶解 PMSF 成 1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于 -20℃。如有必要可配成浓度高达 17.4mg/ml 的贮存液（100mmol/L）。

【注意】

PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF 污染的衣物应予丢弃。

PMSF 在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF 在水溶液中的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快，且 25℃的失活速率高于 4℃。pH 值为 8.0 时，20μmmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min，这表明将 PMSF 溶液调节 为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液

【配制方法】

在 800ml 蒸馏水中溶解 8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4, 用 HCl 调节 溶液的 pH 值至 7.4 加水定容至 1L，在 15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌 20min。保存于室温。

24．1mol/ L 乙酸钾（pH7.5）溶液

【配制方法】

将 9.82g 乙酸钾溶解于 90ml 纯水中，用 2mol/ L 乙酸调节 pH 值至 7.5 后加入纯水定容到 1L，保存于 -20℃。

25．乙酸钾溶液（用于碱裂解）

【配制方法】

在 60ml 5mol/ L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水，即成钾浓度为 3mol/ L 而乙酸根浓度为 5mol/ L 的溶液。

26．3mol/ L 乙酸钠（pH5.2 和 pH7.0）溶液

【配制方法】

在 80ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH 值至 5.2 或用稀乙酸调节 pH 值至 7.0，加水定容到 1L，分装后高压灭菌。

27．5mol/L NaCl 溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 292.2gNaCl 加水定容至 1L，分装后高压灭菌。

28．10% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液

【配制方法】

在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS，加热至 68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节 溶液的 pH 值至 7.2，加水定容至 1L，分装备用。

【注意】

SDS 的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的 SDS，10%SDS 溶液无须灭菌。

29．20×SSC 溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 175.3gNaCl 和 88.2g 柠檬酸钠，加入数滴 10mol/l NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。

30．20×SSPE 溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 17.5gNaCl、27.6g NaH2PO4·H2 O 和 7.4g EDTA，用 NaOH 溶液调节 pH 值至 7.4（约需 6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至 1L，分装后高压灭菌。

31．100% 三氯乙酸溶液

【配制方法】

在装有 500g TCA 的瓶中加入 227ml 水，形成的溶液含有 100%（M/V）TCA。

32．1mol/L Tris 溶液

【配制方法】

在 800ml 水中溶解 121.91gTris 碱，加入浓 HCl 调节 pH 值至所需值。

pH HCl

7.4 70ml

7.6 60ml

8.0 42ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。

【注意】

如 1mol/ L 溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的 Tris。

尽管多种类型的电极均不能准确测量 Tris 溶液的 pH 值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。

Tris 溶液的 pH 值因温度而异，温度每升高 1℃，pH 值大约降低 0.03 个单位。例如：0.05mol/ L 的溶液在 5℃、25℃、和 37℃时的 pH 值分别为 9.5、8.9 和 8.6。

33．Tris 缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris）

【配制方法】

在 800ml 蒸馏水中溶解 8gNaCl、0.2g KCl 和 3g Tris 碱，加入 0.015g 酚并用 HCl 调至 pH 值至 7.4，用蒸馏水定容至 1L，分装后在 151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌 20min，于室温保存。

34．X-gal 溶液

【配制方法】

X-gal 为 5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β- D 半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解 X -gal 配制成的 20mg/ml 的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X -gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于 -20℃。X-gal 溶液无须过滤除菌。

杂交试验中用于降低背景的封闭剂

试剂用途Denhardt 试剂Northern 杂交使用 RNA 探针的杂交单拷贝序列的 Southern 杂交将 DNA 固定于尼龙膜上的杂交Denhardt 试剂通常配制 50×贮存液，过滤后保存于 -20℃。可将该贮存液 10 倍稀释于预杂交液（常为含有 0.5%SDS 和 100μg/ml 经变性被打断的鲑精 DNA 的 6×SSC 或 6×SSPE）中。50×Denhardt 液中含 5g 聚蔗糖（Ficoll,400 型，Pharmacia）、5g 聚乙烯吡咯烷酮和 5g 牛血清白蛋白（组分 V”Sigmal），加水至终体积为 500ml。BLOTTOGrunstein-Hogness 杂交Benton-Davis 杂交除单拷贝序列 Southern 杂交以外的所有 Southern 杂交斑点印迹1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）, 是含 5% 胶脂奶粉和 0.02% 叠氮钠的水溶液，应保存于 4℃。使用前可用预杂交液稀释 25 倍。BLOTTO 不应与高浓度的 SDS 并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入 NP-40 至终浓度为 1%。BLOTTO 不能用作 Northern 杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有 RNA 酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素Southern 杂交原位杂交肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用 4×SSPE 或 4×SSC 溶解配制成 50mg/ml 的浓度，保存于 4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为 500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为 50μg/ml。经变性并被打断的鲑精 DNAsouthern 和 Northern 杂交把鲑鱼精子 DNA（Sigma,Ⅲ, 盐钠）溶解于水配制成 10mg/ml 的浓度，必要时于室温磁力搅拌 2～4h 助溶。把溶液中 NaCl 的浓度调至 0.1mol/L，并用酚和酚 / 氯仿各抽提一次，回收水相。合 DNA 溶液快速通 17 号皮下注射针头 12 次，以剪切 DNA。加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇沉淀 DNA。离心回收 DNA 并重溶于水，配制成 10mg/ml 的浓度，测定溶液的 OD260值并计算出精确的 DNA 浓度，然后煮沸 10min，分装成小份保存于 -20℃。使用前置沸水浴中加热 5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有 100μg/ml 经变性并被打断的鲑鱼精子 DNA六、常用凝胶的技术参数1．葡聚糖凝胶的某些技术数 据

种类干颗粒直径（μ）分子量分级范围床体积毫升 / 克干分子筛得水值溶胀最少平衡时间（h）柱头压力（kPa）(2.5cm 直径柱)肽及球形蛋白质葡聚糖（线性分子）室温沸水浴Sephadex G-1040～ 120～700～7002～ 31.0±0.131Sephadex G-1040～ 120～150015002.5～3.51.5±3.531Sephadex G-25粗级100～300(≈5～100 目)中级50～150(≈100～200 目)1,000～5,000100～5,0004～61.5±0.262细级20～800(≈200～400 目)超细10～40Sephadex G-50粗级100～200中级50～1501,500～500～细级20～8030,00010,0009～115.0±0.362超细10～40Sephadex G-7540～1203,000～1,000～超细10～4070,000950,00012～157.5±0.52433.92～15.86Sephadex G-10040～1204,000～1,000～超细10～401,500,000150,00015～2010.0±1.04852.35～9.41Sephadex G-15040～1205,000～1,000～20～30超细10～40400,000150,00018～2215.0±1.57250.88～3.53Sephadex G-20040～1205000～1000～30～4010～40800,000200,00020～2520.0±2.07250.39～1.572. 聚丙烯酰胺凝胶的技术数 据

型号排阻的下限(分子量)分级分离范围(分子量)膨胀后的床体积(ml/ g 干凝胶)膨胀所需最少时间(室温,h)Bio-gel-P-21,600200～2,0003.82～4Bio-gel-P-43,600500～4,0005.82～4Bio-gel-P-64,6001,000～5,0008.82～4Bio-gel-P-1010,0005,000～17,00012.42～4Bio-gel-P-3030,00020,000～50,00014.910～12Bio-gel-P-6060,00030,000～70,00019.010～12Bio-gel-P-100100,00040,000～100,00019.024Bio-gel-P-150150,00050,000~150,00024.024Bio-gel-P-200200,00080,000～200,00034.048Bio-gel-P-300300,000100～400,00040.0483．琼脂糖凝胶的技术数 据

型号琼脂糖含量%（W/W）排阻的下限（分子量）分级分离的范围（分子量）生产厂家Sepharose 4B40.3×106～3×106PharmaciaSepharose 2B22×106～25×106Sagavac 10102.5×1051×104～2.5×105SeravacSagavac 887×1052.5×104～7×105Sagavac 662×1065×104～2×106Sagavac 4415×1062×105～15×106Sagavac 22150×1065×105～15×107Bio-gel A-0.5M100.5×106<1×104～0.5×106Bio-RadBio-gel A-1.5M81.5×106<1×104～1.5×106Bio-gel A-5M65×1061×104～5×106Bio-gel A-15M415×1064×104～15×106Bio-gel A-50M250×1061×105～50×106Bio-gel A-150M1150×1061×106～150×1064．各处凝胶所允许的最大操作 压

凝胶最大静水压（kPa）SephadexG-109.8G-159.8G-259.8G-509.8G-754.95．琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 分辨范 围

凝胶浓度（%）线性 DNA 长度（bp）0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～20006．染料在变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速 度

凝胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青 FF5．035bp140bp6．026bp106bp8．019bp75bp10．012bp55bp20．08bp28bp7．染料在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速 度

凝胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青 FF3.5100bp460bp5.065bp260bp8.045bp160bp12.020bp70bp15.015bp50bp20.012bp45bp七、氨基酸的特性氨基酸名称三字母缩写单字母缩写质量侧链电离的 pHa 值结构式丙氨酸（alanine）AlaA89.09精氨酸（arginine）ArgR174.212.48天冬酰氨（asparagine）AsnN132.1天冬氨酸（aspartic acid）AspD133.13.86半胱氨酸（systeine）CysC121.12谷氨酰胺（glutamine）GlnQ146.15谷氨酸（glutamic acid）GluE147.134.25甘氨酸（glycine）GlyG75.07组氨酸（histidine）HisH155.166.0异亮氨酸（isoleucine）lleI131.17亮氨酸（leucine）LeuL131.17赖氨酸（lycine）LysK146.19甲硫氨酸（methionine）MetM149.21苯丙氨酸（phenylanaline）PheP165.19脯氨酸（proline）ProP115.13丝氨酸（serine）SerS105.06苏氨酸(threonine)ThrT119.12色氨酸（tryptophan）TrpW204.22酪氨酸（tyrosine）TyrY181.1910.07缬氨酸（valine）ValP117.15八、遗传密码密码子的第二位

密码子的第一位（5’端）UCAG密码子的第三位（3 端’）UUUUPheUCUSerUAUTyrUGUGysUUUCPheUCCSerUACTyrUGGGysCUUALeuUCASerUAA终止（赭石）UGA终止（乳白）AUUGLeuUGGSerUAG终止（琥珀）UGGTrpGCCUULeuCCUProCAUHisCGAArgUCUCLeuCCCProCACHisCGCArgCCUALeuCCAProCAAGlnCGAArgACUGLeuCCGProCAGGlnCGCArgGAAUUIleACUThrAAUAsnAGUSerUAUCIleACCThrAACAsnAGCSerCAUAIleACAThrAAALysAGAArgAAUGMetACGThrAAGLysAGCArgGGGUUValGCUAlaGAUAspGGUGlyUGUCValGCCAlaGACAspGGCGlyCGUAValGCAAlaGAAGluGGAGlyAGUGValGCGAlaGAGGluGGGGlyG九、常用酸碱技术参数1．

溶质分子式分子量mol/Lg/L重量（%）比重配制 mol/ L 溶液的加入量（ml/L）冰乙酸CH3COOH60.0517.40104599.51.05057.5乙酸60.056.27376361.045159.5甲酸HCOOH46.0223.401080901.20042.7盐酸HCl36.5011.60424361.18086.22.90105101.050344.8硝酸HNO363.0215.991008711.42062.514.90938671.40067.113.30837611.37075.2高氯酸HclO3100.5011.651172701.67085.89.20923601.540108.7磷酸H2PO480.0018.101445851.70055.2硫酸H2P`O498.1018.001776961.84055.6氢氧化铵NH4OH35.0014.80251280.89867.6氢氧化钾KOH56.1013.50757501.52074.11.94109101.090515.5氢氧化钠NaOH40.0019.10763501.53052.42.75111101.110363.42．各种浓度的酸碱贮存液的近似 pH 值

溶质1Na0.1Na0.01Na0.001Na乙酸0.402.903.403.90盐酸0.101.072.023.01硫酸0.301.202.10柠檬酸2.102.60氢氧化铵11.8011.3010.8010.30氢氧化钠14.0513.0712.1211.13碳酸氢钠8.40碳酸钠11.5011.00J a.N 为光量浓度[1N≈（1mol/L）×离子价数]。

十、放射性核素数据1．放射性核素衰变 表

3H35S32P125I131I时间(年)剩余活性(%)时间(年)剩余活性(%)时间(年)剩余活性(%)时间(年)剩余活性(%)时间(年)剩余活性(%)194.5298.4195.3495.50.298.3289.3596.1290.8891.20.496.6384.41092.3386.51287.10.695.0479.81588.7482.51683.11.091.8575.42085.3578.52079.41.687.2671.32582.0674.82475.82.381.2767.43178.1771.22872.43.176.7863.73774.5867.83269.14.071.0960.24371.0964.73666.05.065.21056.95067.01061.24063.06.159.31153.85763.61158.74460.27.353.41250.96559.61255.94857.48.150.012.350.07356.01353.25254.88152.51450.75652.487.150.014.350.06050.02. 放射性测定单 位

单位定义换算吸收放射线剂量（拉得 rad）100 尔格 / 克（电离辐射传给单位质量物质的能量）0.87rad=1r伦琴（r）使 1 克空气产生 1.6×1012离子对的 X 或 γ - 射线的照射剂量r/0.87=1rad居里（Ci）每秒放射性衰变 3.7×1010个原子的量1Ci=103mCi=106μCi毫居（mCi）千分之一居里1mCi=10-3Ci=103μCi微居（μCi）百万分之一居里（每分钟衰变 2.2×106次）1μCi=10-6Ci=10-3MCi伯克莱尔（Bq）每秒衰变 1 个原子的量1Bq=3.7×10-10Ci千伯克莱尔（kBq）1kBq=103Bq百万伯克莱尔（MBq）1MBq=106Bq兆伯克莱尔（GBq）1GBq=109Bq每分钟衰变数（dpm）每分钟衰变的原子数2.2×106dpm=1μCi每分钟计数（cpm）测量仪测出每分钟 β 粒子数Cpm=dpm×计数器效率十一、原子量符号原子序数原子量锕（actinium）Ac89227.02铝（aluminium）Al1326.98镅（americium）Am95(243)锑（antimony）Sb51121.75氩（argon）Ar1839.94砷（arsenic）As3374.92砹（astatine）At85(210)钡（barium）Ba56137.33锫（berkelium）Bk97(247)铍（beryllium）Be49.01铋（bismuth）Bi83208.98硼（boron）B510.81溴（bromine）Br3579.90镉（cadmium）Cd48112.41钙（calcium）Ca2040.08锎（californium）Cf98(251)碳（carbon）C612.01铈（cerium）Ce58140.12铯（cesium）Cs55132.90氯（chlorine）Cl1735.45铬（chromium）Cr2451.99钴（cobalt）Co2758.93铜（copper）Cu2963.54锔（curium）Cm96(247)镝（dysprosium）Dy66162.50锿（einsteinium）Es99(252)铒（erbium）Er68167.26铕（euroqium）Eu63151.96镄（fermium）Fm100(257)氟（fluorine）F918.99钫（francium）Fr87(223)钆（gadolinium）Gd64157.52镓（galium）Ga3169.72锗（germanium）Ge3272.59金（gold）Au79196.96铪（hafnium）Hf72178.49氦（helium）He24.00钬（holmium）Ho67164.93氢（hydrogen）H11.00铟（indium）In49114.82碘（iodine）I53126.90铱（iridium）Ir77192.22铁（iron）Fe2655.84氪（krypton）Kr3683.80镧（lanthanum）La57139.90铹（Lawrencium）Lr103(260)铅（lead）Pb82207.2锂（lithium）Li36.94镥（lutetium）Lu71174.96镁（Magnesium）Mg1224.30锰（manganse）Mn2554.93钔（mendelevium）Md101(258)汞（molybdenum）Hg80200.59钼（molybdenum）Mo4295.94钕（neodymium）Nd60144.24氖（neon）Ne1020.17镎（neptunium）Np93237.04镍（nickel）Ni2858.69铌（niobium）Nb4192.00氮（nitrogen）N714.00锘（nobelium）No102(259)锇（osmium）Os76190.2氧（oxygen）O815.99钯（palladium）Pd46106.42磷（phosphorus）P1530.94铂（platium）Pt78195.08钚（piutonium）Pu94(244)钋（polonium）Po84(209)钾（potassium）K1939.09镨（praseodymium）Pr59140.90钜（promethium）Pm61(145)镤（protactinium）Pa91231.03镭（radium）Ra88226.02氡（radon）Rn86(222)铼（rhenium）Re75186.20铑（rhodium）Rh45102.90铷（rubidium）Rb3785.46钌（ruthenium）Ru44101.07钐（samarium）Sm62150.36钪（scandium）Sc2144.95硒（sillicon）Se3478.96硅（sillicon）Si1428.08银（sliver）Ag47107.86钠（sodium）Na1122.98锶（strontium）Sr3887.62硫（sulfur）S1632.06钽（tantalum）Ta73180.94锝（technetium）Tc43(98)碲（tellurium）Te52127.60铽（terbium）Tb65158.92铊（thallium）Tl81204.38钍（thorium）Th90232.03锡（tin）Sn50118.69铥（thulium）Tm69168.93钛（titanium）Ti2247.88钨（tungsten）W74183.85unhilhexium(Unh)106(263)unnilpentium(Unp)105(262)unnilquadium(Unq)104(261)unnilseptium(Uns)107(262)铀（uranium）U92238.02钒（vanadium）V2350.94氙（xenon）Xe54131.29镒（ytterbium）Yb70173.04钇（yttrium）Y3988.90锌（zinc）Zn3065.38锆（zirconium）Zn4091.22圆括号中的数字是该元素最稳定的同位素的质量数。

（吴康）

本书常用缩写词缩写全称中文AAautoantibody自身抗体AAFaminoacetylfluorescence氨乙酰基荧光Abantibody抗体ABCavidin-biotin peroxidase complex抗生物素（亲合素）- 生物素 - 过氧化物酶复合物AChacetycholine乙酰胆碱AChRacetycholine receptor乙酰胆碱受体AChRAbacetycholine receptor antibody乙酰胆碱受体抗体ACIFanti-complement immunofluorescent method抗补体免疫荧光法α-1-ACtalpha(α)-1-anti-chymotrypsinα-1- 抗糜蛋白酶ACTHadrenocorticotropin hormone促肾上腺皮质激素ADAlzheimer’s disease老年性痴呆ADDCantibody dependent cytotoxic cell抗体依赖细胞毒细胞ADHantidiuretic hormone抗利尿激素AEC3-amino-9-ethyl-carbazole3- 氨 -9- 乙基咔唑AFPalpha(α)-fetal-protein甲胎蛋白AHAanti-histone antibody抗组蛋白抗体AKPalkaline phosphatase碱性磷酸酶ALPAlkaline Phosphatase碱性磷酸酶AMAanti-mitochondrial antibody抗线粒体抗体ANAanti-nuclear antibody抗核抗体ANCAanti-neutrophil cytetoplasmic anti-autoantibody抗中性粒细胞胞浆抗自身抗体APUDamine content and /or amine precursor uptake and de-carboxylation含氨和 / 或氨前体并能脱羧的细胞AOAcrine Orange吖啶橙ARsarsanilic acid对氨苯砷酸α-1-ATalpha(α)-1-anti-trypsinα-1- 抗胰蛋白酶BCDFB cell differetiation factor B 细胞分化因子BCGFB cell growth protein B 细胞生长因子BGPbone growth protein骨生长蛋白BGPbrain-gut peptides脑肠肽BMPbone marphogenic protein骨形成蛋白BMZbasement membrane zone基底膜带BRABbridged avidin-biotin technique桥抗生物素 - 生物素技术BrdU5-bromo-2-deoxyuridine5- 溴尿脱氧核苷BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白CAcatecholamine儿茶酚胺CAgcytoplasmic antigen胞质抗原CAHchronic active hepatitis慢性活性性肝炎CALLAcommon acute lymphocytic leukaemia antigen普通急性淋巴细胞性白抗原cAMPcyclic guanosine monophosphate环化 - 磷酸鸟苷CEACarcinoma embryonicantigen癌胚抗原CDIcarbodiimide碳二亚胺CGRPcalcitonin gene-related peptide降钙素基因相关肽CHAccholine acetylase胆碱乙酰化酶ChEcholinesterase乙酰胆碱酯酶CIgcytoplasmic immunoglobulin胞浆免疫球蛋白CKcytokeratin细胞角蛋白CLAcommon leukocyte antigen白细胞共同抗原CMVcytomegalovirus巨细胞病毒CNScentral nervous system中枢神经系统Con.Aconcanavalin A刀豆素 A CPKcreation phosphokinase肌酸磷酸激酶CPMcounts per minute每分钟计数cRNAcomplementary RNA互补 RNACRPc-reation proteinC- 反应蛋白CSFcerebrospinal fluid脑脊液CTCholera toxin霍乱毒素CT-HRPcholera-toxin-horseradish peroxidase霍乱毒素辣根过氧化物酶CUCChronic ulcerous colonitis慢性溃疡性结肠炎CVDcerebrovascular disease脑血管病DAdopamine多巴胺DABdiaminobezidin二氨基联苯氨DBADolichos bifows agglutinin双花扁豆凝集素DBHdopamine-β-hydroxylase多巴胺 - β 羟化酶DEAEdiethyl-amino-ethyl-dextran二乙氨乙基葡聚糖DEPCdiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯DDCdopamine decarboxylase多巴胺脱羧酶Desdesmine结蛋白DIFdirect immunofluorescent method直接免疫荧光法Digdigoxigenin地高辛DMDCdimethydichlorasilane二甲基二氯硅烷DMFdimethyformamide二甲基甲酰胺DMSOdimethyl sulfoxide二甲基亚砜DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸DNPdinitrophenyl aminopropionitrile imide ester二硝基苯氨基丙氰亚酰氨酸酯DRCdendric reticulum cell树突状网状细胞dsDNAdouble stranded DNA双链 DNADTTdithiothreitol二硫苏糖醇DYNdynorphin强啡肽EBVEpistein-Barr virusE- B 病毒ECD-G11-ethyl-3(3-dimethy-aminopropyl)carbodiimide-HCL-Glutaldehyde碳二亚酰胺 - 戊二醛ECMextracellular matrix细胞外基质ED50median effective dose半数有效剂量EDTAethylendiaminotetraacetic acid乙二氨四乙酸EKepidermal keratin表皮角蛋白ELISAenzyme-liked immunosorbent assay酶联免疫吸附分析EMelectron microscope电镜ENKenkephalin脑啡肽L-ENA(L-NK)Leu-enkephalin亮氨酸 - 脑啡肽M-ENK(M-NK)met-enkephalin甲硫氨酸 - 脑啡肽ENSenteric nervous system肠神经系统β-EPβ-endorphinβ- 内啡肽FAformaldehyde甲醛Fabantigen-binding fragment抗原结合片段FACsfluorescent actived cell sortor荧光激活细胞计数器FAVflat agranular vesicle扁平无颗粒囊泡FBfast blue快蓝Fccrystallizable fragment可结晶片段FCCfollicular centre cell滤泡中心细胞FCMflow cytometer流式细胞计数仪FCPfeature count point特征计数点FDAfluorescin diacetate二醋酸酯荧光素■[此处缺少一些内容]■FSHfollicle-stimulating hormone卵泡刺激素FTAfluorescent treponemal antibody荧光梅素螺旋体抗体FTA-ABSfluorescent treponemal antibody absorption test荧光梅毒螺旋体抗体吸收实验GABgold-labelled antibody金标抗体GABAgamma(γ)-amino-butyric acidγ- 氨基丁酸GALTgut –associated lymphoid tissue胃肠道相关淋巴组织GARgoat anti-rabbit serum羊抗兔血清GCAgastrin cell antibody胃泌素细胞抗体GFAPglial fibrillary acidic protein胶质纤维酸性蛋白GFLgreen fluorescence绿色荧光GHgrowth hormone生素激素GLADgold-labelled antigen detection method金标抗原检测法GMAglycol methacrylate乙二醇甲基丙烯酸酯GODglucose oxidase葡萄糖氧化酶GPgold particle金颗粒HAVhepatitis A virus甲型肝炎病毒HBVhepatitis B virus乙型肝炎病毒HBV-DNAhepatitis B virus DNA乙型肝炎病毒 DNAHCHuntington’s chorea亨廷顿氏舞蹈症HCGhuman chorionic gonadotropin人绒毛膜促性腺激素HEhemotoxylin and eosin staining苏木精 - 伊红染色HEMA2-hydroxyethyl methacrylate羟乙基甲基丙烯酸酯HGHhuman growth factor人生长激素5-HIAA5-hydroxyindoleacetic acid5- 羟吲哚乙酸HLAhuman leukocyte antigen人类白细胞抗原HMAhepatocyte membrane antibody肝细胞膜抗体HPhorizontal plate水平面HPLhuman placenta lactogen人胎盘催乳素HPRIhuman placental ribonuclease inhibitor人胎盘核糖核酸抑止剂HRPhorseradish peroxidase辣根过氧化物酶HSAhuman sreum albumin人血清白蛋白5-HT5-hydroxytryptamine(serotonin)5- 羟色氨HTLVhuman T-lymphocyte virus人 T - 淋巴细胞病毒LCAbislet cell antibody胰岛细胞抗体ICAMintercellular adhersion molecule细胞间粘附因子ICCimmunocytochemistry免疫细胞学IDDinsulin dependent diabetes胰岛素依赖性糖尿病IDRC(IRC)interdigitate reticulum cell指突状网状细胞IELintraepithelial lymphocyte上皮内淋巴细胞IFintermediate filament中间丝Igimmunoglobulin免疫球蛋白IGSimmunogold staining免疫金染色IGSSimmunogold –silver staining免疫金 - 银染色IHCimmunohistochemistry免疫组织化学IIFindirect immnnofluotesent method间接免疫荧光法IRIAindirect radioimmunoassay间接放射免疫分析LABlabelled avidin-biotin technique标记抗生物素（亲合素）- 生物素技术LBTLupus Band Test狼疮带实验LCLangerhan’s cell朗格罕氏细胞LCALens culinaris agglutinin扁豆凝集素LCRligose chain reaction连接链式反应LDHlactate dehydrogenase乳酸脱氢酶LFAleukcyte function- associated antigen白细胞功能相关抗原LGVlarge granular vesicle有颗粒大囊泡LHluteinizing hormone黄体生成素LHRHluteinizing hormone relasing hormone黄体生成素释放激素LHRFluteinizing hormone relasing factor黄体生成素释放因子β-LPHβ-lipotropic hormoneβ- 促脂素LPLlamina propria T lymphcyte固有层 T 淋巴细胞LPOlactiperoxidase乳过氧化物酶MAGmyelin associated glycoprotein髓鞘相关糖蛋白MGmyasthenia gravis重症肌无力β-MGβ-microglobinβ- 微球蛋白MBPmyelic basic protein髓磷酯碱性蛋白MBPAbmyelic basic protein antibody髓磷酯碱性蛋白抗体McABmonoclonal antibody单克隆抗体MFmicrofilament微丝Mgmyohemoglobin肌红蛋白MHCman histocompatibility complex人类组织相溶性复合物mRNAmessenger ribonucleic acid信使核糖核酸MSmultiple sclerosis多发性硬化症MSHmelanocyte stimulating hormone黑色素细胞刺激素MsIgmembrane superfacial immuno-globulin膜表面免疫球蛋白NAnoradrenalin去甲肾上腺素NAChRnicotinic acetylcholine receptor烟碱型乙酰胆碱受体NADHnicotinamide adenine dinucleotide diaphorase尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶NANCnon-adrenergic-non-cholinergic非肾上腺素能非胆碱能NEnorepinephrine去甲肾上腺素NFneurofilament神经丝NKnatural killer自然杀伤细胞NNEnon-neuronal enolase非神经元性烯醇化酶NPneuropeptide神经肽NPYneuropeptide Y神经肽 Y NSEneuron-specific enolase神经元特异性烯醇化酶NTneurotensin神经降压肽ODoptical density光密度6-OHDA6-hydroxydopamine6- 羟多巴胺ORFopen reading frame开放读框ORToptimum renaturation temperature最适复性温度OToxytocin催产素PAGprotein A-gold technique蛋白 A - 金技术PAPperbxidase anti-peroxidase complex过氧化物酶 - 抗氧化物酶复合物PBphosphate buffer磷酸缓冲液PBSphosphate buffered saline磷酸盐缓冲液PCAgastric parietal cell antibody胃壁细胞抗体PcAbpolyclonal antibody多克隆抗体PCRpolymerase chain reaction聚合酶链反应PDParkinson’s disease帕金森氏症（震颤麻痹）PEGpolyethylene glycol聚乙二醇PFAparaformaldehyde多聚甲醛PGprostaglandin前列腺素pHsymbol for expression of hydrogenion cincentration表示氢离子浓度的符号PHAphaseolus vulgaris agglutinin菜豆凝集素PHAphytohemagglutinin植物凝集素PHSApoly human serium antigen多聚人血清蛋白pIpropidium Iodide磺化吡啶PLLpoly-L-Lysine（左旋）多聚赖氨酸PLPparaformaldehyde-lysine peroxidase多聚甲醛 - 赖氨酸 - 过磺酸盐混合固定剂PNApeanut agglutinin花生凝集素POMproopiomelanocortin前促黑激素PPplacenta protein胎盘蛋白PPpancreas polypeptide胰多肽PRprogesteron receptor孕激素受体PSAPisum sativum agglutinin豌豆凝集素PSSprogressive systemic sclerosis进行性全身性硬化PVPpolyvinypyrolidone聚乙烯吡咯烷酮PB200rhodamin B200诺丹明 B200RCARicinus communis agglutinin蓖麻凝集素RFLred fluorescence红色荧光RHreactive hyperplasia反应性增生RIARadioimmunoasay放射免疫分析RIA-CPBRIA-competitive protein binding放免 - 竞争性蛋白结合RANArheumatoid anti-nuclea antigen类风湿性关节 炎抗核抗原RPGNrapid progressive nephritis进行性肾小管肾炎RPMrolls per minute每分钟转速RRAradioreceptoassay放射受体分析RT-PCRreverse transiption-PCR反转录 -PCRRSArabbit serum albumin兔血清白蛋白R-ScReed-Sternberg’s cell瑞 - 司氏细胞Z/RReinheit Zahl光密度比值SAVsmall agranular vesicle无颗粒小泡SBAsoybean agglutinin大豆凝集素SCsecretory component分泌成份SCVsmall clear vesicle清亮小泡SDSsodium decdecyl sulfate十二烷基硫酸钠SGVsamll granular vesicle有颗粒小泡SIgsecretory immunoglobulin分泌型免疫球蛋白SISskin immunosystem皮肤免疫系统SJASophora japonica agglutinin槐凝集素SLEsystemic lupus erythematosus全身性红斑狼疮SMAsmooth muscle Ab平滑肌抗体SNsmall nuclea小核SMAsmooth muscle antibody平滑肌抗体S/Nsignal/noise(ratio)信 / 噪（比）SOMsomatostatin生长抑素SPsilver particle银颗粒SPsubstance P P 物质SPAstaphylococal protein A金黄色葡萄球菌蛋白 A SSPEsubacute sclerosing nencephalitis亚急性硬化性脊脑炎TAStranscription based amplification system转录依赖扩增系统TBSTris bufferred salineTris 缓冲生理盐水TETrypanosona Equiperdum马疫锥虫β-TGβ-thromboglobulinβ- 血栓蛋白TGthyroid globulin甲状腺球蛋白TGFtransforming growth factor转化生长因子THtyrosine hydroxylase酪氨酸羟化酶TMBtetramethylbenzidine四甲基联苯氨TRHthyrotropin releasing hormone促甲状腺素释放素T(M)RITCtetramethylrhodamine –isothiocyanate异硫氰酸四甲基诺丹明TSHthyroxin stimulating hormone促甲状激素UEAUlex Europaeus agglutinin荆豆凝集素Vimvimentin波纹蛋白VIPvasoactive intestinal polypeptide血管活性肠肽VPVertical plane垂直面WGAwheat germ agglutinin麦胚凝集素